El cultivo de la papa (Solanum tuberosum L.) es originario de los Andes y constituye una de las contribuciones más importantes de la región andina, por ser uno de los alimentos más consumido, apreciado y por favorecer, de manera decisiva, a la seguridad alimentaria de toda la humanidad (11. Ministerio de la Agricultura (MINAG). Instructivo Técnico para la producción de papa en Cuba. Dirección de Agricultura. Editorial Ministerio de Agricultura. La Habana, Cuba. 2016; 62., 22. Hernández-Mansilla A, Sorí-Gómez R, González-Alfonso D, López-Mayea A. Escenarios bioclimáticos para el tizón tardío [Phytophthora infestans (Mont.) De Bary] y tizón temprano (Alternaria solani Sorauer.) de la papa en Cuba. Revista Latinoamericana de la Papa. 2017; 21(1): 55 - 72.). La incidencia de enfermedades es uno de los factores que limita la producción del cultivo de la papa en la mayoría de los países tropicales. Entre estas, el Tizón temprano, causado por el hongo Alternaria solani Sorauer, es una de las enfermedades más significativas del cultivo a nivel mundial (33. Centre for Agriculture and Biosciences International (CABI). January 2018. Alternaria solani (Early blight of potato and tomato). Invasive Species Compendium. En: En:https://www.cabi.org/isc/datasheet/4528#totaxonomicTree Consulta: Febrero 2018.), con pérdidas de hasta 30 % del rendimiento (44. Acuña B, Sandoval C. Enfermedades de la papa: Tizón temprano de la papa. INIA. Ficha Técnica 49. 2017.). En Cuba, las pérdidas estimadas se encuentran entre 17 y 37 % (11. Ministerio de la Agricultura (MINAG). Instructivo Técnico para la producción de papa en Cuba. Dirección de Agricultura. Editorial Ministerio de Agricultura. La Habana, Cuba. 2016; 62.), en áreas con condiciones climáticas favorables para el desarrollo de la enfermedad.
No obstante a los conocimientos existentes sobre la enfermedad y su control, esta es uno de los principales factores limitantes de la producción de papa en el mundo (55. Hollingshead K. Control of Alternaria solani Resistance to Boscalid, Fluopyram, and Chlorothalonil. A Thesis submitted to the Faculty of Brigham Young University in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science. 2015; 1-50., 66. Pérez S, Solórzano E, Sosa C, Martínez B. Induction of tomato resistance to Alternaria solani Sor. by biological and chemical activators in the field. Rev. ProtecciónVeg. 2016; 31(3): 201-212., 77. Ahmed A. Biological control of potato brown leaf spot disease caused by Alternaria alternate using Brevibacillus formosus strain DSM 9885 and Brevibacillus brevis strain NBRC 15304. J Plant Pathol Microbiol. 2017;8(6):1-8.). La necesidad de disminuir los plaguicidas que afectan al ecosistema justifica plenamente la búsqueda de otros métodos menos agresivos para el control de A. solani, como son los Agentes de Control Biológico (ACB) y dentro de estos se destacan aislamientos del género Trichoderma spp.
En la actualidad, existen cepas antagonistas de Trichoderma caracterizadas patogénicamente frente a un amplio grupo de hongos causantes de enfermedades en cultivos de importancia económica, pero muy pocas ante A. solani. Es por ello que se propuso como objetivo de este trabajo seleccionar cepas de Trichoderma eficaces frente A. solani por su antagonismo in vitro, con perspectivas para su evaluación posterior en condiciones de campo en el control del Tizón temprano en papa.
El trabajo se realizó en el Laboratorio de Micología Vegetal (LMV) del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) (Latitud 22,991867; Longitud -82,153892), provincia Mayabeque, Cuba.
