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Ensayo de PCR en tiempo real basado en SYBR-Green I para la detección de herpesvirus bovino tipo 1

SYBR Green I Based Real-Time RT-PCR assay for the detection of bovine herpesvirus type 1


RESUMEN

El herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) infecta los tractos respiratorio y genital del ganado bovino y varias especies de rumiantes. La infección puede resultar en diferentes enfermedades como rinotraqueitis infecciosa bovina, vulvovaginitis pustular infecciosa en hembras y balanopostitis pustular infecciosa en machos, con un severo impacto económico en la producción ganadera. La infección produce diferentes cuadros clínicos como respiratorios, conjuntivitis, abortos, enteritis e infección sistémica fatal en terneros recién nacidos. Una de las características más importante del herpesvirus bovino tipo 1 es el establecimiento de una infección latente que puede ser reactivada bajo condiciones de estrés o por tratamientos con altas dosis de corticosteroides. El presente trabajo tuvo como objetivo el desarrollo de un ensayo de PCR en tiempo real basado en SYBR-Green I para la detección de herpesvirus bovino 1, mediante la amplificación de un fragmento del gen de la timidina quinasa viral. Se establecieron los parámetros de los componentes críticos de la reacción de PCR, así como de las condiciones termodinámicas. Mediante el análisis de la curva de disociación se verificó que las curvas de amplificación fueron específicas (Tm = 93°C ± 1°C) y que no hubo amplificaciones inespecíficas. Se obtuvieron altos niveles de especificidad, repetibilidad y sensibilidad, con un límite de detección de 100.5 DICT50/mL. Se evaluó la sensibilidad diagnóstica a partir de exudados nasales procedentes de animales de una reproducción experimental, de reactivación de la infección latente y de vaquerías experimentales. El ensayo de PCR en tiempo real con SYBR-Green I demostró ser más sensible para el diagnóstico de BoHV-1, que el ensayo de PCR en punto final y el aislamiento viral.

Palabras clave: 

herpesvirus bovino tipo 1; PCR en tiempo real; SYBR-Green I.

ABSTRACT

Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) infects the respiratory and genital tracts of cattle and several species of ruminants. The infection can result in different diseases such as infectious bovine rhinotracheitis, infectious pustular vulvovaginitis in females and infectious pustular balanoposthitis in males, with a severe economic impact on livestock production. The infection causes respiratory symptoms, conjunctivitis, abortions, enteritis, and fatal systemic infection in newborn calves. One of the most important characteristics of bovine herpesvirus type 1 is the establishment of a latent infection that can be reactivated under stress conditions or by treatment with high doses of corticosteroids. The present work was aimed at developing an SYBR Green I Based Real-Time RT-PCR assay for the detection of bovine herpesvirus type 1, by amplifying a fragment of the viral thymidine kinase gene. The parameters of the critical components of the PCR reaction as well as the thermodynamic conditions were established. Dissociation curve analysis showed that the amplification curves were specific (Tm = 93°C ± 1°C) and that there were no unspecific amplifications. High levels of specificity, repeatability and sensitivity were obtained, with a detection limit of 100.5 TCID50/mL. Diagnostic sensitivity was assessed on the basis of nasal exudates from experimental breeding animals, reactivation of latent infection and experimental dairy farms. The SYBR Green I Based Real-Time RT-PCR assay proved to be more sensitive for the diagnosis of BoHV-1 than the endpoint PCR assay and virus isolation.

Key words: 

bovine herpesvirus type 1; real-time PCR; SYBR-Green I.


El control de las enfermedades infecciosas, que provocan pérdidas devastadoras en las especies animales de interés económico, constituye uno de los principales objetivos de los servicios veterinarios internacionales para garantizar la seguridad alimentaria (1). En este sentido, el diagnóstico rápido y confiable de los patógenos involucrados es un elemento de gran importancia.

En el ganado bovino ocurren infecciones virales que afectan el desempeño productivo de esta especie (2). En Cuba, entre los virus de mayor incidencia se encuentra el BoHV-1, que es uno de los patógenos más importantes que afecta los sistemas respiratorio y reproductivo de los bovinos, independientemente de la raza y la edad (3,4), con una incidencia negativa en los costos de producción de carne y leche y provoca bajas tasas de fertilidad a consecuencia de los altos índices de abortos (5,6).

El BoHV-1 afecta al bovino y provoca la rinotraqueitis infecciosa bovina (IBR), enfermedad respiratoria caracterizada por rinitis, traqueitis y fiebre, así como la vulvovaginitis/balanopostitis pustular infecciosa (IVP/IBP) que provoca enfermedades en el tracto reproductivo (7).

