Se estudiaron cuatro aceites esenciales obtenidos a partir de Citrus sinensis (L.) Osbeck (naranjo dulce, Rutaceae), Melaleuca quinquenervia (Cav) S.T. Blake (Melaleuca, Myrtaceae), Piper aduncum subsp. ossanum (C. DC.) Saralegui (Platanillo de Cuba, Piperaceae) y Piper auritum Kunth (Caisimón de anís, Piperaceae). Las especies se identificaron por comparación con las descripciones botánicas en la literatura y las colecciones del Herbario Johannes Bisse, del Jardín Botánico Nacional de Cuba.

El material vegetal de las cuatro especies vegetales se recolectó en localizaciones geográficas de la región occidental de Cuba, de tres de ellas se procesaron sus hojas y de una los frutos. Las hojas de M. quinquenervia provinieron de la Ciénaga de Zapata, Provincia Matanzas y las de las dos especies del género Piper del Parque “Escaleras de Jaruco”, Provincia Mayabeque; mientras que, los frutos de C. sinensis se cosecharon en Jagüey Grande, Provincia Matanzas.

Para la obtención de los aceites esenciales de M. quinquenervia, P. aduncum subsp. ossanum y P. auritum se seleccionaron las hojas no dañadas. El material vegetal se procesó fresco, excepto el de melaleuca que se secó a temperatura ambiente en la sombra durante ocho días.

Los aceites esenciales de estas tres especies se extrajeron por hidrodestilación con equipo Clevenger durante tres horas, según lo establecido en la norma ISO 65-71:84 (2020. International Standarization Organization (ISO). ISO 6571. Spices, condiments and herbs. Determination of volatile oil content. 1984;88.). Cada aceite se secó sobre sulfato de sodio y se almacenó a 4°C. El aceite de C. sinensis se obtuvo por expresión en el Combinado Citrícola Victoria de Girón, Jagüey Grande, Provincia Matanzas, Cuba, luego del procesamiento industrial de los frutos para la obtención de jugos.

Los experimentos se desarrollaron en el Laboratorio de Nematología Agrícola del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA). Los nematodos entomopatógenos empleados pertenecen a la cepa HC1 de H. amazonensis (GenBank: BankIt1899363 Hamaz_HC1 KU870321), seleccionada por Sánchez (2121. Sánchez L. Heterorhabditis bacteriophora HC1. Estrategia de desarrollo como agente de control biológico de plagas insectiles. Cuba. [Tesis en opción al Título de Doctor en Ciencias Agrícolas]. Universidad Agraria de La Habana, Cuba. 2002. 100 pp. ) por su patogenicidad sobre diversas plagas .

Los juveniles infectivos (JI) se obtuvieron en ese laboratorio mediante reproducción masiva in vivo, utilizando como biorreactor larvas del último instar de Galleria mellonella (Fabricius), siguiendo el procedimiento establecido por Sánchez et al. (2222. Sánchez L, Rodríguez MG, Gómez L, Soler DM, Hernández MA, Castellanos L, et al. Desarrollo de una metodología para la reproducción artificial de nematodos entomopatógenos para el control de plagas en cafeto. Metodologías Depositadas en Centro de Derechos de Autor (http://www.cenda.cult.cu), Cuba, número 09613/ 2002; 2001. ) y los sustratos sugeridos por Enrique et al. (2323. Enrique R, Sánchez L, Rodríguez MG, Gómez L, Valle Z. Dietas alternativas para la cría de Galleria mellonella. Influencia sobre el rendimiento - peso de larvas de Galleria mellonella y recobrado de juveniles infectivos. Centro Nacional de Derecho de Autor (CENDA). Deposit number CENDA2874-2006. Ciudad de la Habana, Cuba; 2006. ). Las colectas de nematodos se efectuaron a los 12 días. Estos se preservaron a una temperatura de 23±1°C en solución acuosa y posteriormente se utilizaron en los experimentos in vitro.

