INTRODUCCIÓN
Botrytis cinerea Pers. es causante de enfermedades en más de 200 especies de plantas. Durante el proceso infectivo ocurren los siguientes estadios: penetración de la superficie de los tejidos, muerte de los tejidos del huésped que conduce a la aparición de las primeras lesiones, su expansión de las lesiones, maceración de los tejidos y, finalmente, se observa la esporulación (1).
En el cultivo de fresa, B. cinerea ataca durante todo el año, fundamentalmente cuando existen condiciones de alta humedad. Sus síntomas se localizan, sobre todo, a nivel de flores y frutos. La enfermedad se conoce comúnmente como el moho gris, causante de la pudrición de los frutos. Los conidios se pueden observar en los cálices de flores, hojas muertas y frutos momificados (2).
En Ecuador se producen anualmente más de 30 000 toneladas de fresa, las cuales se consumen tanto en forma fresca como procesada, en jaleas, yogurt, helados y mermeladas. Sin embargo, ocurren cuantiosas pérdidas de frutos, principalmente en la poscosecha y son causadas por B. cinerea (3).
B. cinerea es un ascomicete fitopatógeno necrotrófico; tiene la capacidad de provocar la muerte de las células de los tejidos de sus hospedantes mediante la activación de un amplio repertorio de factores de virulencia, como son la producción de toxinas, las especies reactivas de oxígeno, la inducción de estrés oxidativo en las células de los tejidos afectados, la producción de un gran arsenal de enzimas degradativas, los compuestos de bajo peso molecular como el ácido oxálico e inducción de la muerte celular programada. Por estos motivos, B. cinerea puede nutrirse de diferentes especies vegetales (4).
En ocasiones, la incidencia y la severidad de los daños ocasionados por B. cinerea en fresa, en algunas regiones del país, pueden variar en dependencia de las variedades que se utilizan, las condiciones del manejo del cultivo, el clima y la variabilidad patogénica y la agresividad que existan entre los aislados que conforman la población de este agente fitopatógeno (5,6).
En Ecuador se desconoce la variabilidad, en términos de patogenicidad y agresividad, entre aislados procedentes de poblaciones de B. cinerea que afecten el cultivo de fresa, pues no se dispone de estudios centrados en estos aspectos. El presente trabajo tuvo como objetivo determinar la agresividad entre aislados monospóricos obtenidos a partir de frutos de fresa que mostraban síntomas del moho gris en la provincia Tungurahua, Ecuador.
MATERIALES Y MÉTODOS
El trabajo se realizó en el laboratorio de Fitopatología de la Facultad de Recursos Naturales de la Escuela Superior Politécnica del Chimborazo (FRN-ESPOCH), durante el periodo de diciembre de 2016 a marzo de 2017.
Toma de muestras
Las muestras de frutos enfermos se obtuvieron de la finca del señor Juan Panimboza Yanzapanta, del cantón Cevallos en la provincia Tungurahua de Ecuador, en el periodo de diciembre 2016 a marzo de 2017.
Obtención de los aislados
Para la obtención de aislamientos monospóricos se siguió el método sugerido por Silva-Moreno (7): se tomó una pequeña porción de micelio con esporas de las placas Petri (90 mm Ø), que contenían 20 ml del medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA, DifcoTM). La porción de micelio tomada, mediante un horadador, fue de 10 mm de diámetro, a partir de cultivos de siete días de crecidos a 20°C. El micelio de cada aislado se suspendió en un tubo de ensayo estéril que contenía 10 ml de agua destilada estéril.
Después de la agitación mediante vortex durante un minuto, parte de la suspensión conidial (1 ml) se vertió en placas Petri (90 mm Ø) que contenían 20 ml de Agar Agua (95279 Sigma-Aldrich) al 2 % y se diseminó mediante una espátula de Drigalski. Posteriormente, las placas se colocaron en posición vertical y se incubaron a 20°C, en oscuridad durante 24 h. Los conidios germinados se visualizaron con un estereoscopio (Ivimen®, Modelo Cod. 5313308) con un aumento de 40X. Se tomaron conidios individuales germinados con una aguja y se transfirieron a placas Petri (90 mm Ø) que contenían 20 ml del medio de cultivo PDA (DifcoTM), las cuales se incubaron a 20°C durante siete días.
Para la identificación de la especie B. cinerea se siguieron los criterios sugeridos por Elad et al. (8). Para la observación de los aislados se prepararon láminas de portaobjetos de micelio con estructuras reproductivas y se les añadió una gota de lactofenol con el colorante algodón azul. Se examinaron las estructuras reproductivas de los diferentes aislados en un microscopio binocular (Ivimen®, modelo 701, Cod. 5313101) con aumento de 200 X, para confirmar los criterios morfológicos informados para dicha especie.
