El cacao (Theobroma cacao L.) es uno de los cultivos tropicales más importantes a nivel mundial. Las semillas de cacao son la fuente del chocolate y la manteca de cacao (11. Marelli JP, Guest DI, Bailey BA, Evans HC, Brown JK, Junaid M, et al. Chocolate under threat from old and new cacao diseases. Phytopathology. 2019; 109 (8):1331-1343.). Actualmente, la industria chocolatera mundial es valorada en 103 billones USD/año (22. Zion Market Research. Chocolate market by type of chocolate (dark, milk and white) and by sales category (everyday chocolate, premium chocolate and seasonal chocolate): Global industry perspective, comprehensive analysis and forecast 2017-2024. 2018; http://www.zionmarketresearch.com/report/chocolate-market.).

El mayor factor limitante a nivel mundial de la producción en el cultivo de cacao es una trilogía de importantes enfermedades (33. Ploetz RC. The Impact of diseases on cacao production: A global overview. Part I, Chapter 2, In: B. A. Bailey.; L.W. Meinhardt (eds.). Cacao Diseases: A History of Old Enemies and New Encounters. Springer International Publishing Switzerland. 2016; 33-59.): la pudrición negra de la mazorca, causada por Phytophthora palmivora (E. J. Butler) E. J. Butler, Phytophthora megakarya Brasier& M.J. Griffin, Phytophthora capsici Leonian y Phytophthora citrophthora (R.H. Sm. & E. Sm.) Leonian (44. Bailey BA, Meinhardt LW. Cacao Diseases: A History of Old Enemies and New Encounters. Springer Cham Heidelberg New York Dordrecht London. 2016; 630 pp.), enfermedad que más afecta la producción globalmente; así como la escoba de brujas, provocada por Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime y la moniliasis, cuyo agente etiológico es Moniliophthora roreri H.C. Evans et al., las cuales tienen el potencial de devastar el suministro mundial de cacao si se diseminan fuera de América (55. Evans HC. Frosty pod rot (Moniliophthora roreri) Part II, Chapter 3, In: B. A. Bailey .; L.W. Meinhardt (eds.). Cacao Diseases: A History of Old Enemies and New Encounters. Springer International Publishing Switzerland. 2016; 63-96.).

Una de las alternativas más utilizadas para enfrentar este ataque fúngico es el uso de microorganismos biocontroladores, con el objetivo de disminuir el uso de agroquímicos, debido a su impacto negativo sobre el medio ambiente (66. Qiao J, Wu H, Huo R, Gao X, Borriss R. Stimulation and biocontrol by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 engineered for improved action. Chem. Biol. Technol. Agric. 2014;1(12): 2-14.), por lo que constantemente se buscan nuevas cepas con estas potencialidades.

El género Bacillus incluye bacterias endófitas formadoras de endosporas, miembros de la Clase Bacilli, que contribuyen al crecimiento y la bioprotección de varias especies vegetales (77. Prameela Jha, Panwar J, Nath Jha P. Mechanistic insights on plant root colonization by bacterial endophytes: a symbiotic relationship for sustainable agriculture. Environmental Sustainability. 2018; 1:25-38.). Entre los principales mecanismos de acción que presentan se encuentran la excreción de antibióticos, toxinas, sideróforos, enzimas líticas e inducción de resistencia sistémica en la planta (88. Olanrewaju OS, Glic BR, Babalola OO. Mechanisms of action of plant growth promoting bacteria. World J. Microbiol. Biotechnol. 2017; 33(11):197., 99. Singh M, Singh D, Gupta A, Pandey KD, Singh PK, Kumar A. Plant Growth Promoting Rhizobacteria: Application in Biofertilizers and Biocontrol of Phytopathogens. Chapterthree. In: PGPR Amelioration in Sustainable Agriculture. 2019; 41-66.).

Entre los ingredientes activos de bioplaguicidas microbianos disponibles comercialmente, Bacillus es el más explotado en el sector agrícola, con 85 % de los productos bacterianos, debido a su gran versatilidad metabólica, que le permite llevar a cabo el control biológico de plagas por diversos mecanismos. Además, este género bacteriano es capaz de producir endosporas, principal ingrediente activo de los formulados, que le confiere mayor viabilidad en el tiempo (1010. Ongena M, Jacques P. Bacillus lipopeptides: Versatile Weapons for Plant Disease Biocontrol. Trends in Microbiology. 2008; 16: 115-125.). En la actualidad, en el mercado mundial se encuentran disponibles varios bioplaguicidas a base de cepas de Bacillus spp., entre ellos: Double Nickel LC (B. amyloliquefaciens cepa D747), Pro-MixBiofungicide (B. subtilis cepa MBI 600), Serenade Garden (B. subtilis cepa QST 713), Sonata (B. pumilus cepa QST 2808) y EcoGuard-GN (B. licheniformis SB3086), entre otros. Estos formulados se usan fundamentalmente para la prevención de, por lo menos, ocho agentes patógenos, en más de 20 cultivos agrícolas (1111. Thakur P, Singh I. Biocontrol of soilborne root pathogens: An Overview. In: B. Giri, et al. (eds.), Root Biology, Soil Biology 52, Springer International Publishing AG, part of Springer Nature. 2018;184-185.).