En este bioensayo se utilizaron placas plásticas de 24 pocillos; en cada uno de ellos se añadieron consecutivamente 100 µl de agua destilada conteniendo los JI (al menos 20), 200 µl de agua destilada y 300 µl de solución del tratamiento correspondiente (1919. Castruita-Esparza G, Bueno-Pallero F, Blanco-Pérez ÁR, Dionísio L, Aquino-Bolaños T, Campos-Herrera R. Activity of Steinernema colombiense in plant-based oils. J Nematol. 2020;52(e2020-72):1-12. ). Las placas se colocaron a temperatura ambiente y transcurridas 24 horas se contabilizó el número de nematodos vivos y muertos en cada pocillo (1919. Castruita-Esparza G, Bueno-Pallero F, Blanco-Pérez ÁR, Dionísio L, Aquino-Bolaños T, Campos-Herrera R. Activity of Steinernema colombiense in plant-based oils. J Nematol. 2020;52(e2020-72):1-12. , 2424. Kim J, Seo S-M, Lee S-G, Shin S-C, Park I-K. Nematicidal Activity of Plant Essential Oils and Components from Coriander (Coriandrum sativum), Oriental Sweetgum (Liquidambar orientalis), and Valerian (Valeriana wallichii) Essential Oils against Pine Wood Nematode (Bursaphelenchus xylophilus). J Agric Food Chem. 2008;56:7316-20. ). Los nematodos se consideraron muertos si su cuerpo estaba recto y no se movían aún después del estímulo mecánico (1616. Choi, I-H.; Kim J. Nematicidal activity of monotherpenoids against the pine wood nematode (Bursaphelenchus xylophilus). Russ J Nematol. 2007;15(1): 35-40. , 1919. Castruita-Esparza G, Bueno-Pallero F, Blanco-Pérez ÁR, Dionísio L, Aquino-Bolaños T, Campos-Herrera R. Activity of Steinernema colombiense in plant-based oils. J Nematol. 2020;52(e2020-72):1-12. ).

Soluciones de cuatro disolventes orgánicos y tres tensoactivos, utilizados comúnmente para disolver los aceites esenciales y sus componentes, se prepararon a dos concentraciones, por dilución seriada, con agua destilada (Tabla 1) (99. Shamseldean MM, A.F. S, Gesraha MA, Montasser SA, Ibrahim SA. Utilization of Entomopathogenic Nematodes Combined with Plant Extracts and Plant Essential Oils against Grasshopper, Heteracrir littoralis. J Basic Appl Sci Res. 2013;3(11):289-94. , 2525. Adenubi OT, McGaw LJ, Eloff JN, Naidoo V. In vitro bioassays used in evaluating plant extracts for tick repellent and acaricidal properties: A critical review. Vet Parasitol. 2018;254:160-71. ). En el control se adicionó agua destilada.

Se utilizó un diseño completamente al azar y ocho réplicas por tratamiento. Los datos de mortalidad se transformaron en arcoseno(√p) y se realizó análisis de varianza simple, las medias se contrastaron por medio de la prueba de rangos múltiples de Duncan con nivel de significación de 0,05.

Para la evaluación del efecto tóxico letal se siguió el procedimiento descrito anteriormente. Los aceites esenciales de platanillo de Cuba, caisimón de anís, melaleuca y naranjo dulce, se mezclaron con la solución acuosa de la sustancia disolvente seleccionada y se evaluaron a una concentración final, en el pocillo, de 0,5 %.

Se utilizó un control con agua destilada y otro con la sustancia disolvente seleccionada a la concentración que no afectó significativamente a los JI de H. amazonensis cepa HC1. Se utilizó un diseño completamente al azar y se realizaron 12 réplicas por tratamiento. Los datos de mortalidad se transformaron en arcoseno (√p) y se realizó análisis de varianza simple, las medias se contrastaron por medio de la prueba de rangos múltiples de Duncan con nivel de significación de 0,05.

El bioensayo de infectividad Uno-Uno se utilizó para evaluar el efecto tóxico subletal de los aceites esenciales sobre H. amazonensis cepa HC1. Este ensayo se basa en la capacidad de un juvenil infectivo de nematodo entomopatógeno de infectar y provocar la muerte a una larva del insecto diana y es recomendado como bioensayo para el control de calidad de lotes de estos agentes de control biológico (2626. Glazer I, Lewis EE. Bioassays of Entomopathogenic Nematodes. In: Navon A, Ascher KRS, editors. Bioassays of entomopathogenic microbes and nematodes. Wallingford Oxon, UK: CABI Publishing; 2000. p. 229-48.).

Larvas del último instar de G. mellonella de 0,2 g de peso se utilizaron como insecto diana. Los nematodos utilizados en este bioensayo fueron los JI sobrevivientes del ensayo de evaluación del efecto tóxico letal de los aceites esenciales.

Se colocó una larva de G. mellonella sobre un disco de papel de filtro (Whatman 1), humedecido con agua destilada, ubicado en el fondo de un pocillo; se utilizaron placas de 24 pocillos. Un nematodo individual, proveniente de la suspensión de los diferentes tratamientos, se transfirió en 100 µl de agua destilada que se aplicaron sobre cada larva, bajo un microscopio STEMI DV4®. En cada pocillo se colocó un disco de malla, para evitar que la larva del insecto se moviera hacia la superficie superior, la placa se cubrió con su tapa plástica y se selló con papel Parafilm. Las placas se mantuvieron a temperatura ambiente.

