Artículo Original

  

http://opn.to/a/iBXi6

Detección de infección mixta de ‘Candidatus phytoplasma sp.’ y begomovirus afectando el cultivo de la soya en la región oriental de Cuba

Detection of mixed infection of ‘Candidatus phytoplasma sp.’ and begomoviruses sp affecting soybean crop in the eastern region of Cuba


RESUMEN

El objetivo del presente trabajo fue detectar la presencia de infecciones mixtas de fitoplasmas y begomovirus asociados a plantas de soya sintomáticas, colectadas en áreas de producción de la región oriental de Cuba. Se recolectaron 545 de muestras foliares del cultivar Incasoy 27, de 11 localidades productoras, con síntomas asociados a fitoplasmas y begomovirus. Las muestras se evaluaron mediante nPCR para detectar la presencia de fitoplasmas y por ACR/RFLP para determinar la infección por begomovirus. La evaluación mediante nPCR mostró la presencia de fitoplasmas en 39,45 % en el total de muestras recolectadas. El análisis por ACR/RFLP mostró que 47,88 % de estas plantas estaba infectado por begomovirus. Se determinó la presencia de infecciones mixtas en el cultivo en 15,96 % de las muestras. Las infecciones por ambos patógenos, tanto en forma simple como mixta, se presentaron en todas las provincias del país. Las provincias Holguín y Las Tunas mostraron los mayores porcentajes de infección. El estudio demostró que la variabilidad de síntomas asociados a la presencia de fitoplasmas y begomovirus e infecciones mixtas entre ambos no permitió establecer una relación específica entre síntomas y patógenos, por lo que se requiere el uso de otras herramientas de diagnóstico que permitan confirmar de forma específica la presencia de estos. A nuestro conocimiento, este resultado constituye el primer informe de la detección de infecciones mixtas de fitoplasmas y begomovirus en el cultivo de la soya en Cuba.

Palabras clave: 

begomovirus; fitoplasmas; nPCR; ACR; RFLP.

ABSTRACT

The objective of the work was to detect the presence of mixed infections of phytoplasmas and begomoviruses associated with symptomatic soybean plants collected in production areas of the eastern region of Cuba. A total of 545 foliar samples of the cultivar Incasoy 27 with symptoms associated with phytoplasmas and begomoviruses were taken from 11 soybean producing localities. The samples were evaluated by nPCR to detect the presence of phytoplasmas and by RCA / RFLP to determine infection by begomoviruses. The evaluation by nPCR showed the presence of phytoplasmas in 39.45 % of the total samples collected. The analysis by RCA / RFLP showed that 47.88 % of these plants were infected by begomoviruses. The presence of mixed infections in the crop was determined in 15.96 % of the samples. Infections by both pathogens, both single and mixed, occurred in all the provinces of the country, where Holguín and Las Tunas provinces showed the highest percentages of infection. The study showed that the variability of symptoms associated with the presence of phytoplasmas and begomoviruses and mixed infections by both did not allow establishing specific relationships between symptoms and pathogens, being required the use of other diagnostic tools to confirm their specific presence. To our knowledge, this is the first report of the presence of mixed infections by begomoviruses and phytoplasmas in the soybean crop in Cuba.

Key words: 

begomoviruses; phytoplasmas; nPCR; RCA; RFLP.


INTRODUCCIÓN

La soya (Glycine max (L), Merril) es la oleaginosa que más se produce y consume en el mundo (1) debido, fundamentalmente, a que constituye una importante fuente de aceite vegetal y de proteínas para alimento animal (2). A este cultivo se dedican más de cien millones de hectáreas a nivel mundial (3). En Cuba se destinan al cultivo alrededor de 3 000 hectáreas y existe la intención, por parte del gobierno, de incrementar las áreas de producción para su uso en la elaboración de concentrados para la alimentación animal (4).

El cultivo de soya es afectado por una amplia gama de fitopatógenos, lo que es favorecido por su amplia distribución en el mundo. En la primera década de este siglo se informaron pérdidas por enfermedades entre el 15-25 % de las producciones y en algunos casos hasta el 100 % (5).

