Las hortalizas son un conjunto de plantas herbáceas, anuales o perennes, que se consumen ampliamente a nivel mundial (11. Faostat. Base de datos de Agricultura. División de Estadística de la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura. 2017. Viale delle Terme di Caracalla 00153 Rome, Italy.). Dentro de las hortalizas están incluidas las verduras y legumbres verdes. Son de gran importancia en la alimentación debido a las vitaminas y sales minerales que poseen y aportan, a su vez, a la dieta humana. Su producción puede ser afectada por la presencia de enfermedades virales y entre estas las causadas por el género Potyvirus, entidades que constituyen una limitante importante para su desarrollo. Algunos de ellos ponen en peligro la seguridad alimentaria de países en desarrollo al causar enfermedades devastadoras en cultivos de regiones tropicales y subtropicales (22. Jones RAC, Naidu RA. Global dimensions of plant virus diseases: Current status and future perspectives. Annu. Rev. Virol. 2019, 6: 387-409).

En Cuba, se informó la incidencia de potyvirus en cultivos de solanáceas de las provincias Artemisa y Mayabeque (33. Diaz-de la Osa A, Quiñones M, Ricardo S, Hernandez A. Incidencia de potyvirus en localidades productoras de solanáceas en la región occidental de Cuba. Cultivos Tropicales. 2019.; 40 (1).) y se señaló a este género como causante de pérdidas importantes en el cultivo de pimiento (Capsicum annum L.) (33. Diaz-de la Osa A, Quiñones M, Ricardo S, Hernandez A. Incidencia de potyvirus en localidades productoras de solanáceas en la región occidental de Cuba. Cultivos Tropicales. 2019.; 40 (1)., 44 . Arana F, Martínez MA, Piñol B, Duarte L, Pacheco R, Quiñones M. Detección de potyvirus en plantas de pimiento (Capsicum annuum L.) y áfidos asociados al cultivo en Cuba. Rev. Protección Veg. 2015; 30(3 ): 235-238.,55. Quiñones M, Martínez Y, Arana F. Coexistencia de potyvirus y begomovirus en el cultivo del pimiento (Capsicum annuum L.) en Cuba. Rev. Protección Veg . 2013;28 (1): 36-44.). En el año 2011 se informó la identificación molecular del Pepper mottle virus (PepMoV) en este cultivo (66. Quiñones M, Arana F, Alfenas-Zerbini P, Soto M, Ribeiro D, Díaz A,et al. First report of Pepper mottle virus in sweet pepper in Cuba. New Disease Reports. 2011; 24:16.); sin embargo, no existen informes relacionados con la detección molecular de potyvirus en cultivos de tomate (Solanum lycopersicum L.), coliflor (Brassica oleracea var. capitata L.) y habichuela (Phaseolus vulgaris L. var. vulgaris).

Por otra parte, de acuerdo a varios estudios, uno de los métodos efectivos para manejar las enfermedades virales es la eliminación de las plantas arvenses que actúan como reservorios naturales del virus (77. Ayisah KD, Aziadekey MK, Gumedzoe YMD. Evaluation of Four Species of Wild Yams, as Potential Natural Reservoirs of Potyviruses Infecting Yams Cultivated in Togo. JAERI. 2019; 20(1): 1-9.). En el país, hasta la fecha, no se describen las especies de plantas arvenses presentes en el cultivo y que pueden constituir reservorios activos para la diseminación de los potyvirus.

Teniendo en cuenta los informes sobre la detección de potyvirus en cultivos de solanáceas de importancia económica en el país, la presencia de síntomas similares a los descritos para estas entidades en áreas de producción, se propuso como objetivo detectar la presencia de potyvirus en especies hortícolas y arvenses asociadas, en un área suburbana para el cultivo de hortalizas, mediante la RT-PCR con cebadores universales.

El estudio se realizó en el periodo comprendido entre 2017 y 2019, en la Cooperativa de Créditos y Servicios (CPA) “Las Piedras”, municipio Guanabacoa, provincia La Habana (ubicada en la Región Occidental del país, entre los 23°7′,30.6′′N y los 82°18′2.4′′ O), en un área de cultivo suburbana dedicada al cultivo de especies hortícolas.

Se recolectaron muestras foliares sintomáticas (cuyo número total se colocó entre paréntesis) de: pimiento (C. annum) (30), tomate (S. lycopersicum) (30), coliflor (B. oleracea var. capitata) (3) y habichuela (P. vulgaris var. vulgaris) (9). Las muestras presentaron síntomas que sugerían una posible infección ocasionada por potyvirus. Adicionalmente se recolectaron 30 muestras de especies arvenses asociadas a estos cultivos (tanto en la periferia como en el interior) que eran asintomáticas: Parthenium hysterophorus L. (22), Senna alata (L) (1), Ocimum sanctum L. (1), Bidens alba (L.) DC. (2), Portulaca oleracea L. (1), Euphorbia heterophylla L. (1), Amaranthus albus L. (1), Digitaria sanguinalis L. (Scop.) (1).