Ensayos de patogenicidad
Para estos ensayos se utilizaron 10 frutos de Fragaria vesca cv. Albion por cada aislado y otros 10 se usaron como control de inoculación y se inocularon con agua estéril. La inoculación se realizó por inmersión de los frutos en una suspensión de conidios de aproximadamente 1.2x105 conidios. ml-1 para cada aislado. Posteriormente, los frutos se dejaron secar sobre papel absorbente (Duramax®) durante una hora en una cabina de flujo laminar vertical (Airstream® Gen 3). Una vez secos los frutos, se colocaron individualmente en bolsas herméticas (ZiplocMulti-Pack) con cierre dentado y se incubaron a 20°C y oscuridad durante 10 días. Sobre la base de la sintomatología observada, se confeccionó una escala de evaluación basada en el porcentaje de frutos con síntomas con la cual se realizaron evaluaciones diarias. Este ensayo se repitió dos veces bajo las mismas condiciones.
Evaluaciones y variables
Las evaluaciones se realizaron diariamente registrando el valor del grado de la escala de evaluación; con ello se calcularon las siguientes variables:
Intensidad de ataque (IA): este índice se calculó según lo sugerido por Townsend y Heuberger (9) acorde con la siguiente fórmula: Donde IA (%) es intensidad de ataque expresada en porcentaje, n= número de frutos en cada nivel; b= valor de la severidad acorde con la escala; N= 5, corresponde con el número de estadios de la escala y T= total de frutos evaluados por aislamiento.
Área Bajo la Curva del Progreso de la Enfermedad (ABCPE): para estimar el ABCPE se utilizó el método de integración trapezoidal, discretizando la variable de tiempo (horas) y calculando la intensidad media de la enfermedad entre cada par de puntos temporales adyacentes (10). Se consideraron los puntos de tiempo de la muestra en una secuencia {ti}, donde se observaron mayores diferencias respecto a la agresividad. Se tomaron las medidas asociadas al nivel de enfermedad {yi}. Se consideró el ABCPE en el tiempo t = tk, como la enfermedad acumulada total hasta t = tk y se utilizó la fórmula: .
Diseño experimental y análisis estadístico
Se utilizó un diseño completamente aleatorizado para los dos ensayos de inoculación; los análisis estadísticos del ABCPE promedio de los dos ensayos se efectuaron mediante el uso del paquete SPSS (Statistical Package for the Social Sciences Version 15.0) software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Para la comparación de la agresividad de los aislados se aplicó la prueba no paramétrica de Kruskall-Wallis.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se obtuvieron nueve aislados monospóricos a partir de frutos de frutilla cv. Albion con síntomas típicos del moho gris. En todos los aislados se observaron colonias con micelio blanco, denso, piloso que, posteriormente, se tornó gris (Figura 1 a). La presencia de esclerocios en las colonias de B. cinerea comenzaron a observarse a los 21 días; a los 35 días alcanzaron completamente el color negro debido a la melanización de los mismos (Figura 1 b y c). Las hifas fueron septadas, hialinas y ramificadas de manera irregular o dicotómica (Figura 1 d), similares a las descritas para los aislados de esta especie que afectaban al melocotón en Ecuador (11). La morfología de los macroesclerocios fue similar a la descrita por Dashwood y Fox. (12). La mayoría de las especies del género Botrytis forman esclerocios; sin embargo, la abundancia dependerá de las condiciones de incubación, el aislado y el medio de cultivo utilizado. Dichas estructuras están diseñadas para sobrevivir a condiciones ambientales adversas (13).
Se observó la presencia de conidióforos septados, macronematosos, que nacieron directamente del micelio sin formar una estructura especializada (Figura 1 d). El extremo de cada conidióforo finalizó en una estructura similar a una ampolla donde se desarrollaron conidios solitarios, unicelulares, lisos, globosos (Figura 1 f, g, h) con dimensiones promedios de 9-11 x 6-7 µm. Estas características descritas fueron similares a las informadas anteriormente por Lalève et al. (15) y por Elad (6).
Fig. 1.
Características morfológicas de B. cinerea en el medio de cultivo PDA. Característica de una colonia a los siete días (a), presencia de esclerocios a los 21 días (b), melanización de los esclerocios a los 35 días (c), hifas septadas, hialinas y ramificadas de manera dicotómica (d), conidióforos que nacieron directamente del micelio (e y f), conidióforo macronematosos (g), conidios solitarios, unicelulares, lisos, globosos (h) / Morphological characteristics of B. cinerea on PDA culture medium. Characteristics of a colony at 7 days (a), presence of sclerotia at 21 days (b), melanization of sclerotia at 35 days (c), Hyaline septate hyphae branching dichotomously, (d), conidiophores born directly from mycelium (e and f), macronematose conidiophores (g), lonely conidia, unicellular, smooth and globose (h).
En la mayor parte de los aislados se observaron numerosos microesclerocios negros en el medio de cultivo PDA (Fig 2).
Fig. 2.
Microesclerocios negros presentes en el medio de cultivo PDA a los 14 días / Black microsclerotia on PDA culture media at 14 days.
En los ensayos de patogenicidad se observó que, a partir del segundo día de inoculación, en algunos aislados los frutos comenzaron a mostrar la presencia de un micelio blanco con bordes acuosos. A partir del sexto día, en algunos aislados se detectó la presencia de micelio de color gris, debido a la formación de conidios sobre la superficie de los frutos afectadas. Sobre la base de la sintomatología observada se logró confeccionar una escala diagramática cuantitativa con su correspondencia visual (Tabla 1), que fue utilizada para el cálculo de la intensidad de ataque de cada aislado de B. cinerea. Los síntomas observados en los ensayos de inoculación fueron similares a los descritos por Dashwood y Fox (12).