Las cepas de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg usadas (Ta.1, Ta. 3, Ta. 12, Ta. 13, Ta. 17, Ta. 25, Ta. 28, Ta. 52, Ta. 75, Ta. 78, Ta. 79, Ta. 85 y Ta. 90) proceden de la Colección del Laboratorio de Micología Vegetal (CLMV) del CENSA y previamente se caracterizaron morfofisiológica (88. Infante D, Reyes Y, Peteira B, Martínez B. Variabilidad fisiológica y patogénica de cepas de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg. Métodos en Ecología y Sistemática. 2015;10(3):41-59.), molecular y patogénicamente frente a diferentes dianas (99. Infante D, Reyes Y, Gonzalez N, Martínez B. Molecular identification of thirteen isolates of Trichoderma spp. and evaluation of their pathogenicity towards Rhizoctonia solani Kühn. Biotecnología Aplicada. 2013;30:23-28.).
Los cultivos usados partieron de tubos con las cepas conservadas a 4oC y se sembraron fragmentos de micelio de las colonias en placas Petri con medio Agar Malta (AM) (BIOCEN) pH 5,6±0,2 durante 72 h a 30±1°C y oscuridad.
Se usó el aislamiento altamente patogénico de A. solani No. 160 (número de catálogo en el CLMV de Alternaria spp.), previamente aislado de hojas de papa con síntomas típicos de Tizón temprano, procedente de la provincia Las Tunas, Cuba. El aislamiento se purificó mediante la siembra de fragmentos de micelio del mismo en placas Petri con medio Papa Dextrosa Agar (PDA) (BIOCEN) pH 5,6 durante siete días a temperatura de 28±1°C y oscuridad. La patogenicidad de este aislado se reactivó en hojas sanas de papa cv. Romano de 25 días de edad; para ello se inocularon cuatro hojas, dos por el haz y dos por el envés, con discos del patógeno obtenido a partir de las colonias desarrolladas del primer subcultivo. Las hojas se incubaron en cámara húmeda a temperatura de 23±2ºC. Con la aparición de los síntomas en las hojas y el desarrollo del hongo sobre el tejido vegetal, se realizó el reaislamiento del hongo, al que se le comprobó su identidad según la clave descrita por Simmons (1010. Simmons G. Alternaria themes and variations (244-286) species on Solanaceae. Mycotaxon. 2000;LXXV:1-15.).
Los inóculos de los hongos (fitopatógeno y antagonistas) consistieron en discos de 5 mm de diámetro, que se tomaron a partir de la periferia de las colonias de los mismos, inoculados en placas Petri contentivas de los medios descritos anteriormente para cada organismo. Todas las placas inoculadas con estos se incubaron a 30±1°C y a oscuridad.
Se evaluó el efecto antagónico de las cepas de T. asperellum frente a A. solani por la técnica de Cultivo Dual (CD) (1111. Bell K, Wells D, Markam R. In vitro antagonism of Trichoderma spp. against six fungal pathogens. Phytopathology. 1982;72(4):379-382.), según diseño completamente al azar. Se seleccionaron para cada cepa tres placas Petri (90 mm de Ø) que contenían medio de cultivo PDA. En una placa se sembraron dos discos (ambos de 5 mm) de micelio de las colonias de Trichoderma y del patógeno, diametralmente opuestos, a una distancia aproximada de 5 mm del borde de la placa. Las placas sembradas con ambos hongos se sellaron con papel parafilm. Como control se usaron placas (tres) sembradas con el patógeno, de igual manera que las anteriores, pero sin el antagonista. Las placas se incubaron a 30±1°C y a oscuridad.
Las evaluaciones del crecimiento (radio en mm) de ambos hongos se realizaron con una regla graduada, a las 16, 40, 48, 64, 72, 88, 96, 160, 184, 208, 232, 328, 352 y 400 h. Se evaluaron los modos de acción: antibiosis, competencia por espacio y micoparasitismo.