Entre los problemas fitopatológicos que afectan la soya se encuentran las enfermedades de etiología viral y procarióticas (6,7). Dentro de los procariotes, los fitoplasmas se consideran uno de los principales patógenos que afectan cultivos de importancia económica (7,8); entre las enfermedades de etiología viral, los begomovirus se sitúan como uno de los patógenos de mayor relevancia para los sistemas productivos del mundo, fundamentalmente en regiones tropicales y subtropicales (9,10,11), donde afectan la productividad de los cultivos y ocasionan pérdidas económicas de alto valor. En Cuba se notificó la detección de begomovirus y fitoplasmas en el cultivo de soya (9,12,13).

En los últimos años, diversos informes abordan la presencia de infecciones mixtas entre patógenos de diferentes etiologías y cepas de un mismo patógeno, como los relacionados con infecciones concomitantes entre fitoplasmas y begomovirus (14,15). La aparición de infección mixta puede aumentar la gravedad de la enfermedad y la pérdida de rendimiento, en comparación con las de una sola infección.

En Cuba, se informó la coexistencia de begomovirus y otros géneros virales, infectando cultivos de tomate (Solanum lycopersicum L.) (16) y pimiento (Capsicum annuum L.) (17), así como de fitoplasmas con potyvirus y rickettsias en papaya (Carica papaya L.) (18,19); sin embargo, no se conoce de la concomitancia de los begomovirus y los fitoplasmas en el cultivo de la soya.

Teniendo en cuenta estos antecedentes y la manifestación de síntomas diversos observados en el cultivo, el objetivo de este estudio fue detectar la presencia de infecciones mixtas de fitoplasmas y begomovirus asociados a plantas de soya sintomáticas, colectadas en áreas de producción de la región oriental de Cuba.

MATERIALES Y MÉTODOS

Detección de fitoplasmas y begomovirus asociados a plantas sintomáticas en cultivos de soya en la región oriental de Cuba

Prospección de muestras con síntomas

Se muestrearon plantaciones del cultivar Incasoy 27, en 11 localidades de las cinco provincias orientales (Las Tunas, Holguín, Granma, Santiago de Cuba y Guantánamo) (Tabla 1). Se recolectaron 545 muestras foliares de plantas de soya, con síntomas similares a los descritos para una infección por fitoplasmas y begomovirus. Los muestreos se realizaron utilizando el método de bandera inglesa (20).

Tabla 1. 

Localidades visitadas y número de muestras foliares de plantas de soya sintomáticas, colectadas en las diferentes localidades de las provincias de la región oriental de Cuba / Visited localities and number of foliar samples of soybean plants collected in the different localities of the provinces of the eastern region of Cuba

ProvinciaLocalidadUbicación georeferenciadaMuestras colectadas
HolguínVelasco21°05′09″N; 76°21′00″O100
Uñas21°05′09″N 76°21′00″O100
Holguín20°53′18″N; 76°15′21″O50
San Mateo21°05′09″N 76°21′00″O40
Las TunasPuerto Padre21°11′42″N; 76°36′6″O40
Jesús Menéndez21°09′48″N 76°28′39″O70
GranmaVado del Yeso20°33′50″N; 76°55′2″O20
Palmarito20°33′44″N; 76°28′10″O30
Santiago de CubaSan Luis20°11′17″N; 75°50′55″O45
18 de Mella20°22′10″N; 75°54′39″O20
GuantánamoLas Marías20°08′13″N; 75°12′50″O30
Total11 545

Detección molecular de fitoplasmas y begomovirus

Detección de fitoplasmas mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa Anidada (por sus siglas en inglés, nPCR)

La extracción de ácidos nucleicos totales (ADNt), a partir de las muestras recolectadas, se realizó por el método descrito que utiliza la solución tamponada CTAB 3 % (21). Para la detección de los fitoplasmas por nPCR se empleó la combinación de los cebadores universales R16mF2 (5’-CATGCAAGTCGAACGGA-3’) y R16mR1 (5’-CATGCAAGTC GAACGGA-3’) en la primera amplificación y, para la segunda reacción o reacción anidada, R16F2n (5’-GAACGGCGGTGTGTACAAACCC-3’) / R16R2 (5’-TGACGGGCGGTGTGT ACACCCG-3’) (22).

