Eficacia de dos biofungicidas para el manejo en campo del Tizón temprano (Alternaria solani Sorauer) de la papa (Solanum tuberosum L.)

El ensayo se realizó en el Laboratorio de Micología Vegetal del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) (Latitud 22,991867; Longitud -82,153892), municipio San José de las Lajas, provincia Mayabeque, Cuba. Se utilizaron las cepas de T. asperellum Ta.85 y de P. protegens Pf-5, por su acción parasítica frente a A. solani (8,9).

La compatibilidad se determinó por la técnica de cultivo dual (CD) en placas Petri (90 mm de Ø) contentivas de medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) (BIOCEN) pH 5,6. Para ello se sembró, a una distancia de 5 mm del borde, un disco de 8 mm de la colonia de la cepa Ta. 85 y, diametralmente opuesto, se sembró una asada en estrías de la cepa Pf-5 (10). También se sembró un disco de T. asperellum sobre estrías de una asada de la cepa de P. protegens. Se hicieron tres réplicas por variante. Los controles fueron las cepas de cada microorganismo sembradas independientemente y en igual disposición.

Las placas se incubaron a 30±1°C. Se utilizó un diseño completamente al azar. Se evaluó visualmente el desarrollo de cada microorganismo en interacción, según Rajasekhar et al. (10).

El experimento se realizó en la finca “El Mulato” (N: 353,980; E: 383,325), localizado en la carretera San José-Tapaste en la provincia Mayabeque; durante las campañas de invierno 2015-2016 y 2016-2017.

Para el ensayo se utilizaron tubérculos-semilla certificadas del cultivar Romano procedentes de Holanda.

Los lotes del bioproducto de T. asperellum se obtuvieron en la planta piloto de producción del CENSA, según los Procedimientos Normativos de Operaciones del Sistema de Gestión de Calidad de la institución y se ajustaron a una concentración de 10⁷UFC.ml^-1. Las suspensiones de Pseudomonas se obtuvieron a partir de un lavado con solución salina (0,85 % NaCl) estéril del cultivo de la bacteria en medio King B, de 48 h de crecimiento incubado estáticamente en oscuridad, a 28±1^oC. Se midió la densidad óptica a 600 nm en un espectrofotómetro T60 de PG Instruments Ltd. La concentración final de la suspensión bacteriana se ajustó a 10⁸UFC.ml^-1.

El ensayo se realizó en un terreno de topografía llana, suelo Ferralítico Rojo Lixiviado típico, éutrico, con un pH ligeramente ácido, que oscila entre 5,2 y 6,1 (11).

Los ensayos se conformaron en un diseño de bloques no aleatorizados, en parcelas de 27 m², estructurados por tres surcos de 10 m de longitud, con tres réplicas. Los tubérculos-semilla se plantaron por surco, a una distancia de 0,90 x 0,20 m y a una profundidad de 0,10-0,15 m, en el mes de diciembre de cada campaña y se cosechó a los 90 días. Se tuvieron en cuenta los aspectos de atenciones culturales incluidos en el Instructivo Técnico de la Papa (12). El riego se realizó por aspersión de forma semimecanizada a razón de 60 m³.h a intervalos de cinco días con ajustes según precipitaciones y humedad del suelo. La eliminación de malezas se realizó de forma manual.

Los tratamientos, durante la campaña 2015-2016, consistieron en aplicaciones de: I- Trichoderma (T) al suelo; II- T al suelo + tubérculos; III- T al suelo + tubérculos + follaje; IV- T al suelo + follaje; V- T a los tubérculos; VI- T a los tubérculos + follaje; VII- T al follaje; VIII- Control; IX- Pseudomonas (P) a los tubérculos; X- P a los tubérculos + follaje; XI- P al follaje. Se realizó una aplicación al follaje una vez detectados los primeros síntomas de la enfermedad.