Se midió el crecimiento lineal (mm) de la colonia de A. solani con una regla graduada hasta las 72 h. La antibiosis se determinó al comparar el crecimiento del patógeno en el CD en el momento del contacto físico de ambos hongos, con el del control (1212. Martínez B, Solano T. Antagonismo de Trichoderma spp. frente a Alternaria solani (Ellis y Martin) Jones y Grout. Rev. Protección Veg.1995;10:221-225.). Los datos se procesaron a través de un ANOVA simple y las medias se compararon mediante la Prueba de LSD Fisher (p≤0,05). El criterio de selección para este modo de acción se definió como 3 mm, basado en el cálculo del intervalo de confianza de la media, para p=0,05.
Se evaluó el porcentaje de área ocupada por el antagonista y el patógeno. Se clasificaron las cepas de T. asperellum en base a su antagonismo, según la escala de clase referida por Bell et al. (1111. Bell K, Wells D, Markam R. In vitro antagonism of Trichoderma spp. against six fungal pathogens. Phytopathology. 1982;72(4):379-382.). A las 96 horas se determinó el Porcentaje de Inhibición del Crecimiento Radial del patógeno (PICR) según la fórmula:
Donde R1 es el radio del patógeno control y R2 es el radio del patógeno en enfrentamiento.
Los datos de porcentaje de área ocupada se analizaron mediante un ANOVA y las medias se compararon por los rangos múltiples de Duncan, p≤0,05.
Para observar las interacciones hifales en el micoparasitismo (enrollamiento, penetración, vacuolización y lisis), se tomaron al azar tres muestras de la zona de interacción de ambos hongos por cada réplica (placa Petri) a las 96 h, y se colocaron en portaobjetos sobre una gota de lactofenol. Las observaciones se realizaron en un microscopio Zeiss (400/630x) con sistema de foto documentación KSS. Además, se evaluó el efecto del crecimiento del antagonista sobre el patógeno a partir de las 96 hasta las 400 h. Los datos se compararon con los del control mediante la prueba T de Student para ese mismo tiempo de evaluación. Se realizaron curvas de regresión con los datos de las cepas de T. asperellum que tuvieron diferencias significativas.
Para la selección de las cepas, según el modo de acción, se tuvieron en cuenta los siguientes criterios:
Ubicación de la cepa en el grado 1 de la escala de Bell et al.
Efecto de antibiosis con al menos 3 mm de inhibición del crecimiento del patógeno.
Antagonista con tres o más interacciones hifales con el patógeno.
Análisis de los datos: para el procesamiento de los datos en todos los experimentos se tabularon en Microsoft Excel y se usó el paquete estadístico InfoStat versión 2016 (1313. Di Rienzo J, Balzarini M, Casanoves F, González L, Tablada M, Walter R. InfoStat versión 1.1. Grupo InfoStat, FCA, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. 2016.).
Todas las cepas de T. asperellum mostraron efecto de antibiosis frente a A. solani, pero hubo diferencias en la inhibición del crecimiento del patógeno, basado en la liberación de metabolitos antes del contacto hifal entre los dos hongos, sobresaliendo un grupo de 10 cepas que no presentan diferencias significativas entre ellas (Tabla 1).
Este efecto es más evidente en las cepas Ta. 90 (Fig. 1), Ta. 78, Ta. 75 y Ta. 85, cuya reducción equivale al crecimiento del control durante 24 h.