Este virus se aisló por primera vez en Cuba de terneros con infección respiratoria (8); posteriormente se aisló de vacas con endometritis (9), de fetos abortados (10,11), de lavados prepuciales de toros con infección subclínica (12) y de muestras de semen (13).

Para disminuir el riesgo de diseminación de las enfermedades causadas por este virus y tomar las medidas de control adecuadas, resulta necesario disponer de ensayos rápidos, sensibles y específicos. Durante muchos años el aislamiento viral (AV) ha sido el estándar de oro para el diagnóstico del virus, pero requiere de mucho tiempo para obtener el diagnóstico final y de facilidades para cultivos celulares, con engorrosos procedimientos de trabajo (14).

En la actualidad el diagnóstico molecular, y más específicamente la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (rPCR), han desplazado al AV para muchos patógenos y se ha convertido en el estándar de oro para muchas enfermedades y agentes virales (15). La Organización Mundial de la Sanidad Animal (OIE) considera el rPCR como el método recomendado para la confirmación de casos clínicos de BoHV-1 (16). Estos ensayos, además de tener elevadas sensibilidad y especificidad, reducen el riesgo de contaminaciones cruzadas (17). El presente trabajo tuvo como objetivo desarrollar un ensayo rPCR basado en SYBR-Green I para la detección de BoHV-1.

Las cepas de referencia y aislados de campo empleados en este estudio se listan en la Tabla 1.

Tabla 1. 

Aislados de campo y virus empleados./ Field isolates and viruses used.

VirusCepa de referencia/ Aislado viralProcedencia
BoHV-1E8/aislado cubanoCENSA, Cuba
BoHV-2PhylaxiaInstituto de Medicina Veterinaria, Hungría
BoHV-5B4/aislado cubanoCENSA, Cuba
ADV-8Misk/67Instituto de Medicina Veterinaria, Hungría
ADV-9SofíaInstituto de Medicina Veterinaria, Hungría
PRVV208/aislado cubanoCENSA, Cuba

Los aislados de campo y las cepas E8 (BoHV-1), Phylaxia (BoHV-2) y B4 (BoHV-5), se cultivaron en la línea celular de riñón bovino (MDBK), según los procedimientos estándares que se describen en el Manual de Ensayos de Diagnósticos y Vacunas para Animales Terrestres (16). Luego de 72 horas de incubación a 37ºC, el virus fue colectado mediante tres ciclos de congelación-descongelación y se conservó a -70oC hasta ser usado para la extracción del ADN. En el caso del aislado cubano V208, proveniente del virus de la pseudorrabia (PRV), se cultivó en la línea celular de riñón porcino (PK-15) (ATCC, CCL 33), siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente. Las cepas Misk/67 y Sofía, pertenecientes al Adenovirus bovino-8 (ADV-8) y Adenovirus bovino-9 (ADV-9), respectivamente, fueron gentilmente donadas por el Laboratorio de Virología del Instituto de Medicina Veterinaria, Phylaxia, Hungría.

Se emplearon tres terneros mestizos Holstein entre tres y cinco meses de edad clínicamente sanos. Durante todo el experimento los animales se mantuvieron en condiciones de bioseguridad y con alimentación ad libitum. Los terneros se inocularon por la vía intranasal con 2 mL de un sobrenadante de cultivo celular en cada mostril, con la cepa E8 de BoHV-1, cuyo título fue de 106,5 EID50/mL. A todos los animales se les realizó inspección clínica durante el experimento, que se basó en la evaluación diaria de los siguientes aspectos: la presencia o ausencia de secreciones y el aspecto de las mucosas nasales y conducta ante el alimento. Se tomaron muestras de exudado nasal (ambas fosas nasales) en el momento antes de la inoculación y a partir de las 48 horas p.i hasta el día 15 p.i. El protocolo del experimento se aprobó por el comité de ética del CENSA con el objetivo de garantizar el menor sufrimiento de los animales.

La reactivación de la infección latente se realizó aplicando dexametasona a razón de 0,11 mg/Kg de peso durante cinco días en tres novillas mestizas Holstein. Se tomaron muestras de exudado nasal (ambas fosas nasales) a partir del sexto día hasta el 21 día posterior a la inmunosupresión.

Se colectaron 165 muestras de exudados nasales provenientes de bovinos de cuatro vaquerías de experimentación pertenecientes a la provincia Mayabeque. En el momento de la toma de muestra, en tres de ellas los animales tenían, como único signo clínico, ligeras secreciones nasales; el resto de los animales muestreados no presentaban ningún signo clínico.