En la campaña 2016-2017 se utilizaron los mejores tratamientos de la campaña anterior y se crearon combinaciones entre ellos. Se realizaron dos aplicaciones foliares, la primera al detectar los primeros síntomas de la enfermedad y la segunda 15 días posteriores a la primera aplicación, utilizando una dosis de 8 L por tratamiento de los biofungicidas antes mencionados a una concentración de 7x10⁷ UFC.ml^-1 y de 10⁸ UFC.ml^-1, respectivamente, tanto de forma individual, como en coaplicaciones.

Las aplicaciones en los tratamientos al suelo se efectuaron 10 días antes de la plantación, a razón de 8 L por tratamiento de una suspensión de conidios de la cepa Ta. 85 a una concentración de 7x10⁷ UFC.

Para el tratamiento a los tubérculos-semilla, se sumergieron por 10 minutos en una suspensión acuosa de T. asperellum a una concentración de 7x10⁷ UFC.ml^-1 y se dejaron secar a la sombra por 15 minutos antes de ser plantadas.

El monitoreo de la enfermedad se realizó cada siete días durante el ciclo del cultivo. Se siguió el tipo de muestreo sistemático. Se realizó una distribución de las plantas a evaluar para evitar coincidencia entre las plantas tomadas para la evaluación de la incidencia y las de la intensidad y, además, para lograr una mayor uniformidad en las evaluaciones.

Para determinar la incidencia de A. solani se consideró la proporción de plantas que mostraron síntomas de la enfermedad, evaluando 15, 20 y 15 plantas por réplica, para un total de 50 plantas. La evaluación se realizó de la siguiente manera: en la primera réplica se tomaron plantas impares, en la segunda réplica las pares y en la tercera, las plantas ubicadas en lugares múltiplos de 3 a partir del número 3. Para ello, se cuantificaron las plantas con síntomas por tratamiento y se calculó la incidencia según la fórmula:

En la determinación de la intensidad de la enfermedad se usó una escala de cinco grados: 0) planta sana; 1) las manchas ocupan de 1 % hasta un 10 % de la superficie de la hoja; 2) las manchas ocupan entre el 11 y 25 % de la superficie de la hoja; 3) las manchas ocupan entre 26 y 50 % y 4) las manchas ocupan más del 50 % de la superficie de las hojas afectadas (13). Se evaluaron 15 plantas por réplica (45 plantas evaluadas por tratamiento) de las cuales en cinco se tomó una hoja de la parte inferior, en otras cinco una hoja de la parte media y en las últimas cinco una hoja de la parte superior, por planta. La hoja evaluada fue la que presentó mayor afectación por manchas. En este caso, las plantas que se tomaron para las evaluaciones fueron las ubicadas en números pares en el surco en la primera réplica, las que ocupaban la posición de los números impares para la segunda y, en la tercera réplica, las que su ubicación se correspondió con la suma de 3 a partir del número 1 (1,4,7).

La intensidad (%) se calculó mediante la fórmula de Mc Kinney referida por Mijailova et al. (13).

Se evaluó, además, el rendimiento. Para ello se pesaron los tubérculos de tres surcos por réplica; posteriormente, se determinó el peso promedio de los tubérculos y se hizo la estimación en t.ha^-1.

Los datos se tabularon en Excel y se realizaron análisis de varianza para valorar los tratamientos; las medias se diferenciaron con la prueba de Tukey a 95 % de confianza. Se aplicó un análisis de regresión lineal para relacionar el rendimiento con la distribución e intensidad de la enfermedad. Se utilizó el paquete gráfico R versión 3.0.2. Para el procesamiento de los datos se empleó el paquete estadístico InfoStat/Profesional versión 1.1 (14).

No hubo inhibición del crecimiento entre la cepa de Trichoderma Ta. 85 y la de P. protegens Pf-5 en el cultivo dual (Fig. 1), tanto cuando se sembraron diametralmente opuestas como cuando la bacteria se sembró primero y sobre ella el antagonista, lo que demuestra que estos microorganismos son compatibles. Este resultado coincide con el obtenido por Patel et al. (15), quienes observaron compatibilidad entre T. asperellum y Pseudomonas flourescens Migula, al igual que con los de Dhage (16) y Rajasekhar et al. (10), pues no encontraron efecto inhibitorio en la zona de crecimiento entre estos controladores biológicos con igual técnica de CD. (Fig. 1)

Es de suma importancia conocer la compatibilidad entre los microorganismos seleccionados, ya que los agentes de control biológico pueden inhibirse entre sí, lo que conlleva a la disminución del control del patógeno en condiciones de campo (10,15,16).