Esta inhibición del crecimiento del patógeno pudiera estar relacionada con la acción de metabolitos volátiles y no volátiles como: enzimas (quitinasas, glucanasas, celulasas, xylanasas, laminarinasas, esterasas, glucosidasas, lipasas y proteasas), toxinas (6-pentil- α- pirona), antibióticos (gliotoxina, viridina, gliovirina), hormonas (ácido-3-indolacético, ácido Indolbutírico, L-triptófano, etileno, auxinas y giberelinas) como notificaron Romero et al. (1414. Romero T, López-Pérez A, Ramírez-Lepe M, Cuervo-Parra A. Modelado cinético del micoparasitismo por Trichoderma harzianum contra Cladosporium cladosporioides aislado de frutos de cacao (Theobroma cacao). Chilean J. Agric. Anim. Sci., exAgro-Ciencia. 2015; 31(3): 32-45.) y Hernández et al. (1515. Hernández O, Castillo D, Herrera R, Fuentes E, Drouaillet E, Santillán A. Actividad antagónica de Trichoderma spp. sobre Rhizoctonia solani in vitro. Investigación y Ciencia. 2016;24(67):5-11.), entre otros. Este modo de acción aumenta su relevancia práctica, ya que Trichoderma, al colonizar las raíces de las plantas y libere estos compuestos tóxicos al patógeno, puede hacer que la planta escape a la penetración y colonización del mismo, o que su daño sea menor. Este efecto en el follaje pudiera detectarse también durante el proceso de germinación de las esporas del antagonista, al liberarse algunos de estos metabolitos, que limiten la germinación o el crecimiento del fitopatógeno (1616. Pérez N. Control biológico de Alternaria porri (Ellis) Cif. en cebolla con Trichoderma spp. p.89-107. En: Gomero L. y Tazza M. (eds.), Innovación de Tecnologías Ecológicas para el Agro en América Latina. 2001; Resultados del Primer Congreso Latinoamericano. RAP-AL, Lima, Perú.).
Medias con letras diferentes difieren significativamente (p≤0,05, según dócima de LSD Fisher).
Este mecanismo de control en Trichoderma es evidente, ya que se puede observar aún sin estar en contacto con el patógeno; además, las enzimas hidrolíticas presentes en este favorecen la penetración y el saprofitismo.
Los resultados ratifican esta acción y muestran el importante papel que puede desempeñar Trichoderma como agente de control biológico; en este caso para el control de A. solani, cuyo manejo en la actualidad no es lo suficientemente eficiente (55. Hollingshead K. Control of Alternaria solani Resistance to Boscalid, Fluopyram, and Chlorothalonil. A Thesis submitted to the Faculty of Brigham Young University in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science. 2015; 1-50.).
Las cepas de T. asperellum presentaron efecto antagonista positivo con alta competencia por el espacio (Tabla 2). Es de destacar que la velocidad de crecimiento de las cepas de T. asperellum varió entre 0,77 y 0,69 mm.h-1, mientras que la de A. solani fue de 0,17 mm.h-1. Esta diferencia en la velocidad de crecimiento entre el antagonista y el patógeno es la causa fundamental para que Trichoderma ocupe rápidamente gran parte del área de la placa. No obstante, este proceso se favorece por la gama de metabolitos que presenta este antagonista con los que logra limitar el avance del patógeno.
Entre las cepas de Trichoderma se observaron diferencias significativas en cuanto al área que ocuparon sus colonias en la placa; se destacan las cepas Ta. 1, Ta. 3, Ta. 12, Ta. 25 y Ta. 85 (Tabla 2). A partir de las 72 h, las cepas de Trichoderma comenzaron a crecer sobre la colonia del patógeno y, en este caso, también hubo diferencias entre ellas. Las cepas Ta. 3, Ta. 17, Ta. 28, Ta. 78, Ta. 85 y Ta. 90 tuvieron mayor crecimiento (≥ 80 %) sobre el patógeno. De acuerdo con estos resultados, la mayoría de las cepas evaluadas se ubica en el grado 2 de la escala de Bell et al.; solo la cepa Ta. 85 alcanzó el grado 1 (Tabla 2). El análisis del PICR mostró que este varió entre 36,62 y 54,45, donde sobresalieron con resultados superiores a 50 % las cepas Ta. 75, Ta. 78, Ta. 79 y Ta. 85. Los resultados demuestran que T. asperellum es un buen competidor por espacio frente a A. solani y el importante papel que tiene la cepa del antagonista en el control de este fitopatógeno, lo que justifica la necesidad de la selección de aislamientos como agentes de control promisorios.