Los objetivos de este trabajo fueron determinar el efecto antagonista de cepas de bacterias endófitas formadoras de endosporas frente a Moniliophthora roreri H.C Evans et al. así como su identificación.

La presente investigación se desarrolló en el Laboratorio de Fitopatología del Departamento de Protección Vegetal de la Estación Experimental Tropical Pichilingue, perteneciente al Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), Ecuador. La Estación se encuentra situada en el km 5 vía Quevedo, perteneciente al Cantón Mocache, provincia Los Ríos; geográficamente ubicada en 1° 05' de Latitud Sur y 79° 26' de Longitud Oeste, a una altitud promedio de 75 m.s.n.m. Se aislaron bacterias endófitas formadoras de endosporas a partir de mazorcas del cultivar de cacao Criollo tipo Nacional, sin síntomas aparente de la enfermedad. Los procesos de desinfección de la mazorca, aislamiento y verificación de la formación de endosporas se realizaron por el método descrito por Melnick et al. (1212. Melnick RL, Suarez C, Bailey BA, Backman PA. Isolation of endophytic endospore-forming bacteria from Theobroma cacao as potential biological control agents of cacao diseases. Biological Control. 2011; 57: 236-245.). La cepa de M. roreri utilizada se aisló a partir de mazorcas del clon de cacao EET-103 tipo Nacional (Susceptible), con síntomas típicos de moniliasis, y pertenece a la colección de cultivos microbianos del laboratorio de Fitopatología de la Estación Experimental Tropical Pichilingue.

La evaluación de la actividad antagónica in vitro de las bacterias frente a M. roreri se realizó en placas Petri de 90 mm de diámetro con medio de cultivo Papa-Dextrosa-Agar (PDA) (Difco). En los extremos de la placa se colocaron discos de 5 mm de diámetro de micelio de M. roreri que se pusieron a crecer a 25±1ºC y oscuridad durante 15 días (1313. Reyes O, Ortiz CF, Torres M, Lagunes L, Valdovinos G. Especies de Trichoderma del agroecosistema cacao con potencial de biocontrol sobre Moniliophthora roreri. Rev. Chapingo. Serie Ciencias Forestales y del Ambiente. 2016; 22(2):149-163.). Transcurrido ese tiempo de incubación, en el centro de las placas se realizó la siembra de la bacteria con un hisopo estéril embebido en una suspensión de 10⁸ células ml^-1. También se sembraron discos de micelio de 5 mm de M. roreri en los extremos de las placas con PDA sin la bacteria, como tratamiento control. Finalmente, todos los cultivos se incubaron a 28±1ºC y oscuridad. (Fig. 1)

El experimento se realizó bajo un diseño completamente aleatorizado con cinco repeticiones por tratamiento (aislado de bacterias endófitas) y control (M. roreri).

Se midió el crecimiento de la colonia de M. roreri y se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) para cada tratamiento, mediante la fórmula descrita por Melnick et al. (1212. Melnick RL, Suarez C, Bailey BA, Backman PA. Isolation of endophytic endospore-forming bacteria from Theobroma cacao as potential biological control agents of cacao diseases. Biological Control. 2011; 57: 236-245.). Las evaluaciones se realizaron cada 24 horas hasta los 15 días.

Los datos correspondientes al porcentaje de inhibición del crecimiento radial del hongo fitopatógeno se procesaron mediante un análisis de conglomerado jerárquico, empleando la distancia Euclidiana y el método de Ward, para lo que se utilizó el paquete estadístico Statistica versión 12.0 sobre Windows (1414. StatSoft, Inc. (2014). STATISTICA (data analysis software system), version 12. http://www.statsoft.com.).

La descripción de los caracteres culturales, morfológicos (forma, agrupación y respuesta a la tinción) y fisiológicos de las bacterias se realizó mediante tinciones simples y tinción de Gram, a través de observaciones al microscopio óptico (Karl Zeiss, Alemania) con aumento 1000 x (1515. Cruz M. Potencial de cepas de Bacillus spp. aisladas de la filosfera de Musa spp. como agentes de biocontrol de Mycosphaerella fijiensis Morelet. [Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Agrícolas]. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. 2015; 100 pp.). A los aislados bacilos Gram positivos se les realizó la prueba de la catalasa (1616. Reiner K. Catalase test protocol. American Society for Microbiology, ASM Microbe Library. 2010.).