Los resultados evidencian que estos productos pueden ser aplicados conjuntamente en el control biológico de A. sonali en el cultivo de la papa.

Los primeros síntomas de la enfermedad se detectaron entre los 35 y 40 días después de la brotación del cultivo, coincidiendo con lo informado por Castellanos et al. (17) y Rodríguez y Stefanova (18).

Todos los tratamientos difirieron significativamente con el control, excepto de los tratamientos Trichoderma en suelo en la incidencia de la enfermedad y Trichoderma en tubérculo más follaje en el rendimiento, durante la campaña 2015-2016. La incidencia de la enfermedad menor se observó en el tratamiento III, pero sin diferencias significativas con los resultados de los tratamientos IV, V, VI, VII, X y XI. La intensidad también alcanzó su menor valor en el tratamiento III, sin diferencias con los tratamientos II, V, VI, VII y XI (Tabla 1). El rendimiento se favoreció por el tratamiento XI, sin diferencias estadísticas con los tratamientos II, III, IX y X. Los tratamientos III y XI tuvieron las incidencia e intensidad más bajas y el rendimiento fue alto. Sin embargo, en los tratamientos V, VI y VII las incidencia e intensidad se mantuvieron en el entorno de los mencionados previamente, pero los rendimientos no sobresalieron; al parecer existen otros factores que influyen directamente en el rendimiento que se deben continuar investigando.

Estos resultados deben estar relacionados con varios mecanismos observados en los ensayos in vitro, como son: el efecto de antibiosis de Trichoderma y el fungistático de Pseudomonas (8,9). De forma general, los tratamientos donde hubo aplicaciones al follaje, independientemente del agente biológico aplicado, mostraron mejores resultados que los restantes.

Estos resultados son similares a los informados por Yadav (19) cuando en su trabajo observó que los tratamientos de P. fluorescens y de Trichoderma harzianum Rifai controlaron, separadamente, a Fusarium oxysporum Schltdl, causante de marchitamiento del tomate en condiciones de campo con un incremento significativo de rendimiento en el tratamiento con P. fluorescens. En estudios similares, Dhage (16) encontró que la aplicación separada de P. fluorescens y de Trichoderma spp. redujo la incidencia y la intensidad de Sclerotium rolfsii Sacc, agente causal de la pudrición de la vaina y del tallo del cultivo de maní y se obtuvo mayor rendimiento en la aplicación de P. fluorescens.

Sobre la base de los resultados en esta investigación, se conformaron los siguientes tratamientos para la siguiente campaña en condiciones de campo: I T. Suelo + tubérculo + follaje (T) + follaje (P); II T. Suelo + tubérculo + follaje (P) + follaje (T); III T. Suelo + tubérculo + follaje (T-P); IV T. Suelo + tubérculo + follaje (T-P) + follaje (T-P); V T. Suelo + tubérculo + follaje (P) + follaje (P); VI T. Suelo + tubérculo + follaje (T) + follaje (T); VII Control.