Estos resultados coinciden con los obtenidos por Martínez et al. (1717. Martínez B, Obret Y, Pérez S, Reyes Y. Antagonismo in vitro de cepas de Trichoderma spp. frente a Sarocladium oryzae (Sawada) W. Gams & D. Hawksworth. Rev. Protección Veg . 2014;29(2):106-111.), quienes observaron aislamientos de Trichoderma spp. con actividad inhibitoria del crecimiento de Sarocladium oryzae (Sawada) Gams y Haswks. Los resultados reafirmaron los de Khaliq et al. (1818. Khaliq A, Khan H, Khan N, Zada L, Ali M, Zahoor M, et al. In vitro efficacy of Trichoderma harzianum Rifai against various isolates of Alternaria sp. Journal of Entomology and Zoology Studies. 2017; 5(1): 442-445.) y Kayim et al. (1919. Kayim M, Yones M, Endes A. Biocontrol of Alternaria alternata causing leaf spot disease on faba bean (Vicia faba L.) using some Trichoderma harzianum isolates under in vitro condition. Harran Tarım ve Gıda Bilimleri Dergisi. 2018; 22(2): 169-178.), al informar alta capacidad competitiva (más de 70 %) de aislamientos de T. harzianum frente a Alternaria spp. in vitro.
Los resultados de esta investigación contrastan con los de Hernández et al. (1515. Hernández O, Castillo D, Herrera R, Fuentes E, Drouaillet E, Santillán A. Actividad antagónica de Trichoderma spp. sobre Rhizoctonia solani in vitro. Investigación y Ciencia. 2016;24(67):5-11.), pues notificaron que 14 de 31 aislados de Trichoderma spp. mostraron el máximo efecto competitivo (clase 1 de la escala mencionada); es decir, más de 45 % de los aislamientos; mientras que, en el presente trabajo, solo alcanzó el 7,69 %. Es probable que esta diferencia se deba a que el fitopatógeno diana (Rhizoctonia solani Kühn) y/o las cepas del antagonista no fueron los mismos a los del presente trabajo.
Teniendo en cuenta los criterios que consideran que la competencia por espacio o por nutrientes es uno de los mecanismos básicos del control de Trichoderma, las cepas de T. asperellum evaluadas con alta capacidad competitiva podrían tener resultados positivos, como controladores biológicos de A. solani en campo.
Medias con letras diferentes difieren significativamente (p≤0,05, según dócima de Duncan)
Las cepas Ta. 12, Ta. 13, Ta. 28, Ta. 56 y Ta. 85 (Tabla 3) presentaron tres o más interacciones hifales frente a A. solani. Las interacciones hifales más observadas fueron la vacuolización, penetración y granulación. (Tabla 3, Fig. 2)
Los resultados de las observaciones microscópicas sugieren la posible presencia de enzimas extracelulares del antagonista con actividad lítica sobre las hifas del patógeno. En diferentes investigaciones se mostraron evidencias de la producción de enzimas líticas (quitinasas, ß-1,3-glucanasas, ß-1,6-glucanasas y proteasas, entre otras) por especies de Trichoderma que contribuyen a la degradación de las paredes celulares de los microrganismos patógenos (2020. Acosta-Suárez M, Pichardo T, Roque B, Cruz-Martín M, Mena E, Leiva-Mora M, et al. Antagonismo in vitro de Trichoderma harzianum Rifai contra Mycosphaerella fijiensis Morelet. Biotecnología Vegetal. 2013;13(4):231-235.).
Esta podría ser una de las causas por la cual varias cepas de las de T. asperellum evaluadas exhibieron estos resultados, pues previamente se demostró que poseen actividades ß-1,3-glucanasas y quitinasas (2121. González I, Infante D, Martínez B, Arias Y, González N, Miranda I, et al. Induction of chitinases and glucanases in Trichoderma spp. strains intended for biological control. Biotecnología Aplicada 2012;29: 12-16.). No obstante, es necesario profundizar en este aspecto y en la identificación de las enzimas que puedan estar presentes en la interacción T. asperellum y A. solani.