El número de insectos vivos y muertos se contabilizó a las 48 horas de realizada la aplicación y se calculó la mortalidad correspondiente. Los insectos se consideraron muertos si se mantuvieron inmóviles y adquirieron la coloración rojiza característica (1212. Rodríguez MG. Entomopathogenic nematodes in Cuba: From laboratories to popular biological control agents for pest management in a developing country. In: Campos-Herrera R, editor. Nematode Pathogenesis of Insects and Other Pests-Ecology and Applied Technologies for Sustainable Plant and Crop Protection. Cham, Switzerland; Heidelberg, Germany; New York, NY, USA; Dordrecht, The Netherlands; London, UK: Springer; 2015. p. 343-364.).

Se utilizó un control con los nematodos tratados con agua destilada y otro con la sustancia disolvente seleccionada, a la concentración que no afectó significativamente a los JI de H. amazonensis cepa HC1. Se utilizó un diseño completamente al azar y se realizaron 24 réplicas por tratamiento.

Los resultados se analizaron estadísticamente mediante una comparación múltiple de proporciones, por el método de Wald para un nivel de confianza de 0,05. Se utilizó el Software estadístico CompaProWin_2.0.1 desarrollado en el CENSA (2828. Castillo Duvergel Y, Miranda I. COMPAPROP: Sistema para comparación de proporciones múltiples. Rev Protección Veg. 2014;29(3):231-4.).

Se estudió el efecto de 11 componentes de aceites esenciales. Estos compuestos se seleccionaron por su presencia en ingredientes activos de productos comerciales basados en aceites esenciales y/o sus componentes (22. Nollet LML, Rathore HS. Green Pesticides Handbook Essential Oils for Pest Control. Nollet LML, Rathore HS, editors. Boca Raton, FL: Taylor & Francis, CRC Press; 2017. 3-523 p., 33. Isman MB. Commercial development of plant essential oils and their constituents as active ingredients in bioinsecticides. Phytochem Rev. 2019;9.) y/o por encontrarse en la composición de aceites esenciales identificados como promisorios para el desarrollo de nuevos plaguicidas (55. Pino O, Sánchez Y, Rojas MM, Rodríguez H, Abreu Y, Duarte Y, et al. Composición química y actividad plaguicida del aceite esencial de Melaleuca quinquenervia (Cav) S.T. Blake. Rev. Protección Veg. 2011;26(3):177-86. , 66. Pino O, Sánchez Y, Rodríguez H, Correa T., Demedio J, Sanabria J. Caracterización química y actividad acaricida del aceite esencial de Piper aduncum subsp. ossanum frente a Varroa destructor. Rev. Protección Veg. 2011;26(1):52-61. , 77. Duarte Y, Pino O, Infante D, Sánchez Y, Travieso C, Martínez B. Efecto in vitro de aceites esenciales sobre Alternaria solani Sorauer. Rev. Protección Veg. 2013;28(1):54-9. , 2727. Pino O, Sánchez Y, Rojas MM, Abreu Y, Correa TM. Composición química y actividad antibacteriana del aceite esencial de Pimpinella anisum L . Rev Protección Veg. 2012;27(3):181-7. ). (Tabla 2)

Los componentes se mezclaron con la solución acuosa de la sustancia disolvente seleccionada y se evaluaron a una concentración final, en el pocillo, de 0,5 %. Se utilizaron dos controles, uno con agua destilada y otro con la sustancia disolvente seleccionada a la concentración que no afectó significativamente a los JI de H. amazonensis cepa HC1.

Se utilizó un diseño completamente al azar y se realizaron 12 réplicas por tratamiento. Los datos de mortalidad se transformaron en arcoseno(√p) y se realizó análisis de varianza simple, las medias se contrastaron por medio de la prueba de rangos múltiples de Duncan con nivel de significación de 0,05.

Los nematodos muertos por la exposición a los tratamientos con componentes de aceites esenciales que provocaron una mortalidad superior al 50 % se observaron con Microscopio Leica (60 y 100 X). Para la observación de los daños se utilizó un sistema de fotodocumentación y el Software Leica Application Suite V3.

Los JI de H. amazonensis cepa HC1 evidenciaron la tendencia a una mayor susceptibilidad a los disolventes orgánicos (Tabla 3). Los tratamientos con Etanol (1 %), Tween 20 (0,25 y 0,5 %) y Tritón X-100 (0,25 y 0,5 %) no provocaron una mortalidad significativa de los JI. El Tritón X-100 al 0,5 % causó el menor número de muertes en los nematodos tratados.