Inicialmente se realizó un análisis de la sintomatología presente en las especies hortícolas y luego se procedió a la extracción de ARN total, a partir de discos foliares según lo descrito por Singh (88. Singh RP, Nie X, Singh M, Coffin R, Duplessis P. Sodium sulphite inhibition of potato and cherry polyphenolics in nucleic acid extraction for virus detection by RT-PCR. J Virol Methods. 2002; 99:123-131.). La reacción de transcripción inversa se realizó con la enzima M-MLV (Promega), de acuerdo con las instrucciones de la casa comercial, utilizando, para la síntesis de los ADNc, 2 µl de ARN total y el cebador universal Potyvirid 1. En la reacción de PCR se utilizaron los oligonucleótidos degenerados Potyvirid 1 / Potyvirid 2 (99. Gibbs AJ, Mackenzie AM, Gibbs MJ. The ‘potyvirid primers’ will probably provide phylogenetically informative DNA fragments from all species of Potyviridae. J Virol Methods . 2003;112: 41-44.) que amplifican la región 3 del genoma viral de los potyvirus.

La mezcla de la reacción consistió en: 12,5 μl de Green Master Mix (Promega); 0,4 μM de cada oligonucleótido y 2 μl de ADN complementario [940 pg.μl^-1], en un volumen final de 25 μl. El programa de amplificación consistió en un paso inicial de desnaturalización a 94°C durante 2 min, seguida por 34 ciclos de reacción (30 seg a 94°C de desnaturalización, 1 min a 54°C de anillamiento con cebadores y 1 min a 72°C de extensión), seguido por un paso de extensión final durante 10 min a 72°C. Se utilizó, como control positivo, plantas de pimiento positivas a potyvirus y, como control negativo, plantas sanas de pimiento, mantenidas en condiciones controladas de casa de cristal. Los productos de la PCR (10 μl de cada producto) se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8 %, en tampón TBE 1X y teñido con 1 μg.ml^-1 de bromuro de etidio. Para determinar la talla aproximada de los productos se incluyó un marcador de peso molecular de 1000 pb (Promega).

Las plantas recolectadas presentaron síntomas generales que sugerían una infección causada por una entidad viral (Figura 1), de manera específica dichos síntomas podían ser asociados con especies pertenecientes al género Potyvirus.

En campo, las plantas de tomate presentaron enanismo, uno de los síntomas más comúnmente informados en plantas infectadas por virus y está condicionado por una disminución de la tasa de crecimiento de la planta (1010. Abubaker MYA, Gabbani MF, Elhassan SM. Occurrence and influence of Sudanese Onion Yellow Dwarf potyvirus isolates on the Common Bulbing Onion (Allium cepa L.). Asian Research Journal of Agriculture. 2018;1-18.). Otros síntomas detectados en las plantas de tomate (Figura 1 A) y pimiento (Figura 1 B) fueron: clorosis intensa, moteado y mosaico. La sintomatología observada coincide con la descrita para enfermedades causadas por especies pertenecientes al género Potyvirus; tal es el caso de Moran et al (1111. Moran J, van Rijswijk B, Traicevski V Kitajima, E, Mackenzie AM, Gibbs AJ. Potyviruses, novel and known, in cultivated and wild species of the family Apiaceae in Australia. Arch. Virol. 2002;147: 1855-1867.), quienes demostraron que los síntomas de moteado y clorosis intensa, en hojas de zanahoria, fueron ocasionados por el potyvirus Carrot virus Y.

Las muestras de coliflor presentaron enanismo y hojas moradas (Figura 1 C), mientras que, las muestras de habichuela mostraron clorosis y moteado intensos, mosaico y arrugamiento (resultados no mostrados). Estos síntomas coinciden con los informados por Zheng et al (1212. Zheng H, Chen J. Bean common mosaic virus isolates causing different symptoms in asparagus bean in China differ greatly in the 5- parts of their genomes, Arch Virol. 2002;147: 1257-1262.), quienes describieron la presencia de arrugamiento, mosaico y clorosis intensa, ocasionados por Bean common mosaic virus (BCMV), en Vigna sesquipedalis. La clorosis intensa en las hojas puede deberse a que el virus hace que disminuya la fotosíntesis de la planta al reducir el nivel de clorofila en la hoja (1313. Agrios GN. Plant Diseases caused by Viruses. En: Plant Pathology. Fifth Edition. Elsevier Academia Press. 2005; 724-820 p.).

En las plantas que son infectadas con virus, los síntomas más evidentes, generalmente, son los que aparecen sobre el follaje, aunque algunos virus producen síntomas visibles sobre el tallo, frutos o raíces, con o sin la evidencia de síntomas foliares (1313. Agrios GN. Plant Diseases caused by Viruses. En: Plant Pathology. Fifth Edition. Elsevier Academia Press. 2005; 724-820 p.). En la mayoría de las enfermedades virales de las plantas que aparecen en el campo, el virus está distribuido por toda la planta, en lo que se denomina como infección sistémica, de ahí que los síntomas producidos se designen como síntomas sistémicos (1313. Agrios GN. Plant Diseases caused by Viruses. En: Plant Pathology. Fifth Edition. Elsevier Academia Press. 2005; 724-820 p.).