Estos resultados se asemejan a los obtenidos por Mokhtar y Dehimat (2222. Mokhtar H, Dehimat A. Antagonism capability in vitro of Trichoderma harzianum against some pathogenic fungi. Agric. Biol. J. N. Am. 2012;3(11): 452-460.), que observaron que los aislamientos de T. Harzianum ocasionaron lisis y parasitismo en las paredes de Cladosporium sp. y Stemphyllium botryosum Wallroth; sin embargo, estos autores no hacen referencia a la vacuolización y granulación.
Leyenda: (V), Vacuolización, (G) Granulación, (L) Lisis y (P) Penetración
Los análisis de la prueba T de Student mostraron que ocho de las cepas de T. asperellum (Ta. 1, Ta. 3, Ta. 12, Ta. 13, Ta. 25, Ta. 28, Ta. 56 y Ta. 85) provocaron reducción significativa del área ocupada por el patógeno a las 400 h, con relación al tamaño de la propia colonia del patógeno a las 96 h, con tendencia a su eliminación con el tiempo, según se aprecia en las ecuaciones de regresión (Fig. 3). Se destaca la cepa Ta. 85 con la mayor reducción de esta, con una confiabilidad de R2 0,99, le siguen la Ta. 1 y Ta. 12, con 0,89 y 0,86, respectivamente. Se puede inferir que en esta interacción antagonista-patógeno predomina el micoparasitismo, aunque debe intervenir también la actividad enzimática de los aislamientos, para que se degrade la pared de las hifas del patógeno y puedan penetrar las del antagonista y, así, provocar la disminución del tamaño de la colonia de A. solani en el tiempo de la interacción. Es posible que esto tenga relación con lo demostrado por Shafique et al. (2323. Shafique S, Shafique S, Javed A, Akhtar N, Bibi S. Analysis of Antagonistic Potential of Secondary Metabolites and Organic Fractions of Trichoderma Species Against Alternaria Alternata . Biocontrol Science. 2019; 24 (2): 81-88.), quienes observaron que los metabolitos de Trichoderma koningii Rifai fueron capaces de reducir la biomasa de Alternaria alternata (Fr.) Keissl. entre 10-90 %. Este resultado tiene valiosa importancia desde el punto de vista del desarrollo del antagonismo, pues en condiciones de campo los fitopatógenos, casi siempre preceden, en posicionamiento físico del área, a los ACB, por lo que cepas con estas características tienen la capacidad de reducir el espacio ocupado por estos, dándole ventajas a la planta en su enfrentamiento ante estos patógenos.
Independientemente de la información existente acerca de las especies de Trichoderma como antagonistas de varios hongos fitopatógenos (2424. Idrees S, Chohan S, Abid M, Perveen R, Malik MT. Biological potential of Trichoderma species in the control of some phytopathogenic fungi. Pak. J. Phytopathol. 2019; 31 (02): 201-206.), en la práctica es necesario realizar una selección exhaustiva del agente controlador frente a cada patógeno diana, antes de ser aplicado en condiciones de campo (2525. Reyes Y, Infante D, Martínez B. Eficacia de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg para el control de Rhizoctonia solani Kühn en condiciones de campo. Rev. Protección Veg . 2016; 31(2): 107-113.).
El establecimiento in vitro de los modos de acción presentes en los aislamientos de Trichoderma constituye la base de la selección de estos, no solo para las pruebas posteriores en condiciones semicontroladas y/o campo, sino como orientación de la forma de producción que se debe realizar para lograr mayor estabilidad y eficacia en los resultados en campo.
El análisis integral de los resultados obtenidos, sobre la base a los criterios de selección establecidos y al decrecimiento ocasionado posterior al contacto con el patógeno, demostró que la cepa Ta. 85 cumplió con todos los criterios y ocasionó la mayor reducción de la colonia de A. solani poscontacto, por lo que se seleccionó como la cepa más promisoria. No obstante, las cepas Ta. 28, Ta. 56 y Ta. 13 pudieran ser consideradas para su evaluación en condiciones de campo.