Como control positivo de la técnica se utilizó un ADN total de una planta de frijol positiva a fitoplasmas y, como control negativo, ADN total de una planta sana de soya.

Para la primera reacción se preparó una mezcla con 12,5 µl de una solución que contiene la enzima Gotaq Colorless Master Mix (Promega), cebadores (10 µM), ADNt (100 ng/µl), para un volumen final de reacción de 25 µl.

En la reacción anidada se utilizó la mezcla descrita previamente para la primera reacción y se adicionó 1 µl del producto resultante de la primera reacción, previamente diluido (1:30), para un volumen final de 25 µl. Para ambas amplificaciones se usó un termociclador programable (eppendorf Mastercycler gradient). Los perfiles térmicos utilizados en los programas de amplificación para ambas reacciones se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. 

Perfiles térmicos para la nPCR, utilizados en la detección genérica de fitoplasmas / Thermal profiles for nPCR used in the generic detection of phytoplasmas.

CebadoresDesnaturalización inicial35 ciclos Extensión final
DesnaturalizaciónAlineamientoExtensión
R16mF2940C/120 s940C/ 60 s600C/120 s720C/180 s720C/10 min
R16mR1
R16F2n950C/240 s950C/60 s550C/60 s720C/120 s720C/10 min
R16R2

Los productos de la PCR (10 μl) se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %, en tampón TBE 1X en cámara de electroforesis durante 45 minutos a 70 voltios, teñido con 1,0 µg. ml-1 de bromuro de etidio, de acuerdo al procedimiento descrito (23), y se observaron bajo un transiluminador de luz ultravioleta (UV) Syngene InGenius L (Syngene, EE.UU).

Para determinar la talla aproximada de los productos, se incluyó un marcador de peso molecular de 1000 pb (Promega). Todos aquellos fragmentos amplificados, que mostraron una banda de 1250 pb y que coincidieron para lo obtenido para el control positivo utilizado, se consideraron positivos a fitoplasmas.

Detección de begomovirus mediante la combinación de los métodos de Amplificación en Círculo Rodante (ACR) y de Polimorfismo de los Fragmentos de Restricción (de sus siglas en inglés, RCA/RFLP)

El ADNt de las muestras se sometió a amplificación por la ACR (24), con la utilización de la enzima φ29 ADN polimerasa, para la amplificación de los genomas completos de los begomovirus presentes en las muestras. Para esto se utilizó el juego de reactivos TempliPhi TM 100 Amplification kit (GE Healthcare, UK), según las instrucciones descritas por la casa comercial.

Para cada muestra se analizaron 4 µl de los productos obtenidos mediante una electroforesis en un gel de agarosa al 1 % en tampón TBE 1X y se observaron bajo un transiluminador, de acuerdo a lo descrito anteriormente. De las muestras positivas (muestras que amplificaron una única banda de alto peso molecular ≈12000 pb), se sometieron 2 µl a digestión con la enzima de restricción MspI (Promega). Para determinar la talla aproximada de los productos se incluyó un marcador de peso molecular de 1000 pb (Promega). Como criterio de positividad se adoptó un valor igual o mayor a 2600 pb por la suma de las bandas visualizadas.

Para determinar las posibles infecciones mixtas de fitoplasmas y begomovirus presentes en las plantaciones de soya muestreadas, se determinó la coexistencia de ambos, mediante el agrupamiento de las muestras que resultaron positivas a los dos patógenos; estos datos se sometieron a análisis estadísticos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Detección de fitoplasmas y begomovirus asociados a plantas sintomáticas en cultivos de soya en la región oriental de Cuba

Las plantas recolectadas mostraron la presencia de síntomas diversos, entre estos enanismo, clorosis, amarillamiento de las hojas, ampollamiento, reverdecimiento de las ampollas, arrugamiento, reducción del tamaño de las hojas jóvenes, aborto floral y de vainas, proliferación de brotes y mosaico (Fig. 1); síntomas que coinciden con los descritos anteriormente para las infecciones ocasionadas por fitoplasmas en el cultivo de soya en Cuba (13) y en otros cultivos en los que se detectó su presencia (27,28). De igual forma, muchos de estos síntomas se asociaron a la presencia de begomovirus en cultivos de soya del país (9,12).