Se utilizaron los cebadores descritos por Rodríguez et al. (18) para BoHV-1: 514 S21, GCG GGC CTG GTT GCG TAC TAC y 695 S21, AGC AGA TCT TCC GCG TTG ATC que amplifican una región de 220 pb del gen de la timidina quinasa. La Tm del producto de amplificación se estimó con el empleo del paquete de programas Oligo, versión 7 (Análisis Molecular de Biología, Inc., E.U.A). Esta estimación se realizó mediante el análisis de la pareja de cebadores consecuencias disponibles en la base de datos GenBank.

El ADN de las cepas de referencia, de las muestras de los aislados de campo y de las obtenidas de animales experimentales y de campo, se extrajo a partir de 120 µL del sobrenadante obtenido de los cultivos celulares y de los exudados nasales. La extracción se realizó con el uso del juego de reactivos Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega Madison, WI, E.U.A), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El ADN se resuspendió en 10 μL de agua libre de nucleasas (Promega, Madison, WI, E.U.A.) y se conservó a -80°C hasta su uso.

Todos los análisis de rPCR se realizaron en la plataforma LightCycler 2.0® (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania). Se realizaron un grupo de experimentos para optimizar los protocolos, incluyendo concentraciones de reactivos y parámetros de termoperfil. La reacción de amplificación contenía 5 µL del ADN molde, 1 µL de cada uno de los cebadores para los cuales se evaluaron las siguientes concentraciones 0,3; 0,4; 0,5; 0.6 µM; 2 µL de LightCycler® FastStart DNA master SYBR-Green I (10X) (Roche), 8 µL de MgCl2 del que se evaluaron las siguientes concentraciones: 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5 mM y agua libre de nucleasas (Promega, Madison, WI, E.U.A) para un volumen final de 20 µL para cada reacción.

El termoperfil empleado fue el siguiente: 95ºC por 10 min, seguido por 40 ciclos de desnaturalización a 95ºC por 10 s; se evaluaron tres temperaturas de alineamiento 58ºC, 600C y 62ºC por 10 s y elongación a 72ºC por 20 s con adquisición de dato fluorescente. Después de los ciclos de PCR, se generó una curva de disociación (0 s a 95ºC, 15 s a 65ºC, 0 s a 95ºC) para discriminar entre los amplicones específicos y los productos de amplificación no específicos. Los picos de disociación se visualizaron al graficar la primera derivada negativa de la fluorescencia contra la temperatura (−dF/dT versus T), lo cual se obtiene con el empleo del programa LightCycler® 4.05.415 (Roche AppliedScience, Mannheim, Alemania). El valor de Tm se definió como el punto máximo de la curva.

Para determinar el límite de detección del ensayo se realizaron diluciones seriadas en base 10 en sobrenadantes de exudados nasales negativo de la cepa E8 de BoHV-1 con título de 106,5 EID50/mL. De cada dilución se extrajo el ADN viral que se empleó como molde para el ensayo de rPCR. Cada dilución se evaluó por triplicado.

La repetibilidad del ensayo de rPCR basado en SYBR Green I se determinó con el empleo de tres muestras, una muestra positiva fuerte (105 EID50/mL), una muestra positiva media (103 DICT50/50µL) y una muestra positiva baja (102 EID50/mL). Las tres muestras se obtuvieron diluyendo la cepa E8 de BoHV-1 en exudado nasal negativo a este virus. Para determinar la variabilidad intraensayo, cada dilución se evaluó por triplicado. Para medir la variabilidad interensayo, cada dilución se evaluó en tres corridas diferentes realizados por dos operadores diferentes en días diferentes. La Desviación Estándar (DS) se calculó con el programa LightCycler® 4.05.415 (Roche AppliedScience, Mannheim, Alemania) y el coeficiente de variación (CV) se determinó según la fórmula: CV = (SD[valor de Ct]/Media[valor de Ct]) x 100, de acuerdo con las guías previamente publicadas (E.U.A. Environmental Protection Agency, 2004).

Los ensayos de PCR convencional o en punto final se realizaron en un volumen de reacción de 50 µL que incluyó: 2 µL de muestra de ADN, 1xGoTaq® Flexi DNA Polymerase (Promega, Madison, WI, E.U.A.) (10 µM de cada dNTP, 1 mM MgCl2, pH 8.5) y 0,6 µM de cada cebador. La reacción de PCR se realizó en un termociclador (Eppendorf, Mastercycler) bajo las siguientes condiciones: un ciclo de incubación de 5 min a 94ºC seguido de 35 ciclos (30 s a 94ºC, 30 s a 62ºC y 30 s a 72ºC) y un ciclo de 7 min a 72ºC.