La evaluación biológica de sustancias poco solubles en agua, tales como los aceites esenciales y sus componentes, requiere la modificación de métodos de ensayos tradicionales desarrollados para sustancias hidrofílicas (2929. Saad NY, Muller CD, Lobstein A, Muller D, Lobstein A, Muller CD, et al. Major bioactivities and mechanism of action of essential oils and their components. Flavour Fragr J. 2013;28(5):269-79.). El aumento de la biodisponibilidad, en el medio de ensayo, de metabolitos secundarios poco solubles en agua se logra mediante la utilización de disolventes orgánicos y tensoactivos en bajas concentraciones. Sin embargo, la susceptibilidad de los organismos diana puede variar en dependencia del género, la especie e incluso la cepa; es por ello que resulta de gran importancia la adecuación de los ensayos a cada organismo específico (2929. Saad NY, Muller CD, Lobstein A, Muller D, Lobstein A, Muller CD, et al. Major bioactivities and mechanism of action of essential oils and their components. Flavour Fragr J. 2013;28(5):269-79.).

El Tritón X-100 se utilizó con anterioridad en ensayos de determinación del efecto de terpenos, terpenoides y aceites esenciales sobre Bursaphelenchus xylophilus (Steiner et Buhrer) Nickle, sin provocar toxicidad sobre este nematodo fitoparásito (1313. San-Blas E, Campos-Herrera R, Dolinski C, Monteiro C, Andaló V, Garrigós Leite L, et al. Entomopathogenic nematology in Latin America: A brief history, current research and future prospects. J Invertebrate Pathol. 2019;165:22-45. , 2424. Kim J, Seo S-M, Lee S-G, Shin S-C, Park I-K. Nematicidal Activity of Plant Essential Oils and Components from Coriander (Coriandrum sativum), Oriental Sweetgum (Liquidambar orientalis), and Valerian (Valeriana wallichii) Essential Oils against Pine Wood Nematode (Bursaphelenchus xylophilus). J Agric Food Chem. 2008;56:7316-20. ). Los resultados obtenidos en el presente estudio coinciden con los emanados de esa investigación precedente y amplían el espectro de utilización de este tensoactivo en ensayos biológicos.

El Tritón X-100 al 0,5 % posee baja toxicidad sobre H. amazonensis cepa HC1 y se puede utilizar en ensayos de compatibilidad de productos químicos con esta cepa de nematodos entomopatógenos. Este tensoactivo se seleccionó para la solubilización de las muestras en los bioensayos de compatibilidad de aceites esenciales y sus componentes con la cepa de nematodos entomopatógenos estudiada.

Los porcentajes de mortalidad de H. amazonensis provocados por los aceites aplicados fueron, en todos los casos, inferiores al 15 % (Tabla 4). Los aceites de M. quinquenervia y C. sinensis no produjeron efecto tóxico significativo sobre los juveniles; mientras que, los de P. auritum y P. aduncum subsp. ossanum causaron mortalidades que difirieron estadísticamente de las obtenidas para el control con Tritón X-100. Este último aceite fue mejor tolerado por los nematodos, pues la mortalidad fue menor de 10 % (1818. Subramanian S, Muthulakshmi M. Entomopathogenic Nematodes. In: Omkar B, editor. Ecofriendly Pest Management for Food Security. San Diego: Academic Press; 2016. p. 367-410.).

En la literatura consultada no se encontró información sobre el efecto de estos aceites sobre H. amazonensis. La cepa HC1, utilizada en el presente estudio, fue aislada a partir de suelos cubanos y por tanto su sensibilidad a los diferentes tratamientos puede estar influenciada por su posible adaptación genética a diferentes factores bióticos y abióticos presentes en el ecosistema (3131. Stuart R, Gaugler R. Genetic adaptation and founder affect in laboratory populations of the entomopathogenic nematode Steinernema glasseri. Can J Zool. 1996;74:164-70. ). Los resultados indican que los aceites de M. quinquenervia y C. sinensis pueden mezclarse con estos nematodos entomopatógenos y realizar aplicaciones simultáneas, sin que se afecte la sobrevivencia de los juveniles infectivos.