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Figura 1. 

Síntomas de enanismo, aborto floral y de vainas, proliferación de brotes, mosaico severo, reducción del tamaño de las hojas jóvenes, ampollamiento, reverdecimiento de las ampollas, arrugamiento, amarillamiento de las hojas, enanismo observados en las plantas de soya colectadas en este estudio/ Symptoms of dwarfism, flower and pod abortion, shoot proliferation, severe mosaic, size reduction of young leaves, blistering, greening of blisters, wrinkling, leaf yellowing, and dwarfism observed on the soybean plants collected in this study.

En todas las plantaciones muestreadas se observó la presencia de Saltahojas (Empoasca sp.), insectos de la familia Cicadelidae, informados como vectores de fitoplasmas (29). También se observó la presencia de moscas blancas (Bemisia tabaci Genn.), notificada como vector para la transmisión de begomovirus en diferentes cultivos (30).

Las plantas prospectadas presentaron sintomatologías complejas que pueden estar asociadas a la presencia, en forma de infección simple o mixta, de fitoplasmas y begomovirus. Esta coincidencia de síntomas sugirió la necesidad de obtener confirmación de la presencia de ambos patógenos con el uso de métodos de detección de los ácidos nucleicos de mayor especificidad y confiabilidad.

Detección de fitoplasmas mediante nPCR

La amplificación de un fragmento de 1250 pb, correspondiente a la región 16S ADNr en la reacción anidada para la detección de fitoplasmas, mostró la presencia de este patógeno en el 39,45 % del total de muestras recolectadas. La banda amplificada coincide con los resultados obtenidos para el control positivo utilizado en el ensayo (Fig. 2). El control negativo no presentó amplificación.

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Figura 2. 

Resultados del análisis electroforético en un gel de agarosa al 0,8 % que muestra la detección de fitoplasmas. M: Marcador de peso molecular (1 Kb DNA plus ladder); línea 1: control negativo; líneas: 2, 3, 4, 5, 6 muestras de plantas de soya y 7 control positivo a fitoplasmas/ Results of the electrophoretic analysis on 0.8% agarose gel that shows the detection of phytoplasmas. M: Molecular weight marker (1 Kb DNA plus ladder); lane 1: negative control;lanes 2, 3, 4, 5, 6: samples of soybean plants, and lane 7: control positive to phytoplasmas

La presencia de este porcentaje de plantas positivas en el total de muestras sugiere que la emergencia de los fitoplasmas, como agentes patogénicos en el cultivo de la soya, es un elemento a considerar en las políticas de incremento de las áreas productivas dedicadas al cultivo de la soya en Cuba. Por otra parte, la tolerancia a estos patógenos debe constituir una característica a tener en cuenta en los nuevos cultivares que se generen o introduzcan en el país, así como en la selección de materiales promisorios del programa de mejoramiento genético del cultivo.

Detección de begomovirus por ACR/RFLP

Del total de muestras evaluadas, 261 resultaron positivas a begomovirus mediante ACR/RFLP (Fig. 3), lo que representa el 47,88 % del total. La ACR, combinada con RFLP, permitió la detección de begomovirus en muestras de plantas de soya con síntomas típicos asociados a estos patógenos, por lo que este resultado confirma la utilidad de esta metodología para estudios de identificación de begomovirus, aspecto que ha sido informado por diversos autores (12,24).

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Figura 3. 