Los 45 aislados bacterianos obtenidos tuvieron actividad antifúngica frente a M. roreri. El agrupamiento de las mismas dependió de los valores de Porcentaje de Inhibición del Crecimiento Radial (PICR) que mostraron al enfrentarlas con M. roreri.

El análisis de clúster evidenció que los grupos formados se empiezan a ramificar a distancias muy bajas, lo que indica que estos son compactos y que la diversidad intragrupos es muy baja. (Fig. 2)

Al realizar un corte de hasta 10 % al dendrograma, se observa la formación de dos grupos. El grupo 1 aglomeró 23 aislados, que representan el 51,1 % del total y el grupo 2 22 aislados (48,9 %). Además, en el grupo 1 se ubicaron los aislados que mostraron el mayor efecto antagonista sobre el hongo patógeno al alcanzar un PICR entre 53,8-73,8 %; mientras que, en el grupo 2 se situaron los aislados con menor actividad antagónica, al solo alcanzar valores de PICR (2,8 - 47,2 %). (Fig. 2)

En la literatura científica consultada son escasas las investigaciones realizadas con bacterias endófitas como agentes de control biológico en el patosistema T. cacao - M. roreri. Hasta la fecha, solo se informan los trabajos realizados por Melnick et al. (1212. Melnick RL, Suarez C, Bailey BA, Backman PA. Isolation of endophytic endospore-forming bacteria from Theobroma cacao as potential biological control agents of cacao diseases. Biological Control. 2011; 57: 236-245.), quienes evaluaron in vitro la acción antagónica de 69 bacterias endófitas formadoras de endosporas aisladas de diferentes órganos de plantas de T. cacao, contra tres hongos patógenos que afectan las mazorcas en este árbol. Estos autores obtuvieron que el 42 % de los aislados inhibió a M. roreri, 33 % a M. perniciosa y 49 % a P. capsici. Los resultados obtenidos en el presente trabajo se corresponden con los valores de porcentaje de inhibición informados para M. roreri por estos autores.

Estudios similares que utilizan el método de difusión en agar han sido desarrollados en otros patosistemas. Orberá et al. (1717. Orberá TM, Serrat MJ, González Z. Potencialidades de bacterias aerobias formadoras de endosporas para el biocontrol en plantas ornamentales. Fitosanidad. 2009; 13(2): 95-100.) evaluaron in vitro la actividad inhibitoria que ejercen las bacterias aerobias formadoras de endosporas sobre hongos fitopatógenos aislados de plantas ornamentales. Esto autores seleccionaron cinco cepas que presentaron un PICR sobre los hongos fitopatógenos superior a 50 %.

Sosa et al. (1818. Sosa A, Pazos V, Torres D, Casadesús L. Identificación y caracterización de seis aislados pertenecientes al género Bacillus promisorios para el control de Rhizoctonia solani Künh y Sclerotium rolfsii Sacc. Fitosanidad . 2011;15(1): 39-43.) realizaron estudios de antagonismo in vitro entre cepas de Bacillus subtilis frente a Rhizoctonia solani Kühn y seleccionaron, como promisorias, aquellas cepas que presentaron un PICR superior a 75 %.

Los resultados demuestran que existió actividad antagónica de los aislamientos bacterianos sobre M. roreri, probablemente por la presencia de antibióticos difundidos volátiles y no volátiles y enzimas líticas producidas por Bacillus, los cuales inhibieron el crecimiento micelial de M. roreri. (Fig. 3)

En el presente trabajo, aunque no se determinaron los compuestos responsables de este efecto inhibitorio, se infiere que este pudiera estar dado por la gran variedad de antibióticos que producen las cepas de Bacillus spp., que tienen la capacidad de inhibir el crecimiento de agentes fitopatógenos (1919. Falardeau J, Wise C, Novitsky L, Avis TJ. Ecological and mechanistic insights into the direct and indirect antimicrobial properties of Bacillus subtilis lipopeptides on plant pathogens. Journal of Chemical Ecology. 2013; 39:869-878., 2020. Gao P, Qin J, Li D, Zhou S. Inhibitory effect and possible mechanism of a Pseudomonas strain QBA5 against gray mold on tomato leaves and fruits caused by Botrytis cinerea. PLoS One. 2018; 13.). Entre estos compuestos, los lipopéptidos, fundamentalmente de las familias de las iturinas, fengicinas y surfactinas, han sido ampliamente estudiados por su actividad antibacteriana y antifúngica (2121. Meena KR, Kanwar SS. Lipopeptides as the antifungal and antibacterial agents: Applications in Foof safety and therapeutics. BioMed Research International. 2015:19. http://dx.doi.org/10.1155/2015/473050., 2222. Harwood CR, Mouillon JM, Pohl S, Arnau J. Secondary metabolite production and the safety of industrially important members of the Bacillus subtilis group. FEMS Microbiology Reviews. 2018; 42(6): 721-738.).