En condiciones de laboratorio, estudios precedentes de compatibilidad de nematodos entomopatógenos con diferentes tipos de agroquímicos comerciales utilizan tiempos de evaluación entre 3 y 120 horas (1212. Rodríguez MG. Entomopathogenic nematodes in Cuba: From laboratories to popular biological control agents for pest management in a developing country. In: Campos-Herrera R, editor. Nematode Pathogenesis of Insects and Other Pests-Ecology and Applied Technologies for Sustainable Plant and Crop Protection. Cham, Switzerland; Heidelberg, Germany; New York, NY, USA; Dordrecht, The Netherlands; London, UK: Springer; 2015. p. 343-364., 1414. Monteiro C, Lage TC de A, Marchesini P, Vale L, Perinotto WM de S, Lopes WDZ, et al. Combination of entomopathogenic nematodes with acaricides or essential oil of Lippia triplinervis against Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae). Vet Parasitol Reg Stud Reports. 2021;23:100526. , 2525. Adenubi OT, McGaw LJ, Eloff JN, Naidoo V. In vitro bioassays used in evaluating plant extracts for tick repellent and acaricidal properties: A critical review. Vet Parasitol. 2018;254:160-71. , 2626. Glazer I, Lewis EE. Bioassays of Entomopathogenic Nematodes. In: Navon A, Ascher KRS, editors. Bioassays of entomopathogenic microbes and nematodes. Wallingford Oxon, UK: CABI Publishing; 2000. p. 229-48.). La determinación de la mortalidad transcurridas 24 horas de exposición permite valorar el efecto que, sobre el agente de control biológico, tendría la mezcla directa con las sustancias evaluadas (3434. Koppenhofer AM, Grewal PS. Compatibility and Interactions with Agrochemicals and Other Biocontrol Agents. In: Grewal PS, Ehlers R-U, Shapiro-Ilan DI, editors. Nematodes as Biocontrol Agents. Wallingford Oxfordshire UK: CABI Publishing; 2005. p. 363-81.); sin embargo, si esta mezcla se realizara solo en el momento de la aplicación a los cultivos, el tiempo de contacto en estas condiciones sería menor. Por ello, sería conveniente valorar la realización de nuevos bioensayos con menores tiempos de exposición para los aceites del género Piper que no afecten a los nematodos entomopatógenos, lo que permitiría emitir recomendaciones a los productores para su uso seguro.

Los JI, sobrevivientes del ensayo de evaluación del efecto tóxico letal de los cuatro aceites esenciales, produjeron porcentajes de mortalidad, en larvas de G. mellonella, superiores al 60 % en el ensayo uno-uno (Tabla 5.). No se evidenciaron diferencias significativas de los tratamientos con el control ni entre ellos, lo que indica que no se afectó la infectividad de los JI por la exposición de éstos, durante 24 horas, a los aceites esenciales de C. sinensis, M. quinquenervia, P. aduncum subsp. ossanum y P. auritum.

Los valores de mortalidad de G. mellonela se encuentran dentro del rango esperado en el ensayo, según resultados obtenidos en evaluaciones de calidad de agentes de control biológico comerciales basados en diferentes cepas de nematodos entomopatógenos (2626. Glazer I, Lewis EE. Bioassays of Entomopathogenic Nematodes. In: Navon A, Ascher KRS, editors. Bioassays of entomopathogenic microbes and nematodes. Wallingford Oxon, UK: CABI Publishing; 2000. p. 229-48.). Las larvas, al morir, adquirieron la coloración marrón oscuro o rojizo que provoca esta cepa, de acuerdo a la escala emitida para la cepa (1212. Rodríguez MG. Entomopathogenic nematodes in Cuba: From laboratories to popular biological control agents for pest management in a developing country. In: Campos-Herrera R, editor. Nematode Pathogenesis of Insects and Other Pests-Ecology and Applied Technologies for Sustainable Plant and Crop Protection. Cham, Switzerland; Heidelberg, Germany; New York, NY, USA; Dordrecht, The Netherlands; London, UK: Springer; 2015. p. 343-364.) para evaluar la mortalidad por nematodos entomopatógenos en G. mellonella; lo que indicó que las larvas, empleadas en el ensayo, murieron por el efecto de nematodos entomopatógenos y no por otras causas.

En la literatura consultada se encontró un estudio que refiere la aplicación conjunta de aceites esenciales y nematodos entomopatógenos sobre Heteracrir littoralis Rambur. Los ensayos realizados se focalizaron en determinar el efecto insecticida sobre este saltahojas de combinaciones de aceites esenciales con H. bacteriophora y Heterorhabditis indica Poinar et al., se observó que el número de JI que emergían de los cadáveres de los insectos tratados con estas mezclas fue menor en comparación con los controles en todas las variantes experimentales (99. Shamseldean MM, A.F. S, Gesraha MA, Montasser SA, Ibrahim SA. Utilization of Entomopathogenic Nematodes Combined with Plant Extracts and Plant Essential Oils against Grasshopper, Heteracrir littoralis. J Basic Appl Sci Res. 2013;3(11):289-94. ) aunque no se aclara la causa de esta reducción asociada a los aceites. Es significativo resaltar que los mayores valores se obtuvieron para el aceite de Eucalyptus globulus Labill, especie perteneciente a la familia de las Mirtáceas al igual que M. quinquenervia, que en el presente estudio también provocó una toxicidad baja sobre los JI.