Se utilizaron células MDBK, que se mantuvieron en medio DMEM (SIGMA) con 10 % de suero fetal bovino (Hyclone) a una concentración final de 0,5 %. La inoculación se realizó según la metodología descrita en el Manual de Ensayos de Diagnósticos y Vacunas para Animales Terrestres (16) que se detalla a continuación: se emplearon placas de 96 pozos y en cada pocillo se adicionaron 50 µL de medio de cultivo con una concentración final de 10 % de suero fetal. Se realizaron diluciones seriadas en base 10, en medio de cultivo desde 10-1 hasta 10-9. Se adicionaron 50 µL por pozo de cada dilución previamente obtenida a razón de ocho réplicas por dilución. Seguidamente, se adicionaron 100 µL por pozo de una suspensión de células MDBK con una concentración de 3,5 x 105 células/mL. Las placas inoculadas se incubaron a 37°C en atmósfera de 5 % de CO2 durante tres días. La lectura se realizó a las 72 horas p.i y el título viral se calculó mediante el método de Reed y Muench (19).

Las muestras de exudado nasal colectadas de los terneros inoculados y de las novillas con reactivación de la infección latente fueron evaluadas por el nuevo ensayo desarrollado, por la técnica de AV y por el PCR de punto final descrito por Rodríguez et al. (18). Las 165 muestras de exudados nasales procedentes de bovinos de las cuatro vaquerías de experimentación (I, II, III y IV) solo se evaluaron por el nuevo ensayo desarrollado.

Los ensayos de rPCR basados en SYBR Green I han demostrado ser una de las herramientas más efectivas en la detección rápida y diferenciación de una variedad de patógenos (20,21). Sin embargo, las reacciones basadas en este formato, por lo general, están sesgadas por el hecho de que se detecta, además, la amplificación de dímeros de cebadores (19). Por esta razón, se deben discriminar, con una elevada precisión, las amplificaciones específicas de aquellas que no lo son. Para cumplir este objetivo, en 1996 Roche AppliedScience incorporó, en el programa LightCycler®, el cálculo de la segunda derivada negativa de la fluorescencia con respecto a la temperatura que facilitó la discriminación y cuantificación de los productos obtenidos con SYBR Green I, sin la necesidad de utilizar sondas específicas (22,23). Por este motivo un elemento de gran importancia es conocer la Tm específica teórica para el amplicón resultante de la pareja de cebadores que se va a emplear en un ensayo. Los cebadores seleccionados en este ensayo amplifican una región de 202 pb que abarcan desde el nucleótido 514 hasta el 716 del gen tk de BoHV-1. Con el empleo del programa Oligo versión 7.0 se obtuvo la Tm específica teórica para el amplicón resultante. En este caso, el valor obtenido de Tm fue de 93,70C, lo que puede tener una diferencia de hasta 10C con la temperatura in vitro.

Las diferencias que pudieran existir entre las Tm teórica y la Tm in vitro están fundamentadas por la contribución de los iones Mg2+ en el medio, así como de los monocationes y dNTPs libres, parámetros que por lo general son subestimados por los programas de evaluación de cebadores. Este resultado indica que la temperatura óptima del ensayo debe seleccionarse experimentalmente, aunque puede ser orientada por cálculos teóricos.

Finalmente, las concentraciones de cebadores y MgCl2 establecidas en este ensayo fueron 0,4 µM y 5 mM, respectivamente. La mezcla del PCR final contenía 0,4 µM de cada cebador, 2 µL de FastStart DNA Master SYBR Green I (3,2 µL de MgCl2 25 mM) (concentración final de 5 mM), 5 µL del ADN molde; la temperatura óptima de alineamiento seleccionada fue de 58oC.

En la evaluación de la sensibilidad analítica, el ensayo de rPCR mostró curvas de amplificación con curvas de disociación específica de 930C ± 10C. El límite de detección del ensayo de rPCR basado en SYBR Green I fue 100.5 DICT50/ml (Figura 1). Esta amplificación fue también confirmada por la detección de una banda de 202 pb en electroforesis de gel de agarosa en las diluciones desde 106.5 hasta 100.5 (Figura 2). El límite de detección resultó ser en dos órdenes superior al obtenido por el ensayo de PCR en punto final reportado por Rodríguez et al. (18) (102.45 DICT50/ml), donde se emplean los mismos cebadores que los utilizados en este ensayo. Este valor demuestra la elevada sensibilidad analítica de los ensayos de rPCR que garantizan la detección del agente, aun en cargas virales muy bajas (24).