Otros autores, como Rojas et al. (2323. Rojas MM, Sánchez D, Rosales K, Lugo D. Antagonismo de Bacillus frente a hongos fitopatógenos de cultivos hortícolas. Rev. Protección Vegetal. 2017; 32(2):1-9.), evaluaron el efecto antagónico in vitro de 14 aislados de Bacillus frente a los hongos fitopatógenos Fusarium oxysporum (Schldtll) y Fusarium moniliforme (Sheld), que afectan cultivos hortícolas. Estos investigadores hallaron que solo nueve aislados de Bacillus mostraron inhibición sobre F. oxysporum por encima de 80 %, así como que seis aislados fueron capaces de inhibir el crecimiento de F. monilioforme después de los 15 días de incubación. Ese estudio demostró el elevado potencial de cepas de Bacillus como antagonistas de Fusarium, fitopatógeno de cultivos hortícolas y permitió la selección de los aislados RCGr32, RCQ7 y RCGr33 como promisorios para el control biológico de estos hongos.

De Almeida et al. (2424. de Almeida KB, Carpentieri V, Fira D, Balatti PA, Yanil SM, Oro TH, et al. Screening of bacterial endophytes as potential biocontrol agents against soybean diseases. Journal of Applied Microbiology. 2018; doi: 10.1111/jam.14041.), en una investigación de selección de bacterias endófitas como agentes de control biológico contra los principales microorganismos patógenos asociados al cultivo de la soya, informaron a los géneros Bacillus sp. y Burkholderia sp. como los más efectivos in vitro para controlar los hongos patógenos Sclerotinia sclerotiorum (‎Lib.‎) ‎de Bary‎, Phomopsis sojae Lehman y R. solani. Estos autores adjudican este efecto, principalmente, a la producción de antibióticos.

Los resultados obtenidos se corresponden con varios autores que informaron a las especies del género Bacillus (B. subtilis, B. pumilus, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. licheniformis, entre otras) con potencialidades para mitigar la incidencia de enfermedades de importancia agrícola (2525. Pila FES. Importancia de los lipopéptidos de Bacillus subtilis en el control biológico de enfermedades en cultivos de gran valor económico. Bionatura. 2016; 1(3): 135-138., 2626. Muthukumar A, Udhayakumar R, Naveenkumar R. Role of bacterial endophytes in plant disease control. Chapter 7, p. 138-140. In: D.K. Maheshwari y K. Annapurna (eds.), Endophytes: Crop productivity and protection, Sustainable Development and Biodiversity. 2017; 16, doi: 10.1007/978-3-319-66544-3-7., 2727. Villarreal-Delgado MF, Villa-Rodríguez ED, Cira-Chávez LA, Estrada-Alvarado MI, Parra-Cota FI, De los Santos-Villalobos S. The genus Bacillus as a biological control agent and its implications in the agricultural biosecurity. Rev. Mexicana de Fitopatología. 2017; 36(1): 95-130.).

Por otro lado, se observó que las colonias de bacterias aisladas en TSA a las 72 h tenían características culturales y morfológicas macroscópicas semejantes a las del género Bacillus, como son el tamaño de mediano-grande, el borde irregular, la elevación planoconvexa y el color blanquecino (Fig. 4 A). Después de realizar la tinción de Gram se constató, a nivel microscópico, que todos los aislados resultaron ser bacilos Gram positivos (Fig. 4 B), formadores de endosporas (Fig. 5 A) y catalasas positivas. (Fig. 5 B)

Se confirmaron las características de este grupo: la presencia de endosporas, la forma bacilar y la producción de enzimas catalasa (1212. Melnick RL, Suarez C, Bailey BA, Backman PA. Isolation of endophytic endospore-forming bacteria from Theobroma cacao as potential biological control agents of cacao diseases. Biological Control. 2011; 57: 236-245.).

El presente trabajo demuestra la actividad inhibitoria in vitro de nuevos aislados de bacterias endófitas formadoras de endosporas, pertenecientes a la clase Bacilli, con potencialidades para el control biológico del agente etiológico de la moniliasis del cacao. Estos resultados constituyen el primer paso hacia la selección de cepas eficientes para el biocontrol de este hongo fitopatógeno, por lo que continuarán los estudios para esclarecer los mecanismos de acción responsables del antagonismo, así como su comportamiento en la interacción con la planta.