Es importante complementar el análisis de los datos obtenidos en el ensayo de toxicidad letal con el de los resultados relacionados con efectos subletales que afecten la capacidad de los nematodos de invadir y matar al insecto. La inhibición de la atracción del hospedante, reproducción y/o desarrollo puede incidir en la infectividad y consecuentemente la eficacia de los nematodos (1717. Laznik Ž, Vidrih M, Trdan S. The effects of different fungicides on the viability of entomopathogenic nematodes Steinernema feltiae (Filipjev), S. carpocapsae Weiser, and Heterorhabditis downesi Stock, Griffin & Burnell (Nematoda: Rhabditida) under . Chil J Agric Res. 2012;72 (1):62-7. ,1818. Subramanian S, Muthulakshmi M. Entomopathogenic Nematodes. In: Omkar B, editor. Ecofriendly Pest Management for Food Security. San Diego: Academic Press; 2016. p. 367-410.). Por otro lado, estos aceites esenciales poseen actividad antimicrobiana establecida y pudieran tener efectos negativos sobre la bacteria simbionte y, consecuentemente, disminuir la infectividad de los JI (3535. Burt S. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods--a review. Int J Food Microbiol. 2004 Aug;94(3):223-53.).

Los aceites de melaleuca y naranjo dulce no provocaron niveles de mortalidad significativos o afectación en la infectividad, lo que sugiere que podrán ser utilizados simultáneamente con los NEP en programas de manejo integrado de plagas. Esto reviste importancia práctica, pues los productores podrían hacer aplicaciones donde mezclen los nematodos entomopatógenos y los aceites de estas dos plantas, que se encuentran disponibles en el país.

De manera general, los resultados obtenidos contribuyen a aumentar el conocimiento existente sobre ambos tipos de agentes bioactivos. Específicamente, se aporta al estudio de la biodiversidad de nuestro país pues la cepa de nematodos utilizada se aisló en un ecosistema local y se evaluó el efecto de aceites esenciales obtenidos a partir de especies vegetales desarrolladas en las condiciones geoclimáticas de Cuba y una de ellas (P. aduncum subsp. ossanum) es una planta endémica.

Los componentes estudiados están presentes en el ingrediente activo de productos comerciales, ya sea como parte de aceites esenciales o en forma de mezclas artificiales (22. Nollet LML, Rathore HS. Green Pesticides Handbook Essential Oils for Pest Control. Nollet LML, Rathore HS, editors. Boca Raton, FL: Taylor & Francis, CRC Press; 2017. 3-523 p.,33. Isman MB. Commercial development of plant essential oils and their constituents as active ingredients in bioinsecticides. Phytochem Rev. 2019;9.); también se detectaron en la composición de aceites que se identificaron como candidatos promisorios para el desarrollo de nuevos plaguicidas en Cuba (55. Pino O, Sánchez Y, Rojas MM, Rodríguez H, Abreu Y, Duarte Y, et al. Composición química y actividad plaguicida del aceite esencial de Melaleuca quinquenervia (Cav) S.T. Blake. Rev. Protección Veg. 2011;26(3):177-86. , 66. Pino O, Sánchez Y, Rodríguez H, Correa T., Demedio J, Sanabria J. Caracterización química y actividad acaricida del aceite esencial de Piper aduncum subsp. ossanum frente a Varroa destructor. Rev. Protección Veg. 2011;26(1):52-61. , 77. Duarte Y, Pino O, Infante D, Sánchez Y, Travieso C, Martínez B. Efecto in vitro de aceites esenciales sobre Alternaria solani Sorauer. Rev. Protección Veg. 2013;28(1):54-9. , 2727. Pino O, Sánchez Y, Rojas MM, Abreu Y, Correa TM. Composición química y actividad antibacteriana del aceite esencial de Pimpinella anisum L . Rev Protección Veg. 2012;27(3):181-7. ). Se evidenció que el canfeno, el p-cimeno, la piperitona y el 1,8-cineol no afectaron significativamente (efecto tóxico letal) los JI de la cepa HC1 de H. amazonensis. (Tabla 6)