Tabla 1.
Escala diagramática cuantitativa basada en la sintomatología de B. cinerea observada en frutos de Fragaria vesca L. cv. Albion/ Diagramatic quantitative scale based on the de B. cinerea symptomatology on fruits of Fragaria vesca L. cv. Albion.
| Grado | Descripción | Correspondencia visual |
|---|---|---|
| 0 | Fruto sin síntomas |
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| 1 | Menor de ¼ del fruto con síntomas |
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| 2 | De ¼ a ½ del fruto con síntomas |
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| 3 | De ½ a – del fruto con síntomas |
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| 4 | Más de – del fruto con síntomas |
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Todos los aislados de B. cinerea fueron patogénicos y se observó un crecimiento en forma de moho gris aterciopelado en los frutos de fresa inoculados, que provocó lesiones de color marrón claro, las cuales prevalecieron en el extremo inferior de los frutos inoculados. Al inicio del proceso infeccioso se observó en los frutos una masa micelial de aspecto algodonoso y color blanco y, posteriormente, se tornaron de color gris debido a la presencia de esporas. En ambos ensayos de inoculación no se observaron frutos secos, duros ni momificados, lo cual pudo deberse a la alta humedad presente en las bolsas herméticas por la presencia de algodón humedecido, que favoreció la pudrición blanda y que a los diez días culminaron los dos ensayos de inoculación.
Los aislados más agresivos fueron CC-ESPOCH-Bc-6, CC-ESPOCH-Bc-7 y CC-ESPOCH-Bc-9, pues provocaron los mayores valores del ABCPE, desde las 96 h hasta las 168 horas posteriores a la inoculación de los frutos (Tabla 2).
Tabla 2.
Agresividad de aislados de B. cinerea sobre la base de los valores del ABCPE desde las 96 h hasta 168 horas posteriores a la inoculación (hpi) de frutos de Fragaria vesca L cv. Albion. / Aggressiveness of B. cinerea isolates according to values of AUDPC from 96 h to 168 h after inoculation (hpi) of fruits of Fragaria vesca L cv. Albion
Rangos promedios que en una misma columna tengan letras no comunes, difieren según la prueba de Kruskal Wallis, complementada con la prueba U de Mann Whitney para p<0,05 con n=10.
En relación con el análisis de patogenicidad y agresividad entre aislados de B. cinerea, autores como Lorenzini y Zapparoli (16) determinaron, mediante ensayos de inoculación, que todos los aislados evaluados fueron patogénicos, aunque cuatro de los aislados fueron los más agresivos sobre la base del índice de infección y del diámetro de las lesiones necróticas. Sin embargo, en los ensayos del presente estudio solo se determinó el ABCPE para diferenciar la agresividad entre los aislados obtenidos.
Asimismo, se ha apreciado diferencia en la agresividad de aislados de B. cinerea inoculando frutos de fresa. An et al. (17) utilizaron el método de inoculación de frutos de fresa para comparar la agresividad de cepas de Botrytis y sus mutantes deficientes en la síntesis de Acuoporinas. Estos autores también evaluaron el desarrollo de las lesiones necróticas sobre los frutos, lo cual en este trabajo no se tomó en consideración.
Otros autores utilizaron este mismo ensayo de inoculación para evaluar la agresividad de mutantes de B. cinerea, algunos de los cuales mostraron un desarrollo de síntomas reducido en relación con la cepa silvestre (18). Lograron determinar que los mutantes deficientes de enzimas degradadoras de la pared celular y la producción de toxinas fueron los principales factores que justificaron la pérdida de la capacidad virulenta. A diferencias de estos autores, en el presente trabajo no se determinó la actividad enzimática celulasa, endopoligalacturonasa ni pectin metilesterasa; tampoco la producción de ácidos mediante ensayo cualitativo ni la capacidad de formación de apresorios.
Esta investigación constituye el primer trabajo donde se confirma la variabilidad en agresividad entre aislados de B. cinerea obtenidos a partir de frutos de fresa con síntomas de pudrición gris del cv. Albion en Ecuador. Este aspecto que sienta las bases para realizar estudios futuros con el objetivo de identificar los determinantes de agresividad y los factores de patogenicidad a nivel bioquímico y molecular, lo cual podría sugerir nuevas dianas moleculares para lograr un manejo más eficiente del moho gris de la fresa.
CONCLUSIONES
Los aislados compartieron características morfológicas similares a la especie Botrytis cinerea y todos fueron patogénicos, aunque los más agresivos fueron CC-ESPOCH Bc-6, CC-ESPOCH Bc-7 y CC-ESPOCH Bc-9. Lo anterior constituye el primer informe de la existencia de variabilidad en la agresividad entre aislados B. cinerea procedentes de poblaciones en condiciones naturales que afectan a F. vesca L cv. Albion en Ecuador.