Resultados de la electroforesis en un gel de agarosa al 1 %, que muestra los perfiles de corte producidos por las digestiones de los productos de ACR con el enzima MspI. MPM: marcador de peso molecular (1kb DNA plus ladder); Líneas de 1-8: productos de ACR digeridos con la endonucleasa MspI/ Results of the electrophoresis on 1 % agarose gel that shows the cut profiles produced by the digestions of the RCA products with the MspI enzyme. MPM: molecular weight marker (1kb DNA plus ladder); Lanes 1-8: RCA products digested with the endonuclease MspI

Detección de infecciones mixtas de fitoplasmas y begomovirus en el cultivo de la soya en la región oriental de Cuba

Los resultados obtenidos en la nPCR y la ACR/RFLP revelaron que en 87 muestras evaluadas se encontraron coexistiendo ambos patógenos, lo que representa el 15,96 % del total (Tabla 3); aun cuando el porcentaje de plantas positivas a los dos patógenos resultó bajo comparado con lo obtenido para la detección simple de ambos. Esto es un elemento de importancia a considerar en el programa de manejo del cultivo para la selección de una estrategia eficaz que permita el control de estas entidades.

Tabla 3. 

Proporción de plantas positivas a infección simple con fitoplasmas y begomovirus e infecciones mixtas, detectadas en las muestras de soya (G. max) analizadas en cada provincia de la región oriental de Cuba / Proportion of plants positive to single infection by phytoplasmas and begomoviruses, and positive to mixed infection by both pathogens detected in the anlyzed soybean samples from each province of the Cuban eastern region.

ProvinciasMuestras positivas a fitoplasmas Muestras positivas a begomovirus Muestras positivas a begomovirus y fitoplasmas
nmuestras positivasnmuestras positivasnmuestras positivas
Holguín13345,86 a15152,06 ab6321,72 a
Las Tunas4440,00 ab5852,72 a1614,54 ab
Granma1530,00 bc2040,00 abc510 bc
Santiago de Cuba1726,15 bc 2538,46 ac23,07 c
Guantánamo620,00 c 723,33 c13,33 c
Total21539,4526147,888715,96

Valores con letras diferentes difieren significativamente para p<0,05

Se determinó la presencia de infecciones mixtas, entre ambos patógenos, en todas las provincias de la región oriental de Cuba. La provincia que mostró mayor presencia de ambas entidades fue Holguín, sin diferencias significativas con lo obtenido en Las Tunas; con diferencias con los valores exhibidos por las provincias Granma, Santiago de Cuba y Guantánamo, respectivamente, que mostraron menor proporción de plantas positivas. (Tabla 3)

Diversos informes, relacionados con la coexistencia de begomovirus y fitoplasmas, fueron recogidos en la literatura. En el cultivo de la soya se notificó la coexistencia de ambos patógenos en la India (31) y la infección mixta de Tomato leaf curl New Delhi virus con fitoplasmas en tomate con incidencias de 1,2 a 7,2 % (32). En México se informó la infección del grupo 16SrIII de fitoplasma con el begomovirus Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) y el Tomato Chino la Paz virus (ToChLPV) e infecciones mixtas en el cultivo del pimiento (33).

La asociación de virus fitopatógenos y fitoplasmas se informó, de manera común, en una amplia gama de especies de plantas (31,33); lo que sugiere que fitoplasmas y virus pueden coexistir, de manera natural, en diferentes hospedantes y reafirma la hipótesis de que es frecuente la existencia de relaciones entre los factores bióticos y abióticos en los agroecosistemas que favorecen el desarrollo de enfermedades complejas, donde la actividad de un patógeno puede ser favorecida por la presencia de otro (34).

El análisis de componentes principales (Tabla 4) mostró que los componentes 1 y 2 explican el 57,7 % de las relaciones que se establecen entre los fitoplasmas, los begomovirus e infecciones mixtas entre ambos, y los síntomas observados en las localidades visitadas. Este resultado demostró, con una confiabilidad de 74,5 %, que la presencia de mosaico, ampollamiento, arrugamiento, enanismo, clorosis y mosaico severo son los síntomas más significativos para asociarlos con uno u otro patógeno.

Tabla 4. 