La baja toxicidad evidenciada por el 1,8-cineol se corresponde con la mostrada por el aceite de M. quinquenervia; en cuya composición, este monoterpenoide representó el 25,4 % (55. Pino O, Sánchez Y, Rojas MM, Rodríguez H, Abreu Y, Duarte Y, et al. Composición química y actividad plaguicida del aceite esencial de Melaleuca quinquenervia (Cav) S.T. Blake. Rev. Protección Veg. 2011;26(3):177-86. ). El canfeno, la piperitona y el alcanfor son componentes mayoritarios del aceite de P. aduncum subsp. ossanum (66. Pino O, Sánchez Y, Rodríguez H, Correa T., Demedio J, Sanabria J. Caracterización química y actividad acaricida del aceite esencial de Piper aduncum subsp. ossanum frente a Varroa destructor. Rev. Protección Veg. 2011;26(1):52-61. ), la toxicidad del aceite puede deberse a un efecto aditivo, siendo el alcanfor el de mayor aporte de estos tres componentes y/o a la contribución de otros componentes.

El porcentaje de JI muertos por la exposición a limoneno fue inferior al 5 %, difirió significativamente del control con Tritón X-100, pero no del valor de mortalidad de los juveniles mantenidos en agua. Este terpeno estuvo presente en el aceite de C. sinensis en una abundancia relativa del 95 %, la menor toxicidad provocada por el aceite pudiera atribuirse a que este compuesto, como parte del aceite, se evaluó a una concentración ligeramente menor o a que los componentes minoritarios ejercen un efecto antagónico.

Los componentes alcanfor y metilchavicol provocaron mortalidades inferiores al 20 %, con valores que difirieron estadísticamente de los controles. El primer compuesto fue menos tóxico, pues más del 90 % de los JI sobrevivieron transcurridas las 24 horas de exposición (1818. Subramanian S, Muthulakshmi M. Entomopathogenic Nematodes. In: Omkar B, editor. Ecofriendly Pest Management for Food Security. San Diego: Academic Press; 2016. p. 367-410.). Aunque esta toxicidad es baja (1818. Subramanian S, Muthulakshmi M. Entomopathogenic Nematodes. In: Omkar B, editor. Ecofriendly Pest Management for Food Security. San Diego: Academic Press; 2016. p. 367-410.), se recomienda evaluar el efecto de estos terpenoides a menores tiempos de contacto directo.

Los componentes carvacrol, eugenol, linalol y timol fueron altamente tóxicos a los JI de la cepa estudiada y produjeron mortalidades superiores al 50 %, en orden ascendente hasta causar la muerte del 100 % de los juveniles tratados. En estudios previos, estos compuestos manifestaron actividad nematicida sobre especies perteneciente a los géneros Meloidogyne y Bursaphelenchus, lo cual podría explicar la acción letal observada (1616. Choi, I-H.; Kim J. Nematicidal activity of monotherpenoids against the pine wood nematode (Bursaphelenchus xylophilus). Russ J Nematol. 2007;15(1): 35-40. , 3636. Ntalli NG, Caboni P. Botanical nematicides: A review. J Agric Food Chem. 2012;60(40):9929-40.). El efecto sobre estos fitoparásitos se evidenció a concentraciones inferiores a la utilizada en la presente evaluación; por lo tanto, con fines nematicidas podría considerarse la aplicación conjunta de los nematodos entomopatógenos con estas sustancias y/o aceites esenciales que las contengan a concentraciones intermedias entre la que produce el efecto plaguicida sobre los nematodos fitoparásitos y la que no sea tóxica a los entomopatógenos.

En cuanto a la relación estructura-actividad, dentro del grupo de componentes evaluados el p-cimeno, la piperitona, el carvacrol y el timol poseen en común un anillo aromático sustituido en posición para por un grupo metilo y uno isopropilo. El hidrocarburo (p-cimeno) y la cetona (piperitona) no fueron tóxicos a H. amazonensis; mientras que, los fenoles si lo fueron.

Los cuatro compuestos que provocaron los mayores porcentajes de mortalidad, valores que difirieron estadísticamente de los del resto de los hidrocarburos monoterpénicos y monoterpenoides, poseen un grupo hidroxilo en sus estructuras (Fig. 1); lo que indica que la presencia de este grupo funcional podría estar asociada al efecto biológico observado. La posición del grupo hidroxilo también influyó en la toxicidad, pues la mortalidad en JI causada por el carvacrol (hidroxilo en posición meta) fue inferior a la del timol (hidroxilo en posición orto).