La Figura 2 muestra, de forma representativa, los resultados del análisis por RT-PCR para la detección de Potyvirus. Se observó la presencia, de fragmentos de aproximadamente 1,6 Kb en las muestras evaluadas y en varias muestras de tomate y pimiento se observaron fragmentos adicionales de aproximadamente 0,6 kb, tal como está descrito para el uso de estos cebadores degenerados, correspondientes al genoma de los potyvirus cuya reacción puede amplificar fragmentos de aproximadamente 1,6-2 kb y también fragmentos adicionales que pueden ir desde 0,6-1kb, lo que puede ser un indicativo de la presencia de varias especies de potyvirus afectando una misma muestra (99. Gibbs AJ, Mackenzie AM, Gibbs MJ. The ‘potyvirid primers’ will probably provide phylogenetically informative DNA fragments from all species of Potyviridae. J Virol Methods . 2003;112: 41-44.).

Se obtuvo amplificación en las muestras de pimiento (100 %), tomate (100 %), coliflor (100 %) y habichuela (22,2 %) y en las plantas arvenses: Senna alata (L), Euphorbia heterophylla L., Portulaca oleracea L. y Parthenium hysterophorus L. (Fig. 2)

Estos resultados constituyen la primera evidencia molecular de la presencia, en Cuba, de potyvirus en cultivos de tomate, coliflor y habichuela, así como en las especies de arvenses: S. alata, E. heterophylla, P. oleracea y P. hysterophorus.

La presencia de potyvirus en tomate y pimiento coincide con lo informado por otros autores que identificaron, dentro de este género, especies como el Virus Y de la papa (PVY), capaz de causar grandes pérdidas en estos cultivos y en otros como Solanum tuberosum L. y Nicotiana sp. (1414. Hancinský R, Mihálik D, Mrkvová M, Candresse T, Glasa M. Plant Viruses Infecting Solanaceae Family Members in the Cultivated and Wild Environments: A Review.Plants. 2020; 9(5):667.). De igual forma, coinciden con los detectados previamente en el país para la presencia de potyvirus en plantas de pimiento con síntomas (44 . Arana F, Martínez MA, Piñol B, Duarte L, Pacheco R, Quiñones M. Detección de potyvirus en plantas de pimiento (Capsicum annuum L.) y áfidos asociados al cultivo en Cuba. Rev. Protección Veg. 2015; 30(3 ): 235-238.), con el uso de cebadores genéricos, además del informe de PepMoV (55. Quiñones M, Martínez Y, Arana F. Coexistencia de potyvirus y begomovirus en el cultivo del pimiento (Capsicum annuum L.) en Cuba. Rev. Protección Veg . 2013;28 (1): 36-44.) en el cultivo del pimiento.

En el caso de la habichuela, los resultados del presente trabajo coinciden con lo informado por otros autores que identificaron al potyvirus Bean common mosaic virus (BCMV) en plantas de esta especie (1515. Johary T, Dizadji A, Naderpour M. Biological and molecular characteristics of Bean Common Mosacic Virus isolates circulating in Common bean in Iran. Journal of Plant Pathology. 2016; 98(2):301-310.), además de su detección en otras legumbres como Vigna sp. (1616. Konate MN, Ouedraogo M, Neya BJ, Bangratz M, Palanga E, et al. Molecular characterization of virus isolates from genus Potyvirus infecting Vigna subterranea in Burkina Faso. Afr. J. Biotechnol. 2017; 16(39): 1953-1961.).

Por otra parte, varios informes describen especies de plantas arvenses como hospedantes de potyvirus (77. Ayisah KD, Aziadekey MK, Gumedzoe YMD. Evaluation of Four Species of Wild Yams, as Potential Natural Reservoirs of Potyviruses Infecting Yams Cultivated in Togo. JAERI. 2019; 20(1): 1-9.,1414. Hancinský R, Mihálik D, Mrkvová M, Candresse T, Glasa M. Plant Viruses Infecting Solanaceae Family Members in the Cultivated and Wild Environments: A Review.Plants. 2020; 9(5):667.), aun sin presentar síntomas visibles de la enfermedad. Las plantas arvenses juegan un papel importante como reservorio activo del virus y se plantea que la densidad de este alrededor del cultivo contribuye a la propagación de las enfermedades virales.

Los resultados obtenidos son relevantes, pues constituyen un paso de avance en las investigaciones que se llevan a cabo en el país sobre el estudio de la familia Potyviridae que afecta diversos cultivos y que causa enfermedades virales emergentes a nivel mundial. Además, permiten fortalecer las medidas para el manejo de estas entidades en los cultivos hortícolas de Cuba, por lo que se recomienda completar otros estudios para la identificación y caracterización de las especies de Potyvirus presentes en el área.