Resultados de Análisis de Componentes Principales sobre la base de la sintomatología observada en las plantas donde se detectó la presencia de begomovirus, fitoplasmas y las infecciones mixtas entre estos / Results of the Principal Component Analysis based on the symptomatology observed on the plants where the presence of begomoviruses, phytoplasmas and their mixed infections were detected

VariableCP1CP2
Mosaico 0,010,98
Ampollamiento 0,970,12
Reverdecimiento de las ampollas0,320,31
Enanismo-0,820,27
Proliferación de brotes0,090,49
Clorosis-0,72-0,46
Arrugamiento-0,96-0,09
Mosaico severo0,53-0,72
Amarillamiento0,080,28
Aborto floral y de vainas-0,50-0,15
Reducción del tamaño de las hojas-0,530,35
Varianza explicada36,321,4
Varianza acumulada36,357,7

Correlación cofenética= 0,754

Este resultado confirma la variabilidad de síntomas que están asociados a la presencia de fitoplasmas y begomovirus e infecciones mixtas entre ambos, en el cultivo de la soya en la región oriental de Cuba y no permite establecer una relación específica entre síntomas y patógenos. (Fig. 4)

De acuerdo a este análisis, los fitoplasmas se relacionan con síntomas de enanismo, clorosis, amarillamiento, reducción del tamaño de las hojas jóvenes, aborto floral y de vainas, proliferación de brotes y mosaico severo; mientras que, los begomovirus se asocian a síntomas de síntomas de mosaico, ampollamiento, reverdecimiento de las ampollas, arrugamiento, amarillamiento de las hojas, enanismo, aborto floral y reducción del tamaño de las hojas jóvenes. Por su parte, las infecciones mixtas entre ambos patógenos se encontraron asociadas a síntomas de mosaico, amarillamiento y ampollamiento de las hojas, enanismo, arrugamiento, aborto floral y de vainas, así como reducción del tamaño de las hojas jóvenes.

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Figura 4. 

Gráfico tipo biplot que muestra el agrupamiento de los fitoplasmas, los begomovirus y las infecciones mixtas de acuerdo a la relación entre síntomas prospectados y resultados de componentes principales/ Biplot-type graph showing the grouping of phytoplasmas, begomoviruses, and mixed infections according to the relationship between prospected symptoms and results of main components.

Los síntomas como clorosis, malformaciones foliares, reducción de las hojas apicales, decoloración y lesiones necróticas en las hojas adultas, entrenudos cortos, aborto floral y reducción del tamaño y calidad de los frutos, se asociaron a la presencia de infecciones mixtas de fitoplasmas y begomovirus; y se informaron para la infección concomitante entre estos patógenos en cultivos de tomate y pimiento (33).

De igual modo, los síntomas que se relacionaron para los fitoplasmas en este estudio coinciden con síntomas informados por otros autores (27,28), quienes plantearon que los fitoplasmas ocasionan esterilidad en las flores, proliferación de brotes axilares, elongación anormal de los entrenudos o enanismo y atrofia generalizada de los órganos vegetativos.

Por otra parte, los síntomas relacionados con los begomovirus detectados son típicos de las infecciones por begomovirus en soya y se han descrito como mosaico amarillo en las hojas, puntos cloróticos en las hojas, mosaico dorado y amarillo, moteado clorótico, ampollamiento, distorsión de las hojas y enanismo, así como la presencia de mosaico dorado y amarillo, moteado clorótico, distorsión de las hojas y enanismo (35).

Los resultados confirmaron que los síntomas observados en campo no permiten establecer un diagnóstico confirmativo y preciso de estos agentes etiológicos, ya que muchos de ellos coinciden cuando coexisten ambos patógenos en la misma planta.

La presencia de enfermedades de etiología compleja, causadas por la aparición de infecciones mixtas, empeora la gravedad de la enfermedad, lo que trae consigo la pérdida de mayor rendimiento al compararlo con la que ocasiona una infección simple. Por lo tanto, las interacciones sinérgicas entre fitoplasmas y begomovirus deben estudiarse en detalle a modo de fortalecer los programas de manejo de los cultivos. Esta investigación constituye el primer informe de la presencia de infecciones mixtas de begomovirus y fitoplasmas en el cultivo de la soya en el país.

AGRADECIMIENTOS

Los autores del trabajo quieren agradecer a la Dra. Ileana Miranda Cabrera por la colaboración en la realización de los análisis estadísticos. A los Doctores Mayra G. Rodríguez, Belkis Peteira y Eduardo Sistachs por la revisión y criterios oportunos del documento.

 

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Los autores de este trabajo declaran no presentar conflicto de intereses.

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