Figura 1. 

Sensibilidad analítica basada en dosis infectivas de la cepa E8 del herpesvirus bovino 1 para el nuevo ensayo. Curvas de disociación específicas para diferentes diluciones de la cepa E8, que incluyeron la concentración inicial de la que se partió y las concentraciones menores. El límite de detección se señala en un rectángulo rojo./ Analytical sensitivity based on infective doses of BHV1 strain E8 for the new assay. Specific dissociation curves for different dilutions of E8 strain, including the initial concentration and the lower concentrations. The detection limit is marked in a red rectangle.

Figura 2. 

Electroforesis en gel de agarosa al 2% de los productos de PCR en tiempo real para herpesvirus bovino 1. Línea 1: Patrón de peso molecular 100pb (Promega); 2 - 8: diluciones seriadas desde 10-1.5 - 106.5./ 2% agarose gel electrophoresis of real time PCR products for bovine herpesvirus type 1. Line 1: Molecular weight marker 100pb (Promega); 2 - 8: Serial dilutions from 10 -1.5 - 10 6.5 .

Todas las muestras con valor de Ct por debajo de 35, con una curva de amplificación que presenten un incremento exponencial y que la temperatura de disociación específica presente un pico de 93°C ± 1°C se consideraron positiva para BoHV-1.

El ensayo también resultó ser específico, ya que solo se obtuvo una curva de amplificación con un valor de temperatura de disociación de 93,01°C con la cepa E8 de BoHV-1. El ensayo no amplificó el ácido nucleico del resto de los virus evaluados, dentro de los que se encontraron virus homólogos como el BoHV-2 y BoHV-5 (Tabla 1) y virus heterólogos que ocasionan un cuadro clínico similar al del BoHV-1. Los productos de amplificación obtenidos a partir del rPCR evaluado, al ser corridos en un gel de agarosa, solo produjeron bandas de la talla esperada (202 pb) para el BoHV-1 (Figura 3).

Figura 3. 

Electroforesis en gel de agarosa a 2 % para la verificación de los productos de amplificación obtenidos por el ensayo rPCR basado en SYBR-Green I para la detección de herpesvirus bovino 1 frente a virus homólogos y heterólogos. Línea 1: Patrón de peso molecular 100 pb (Promega); Línea 2: Cepa E8 (BoHV-1); Línea4: Phylaxia (BoHV-2); Línea5: Cepa B4 (BoHV-5); Línea 6: V208 (PRV); Línea 7: Misk/67 (ADV-8); Línea 8:Sofia (ADV-9)./ 2 % agarose gel electrophoresis for the verification of amplification products obtained by SYBR Green I Based Real-Time RT-PCR assay for the detection of bovine herpesvirus type 1 against homologous and heterologous viruses. Line 1: Molecular weight marker 100 bp (Promega); Line 2: E8 strain (BoHV-1); Line 4 Phylaxia (BoHV-2); Line5: Strain B4 (BoHV-5); Line 6: V208 (PRV); Line 7: Misk/67 (ADV-8); Line 8: Sophia (ADV-9).

El ensayo de rPCR desarrollado demostró una alta repetibilidad con CV dentro de las corridas (variabilidad intraensayo) y entre corridas (variabilidad interensayo) en el rango de 0,1 a 0,7 % y 0,8 a 1,9 %, respectivamente. Estos valores se encuentran dentro del rango permitido para este tipo de ensayo CV<2 % para la repetibilidad intraensayo y CV<3 % interensayo (25). Los valores obtenidos en el estudio de repetibilidad convierten al ensayo rPCR desarrollado en una herramienta muy útil y sustentan el uso de este sistema de diagnóstico (25).

Los terneros de la reproducción experimental mostraron un cuadro clínico muy similar entre ellos; los signos clínicos más característicos son el lagrimeo, la congestión nasal y las secreciones nasales, las que se presentaron entre dos y cinco días p.i. En el caso de las secreciones nasales, primeramente se presentaron como secreciones serosas (Figura 4A) y más tarde se tornaron mucopurulentas. En todos los animales se observó secreción ocular serosa y opacidad de la córnea (Figura 4B). La presencia de signos clínicos a nivel del tracto respiratorio superior y de conjuntivitis, ya sea uni o bilateral, es característico de las infecciones por herpervirus en el bovino (26,16,27,28). Según la clasificación de Young (29) sobre las infecciones por BoHV-1 en subclínicas, leves o severas, este cuadro clínico se corresponde con una infección de tipo leve.