En la campaña (2016-2017) todos los tratamientos difirieron significativamente del control en los tres parámetros evaluados (Tabla 2). La incidencia e intensidad de la enfermedad fue menor en el tratamiento IV, sin deferir con la de los tratamientos I, V y VI para la incidencia; mientras que, en la intensidad de la enfermedad difirió de la del III y del VII. Los tratamientos III, IV y V mostraron los mayores rendimientos del cultivo sin diferencias significativas entre ellos, pero sí con los de los restantes tratamientos. Rajasekhar et al. (10) observaron que la combinación de T. harzianum y P. fluorescens redujo la incidencia del Tizón sureño (Sclerotium rolfsii Sacc.) en el cultivo de frijol (Phaseolus vulgaris L.) y aumentó el peso fresco, con respecto al control. Sandheep et al. (20) informaron que los mayores rendimientos en el cultivo de la vainilla (Vanilla planifolia Jacks. Ex Andrews) se obtuvieron con el tratamiento combinado de T. harzianum y P. fluorescens, y que la incidencia de Rhizoctonia solani Kühn se redujo en 66,7 %. Consecuentemente, Dhage (16) descubrió que la combinación de P. fluorescens y de Trichoderma spp. redujo la incidencia e intensidad de S. rolfsii, agente causal de la pudrición de la vaina y del tallo en el cultivo del maní, obteniendo así mayores rendimientos. Estos autores coincidieron en que el uso de microorganismos benéficos, como los agentes de control biológico, mejoran el crecimiento de las plantas, debido a la inducción de resistencia de la planta. Estos agentes producen enzimas extracelulares o compuestos antifúngicos o antibióticos, que reducen el efecto negativo del estrés biótico sobre el crecimiento de la planta y producen sustancias promotoras del crecimiento vegetal.

Los resultados del presente trabajo concuerdan con varios resultados obtenidos en Cuba, dirigidos al control de patógenos con biopreparados en base a cepas de Trichoderma y Pseudomonas, para combatir Fusarium spp. Phytophthora palmivora (E.J.Butler) E.J.Butler y otros fitopatógenos, en condiciones de campo (21,22). Es posible que los mismos estén relacionados con los mecanismos que poseen estos agentes biológicos que, además de ejercer un control sobre fitopatógenos, son capaces de estimular el crecimiento vegetal y contribuir a aumentar el rendimiento en los cultivos (22,23).

De manera general, el análisis de regresión lineal de la campaña 2015-2016 (Fig. 2) indica que, a medida que se incrementan la incidencia y la intensidad del ataque del Tizón temprano, disminuye el rendimiento y depende de 37,6 % de la intensidad y de 11,9 % de la incidencia. Mientras que en la campaña 2016-2017 se observó una relación inversamente proporcional entre la incidencia e intensidad de la enfermedad respecto al rendimiento, donde este último parámetro depende en el 49 % de la incidencia y en 51 % de la intensidad de la enfermedad en el campo (Fig.3). El rendimiento es un elemento multifactorial; sin embargo, se ha notificado el aumento del mismo por varios autores, como una consecuencia de las aplicaciones de estos controladores biológicos en los cultivos.

El índice de ataque de Tizón temprano tuvo una tendencia a aumentar en las dos campañas evaluadas. En la campaña 2016-2017 hubo mayor incidencia e intensidad de la enfermedad que en la campaña 2015-2016. Es probable que esto se deba a factores bióticos como la variabilidad patogénica del género Alternaria y/o a factores abióticos como las temperaturas, las precipitaciones, la humedad relativa y la velocidad del viento, los cuales influyen directamente sobre el índice de ataque del patógeno informado previamente por Pérez (24), factores que influyen en el desarrollo de la enfermedad (2).

Por ende, el aumento de la incidencia y de la intensidad de la enfermedad, de forma casi lineal como se observa en las figuras 2 y 3, puede influenciar la toma de decisión en cuanto a las medidas de control, tanto antes como durante la aparición de los síntomas, para evitar pérdidas mayores en el rendimiento. Esto evidencia que, además de ejercer un control de los fitopatógenos, estos agentes biológicos son capaces de contribuir a aumentar el rendimiento en los cultivos, como plantean Martínez et al. (23) y Kodithuwakku et al. (25). Los tratamientos V y VI fueron los mejores tratamientos integralmente al tener en cuenta la incidencia e intensidad de la enfermedad y el rendimiento del cultivo.

Los resultados abren la posibilidad de utilizar la cepa Ta. 85 de T. asperellum y la cepa Pf-5 de P. protegens para el control de A. solani en el cultivo de la papa, lo que constituye una contribución a la disminución del uso de químicos y, con ello, a la preservación del ambiente.