Los resultados confirman los informados previamente, al determinar la toxicidad de varios monoterpenoides sobre el nematodo fitoparásito B. xylophilus, en relación con las diferencias significativas en la actividad nematicida entre grupos funcionales. En esta investigación precedente, alcoholes y fenoles fueron, generalmente, más tóxicos a este nematodo fitoparásito, destacando la actividad nematicida potente del carvacrol y el timol entre los compuestos evaluados (1616. Choi, I-H.; Kim J. Nematicidal activity of monotherpenoids against the pine wood nematode (Bursaphelenchus xylophilus). Russ J Nematol. 2007;15(1): 35-40. ). Las evidencias obtenidas sobre la relación entre la toxicidad de estos compuestos a los nematodos entomopatógenos y los grupos funcionales presentes y su posición, son novedosos; estos aspectos deben ser objeto de investigaciones futuras que permitan profundizar en el modo de acción.

La observación al microscopio de las larvas muertas tras la exposición a los cuatro tratamientos que causaron mayor toxicidad evidenció el desorden en la disposición del contenido interno de los nematodos y se apreció la formación de vacuolas o gránulos grandes en todos los casos (Fig. 2). En la región cefálica fue evidente la contracción del cuerpo y el desprendimiento de la cutícula (Fig. 2B y C). El timol provocó mayor vacuolización y desorden interno, así como el colapso interior en algunas regiones (Fig. 2C).

Uno de los principales mecanismos de acción propuestos para los terpenoides consiste en la disrupción de la membrana celular mediante tres posibles vías: aumentando la permeabilidad de la membrana a iones pequeños, afectando la estabilidad estructural de la membrana y desestabilizando el empaquetamiento de la bicapa lipídica; cualquiera de estos tres efectos produce la muerte en la célula. El mecanismo de acción implica la degradación de la pared celular, dañando las proteínas de membrana citoplasmática, el enlace de las proteínas, la pérdida del contenido celular y la coagulación del citoplasma (2929. Saad NY, Muller CD, Lobstein A, Muller D, Lobstein A, Muller CD, et al. Major bioactivities and mechanism of action of essential oils and their components. Flavour Fragr J. 2013;28(5):269-79.).

Se plantea que el carvacrol y el timol hacen más permeable la membrana de la célula; el carvacrol forma canales a través de la misma alterando la disposición de los fosfolípidos que la componen y el timol se une hidrofóbicamente a las proteínas por medio de enlaces por puente de hidrógeno, provocando cambios en la permeabilidad (3535. Burt S. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods--a review. Int J Food Microbiol. 2004 Aug;94(3):223-53.). En el eugenol, el grupo hidroxilo se enlaza a proteínas, provoca el deterioro de la pared celular y un alto grado de lisis (3535. Burt S. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods--a review. Int J Food Microbiol. 2004 Aug;94(3):223-53.). Aunque estos estudios se ejecutaron en bacterias, los efectos causados por los compuestos evaluados sobre los nematodos podrían producirse por un modo de acción similar a nivel celular.

La incompatibilidad de los compuestos timol, linalol, eugenol y carvacrol con H. amazonensis cepa HC1 puede manejarse por la selección de un intervalo de tiempo apropiado entre las aplicaciones, cuya extensión dependerá de la persistencia de las sustancias sobre la plaga diana y el cultivo. Aunque la información específica sobre los intervalos de aplicación adecuados es limitada, usualmente se recomienda esperar de una a dos semanas después de la aplicación de insecticidas y nematicidas químicos respectivamente, antes de la aplicación de los nematodos (3434. Koppenhofer AM, Grewal PS. Compatibility and Interactions with Agrochemicals and Other Biocontrol Agents. In: Grewal PS, Ehlers R-U, Shapiro-Ilan DI, editors. Nematodes as Biocontrol Agents. Wallingford Oxfordshire UK: CABI Publishing; 2005. p. 363-81.). Los aceites esenciales y sus componentes son sustancias volátiles con un bajo efecto residual (44. Rathore HS. Green Pesticides for Organic Farming: Occurrence and Properties of Essential Oils for Use in Pest Control. In: Nollet LML, Rathore HS, editors. Green Pesticides Handbook: Essential Oils for Pest Control. Boca Raton, FL: Taylor & Francis Group, CRC Press; 2017. p. 3-26.), por ello es probable que no se requiera de un periodo de tiempo muy prolongado y este deberá ser ajustado tomado en cuenta las características de cada ecosistema, aspecto que será objeto de una investigación posterior.

La actividad biológica total de los aceites esenciales naturales y las mezclas artificiales es el resultado de efectos aditivos, sinérgicos y/o antagónicos de los diferentes compuestos presentes en sus composiciones. La acción evidenciada por cada uno de los componentes evaluados aporta un valioso conocimiento en cuanto a las posibilidades prácticas de combinación de estas sustancias con H. amazonensis cepa HC1.

Aunque los trabajos relacionados con la compatibilidad de nematodos entomopatógenos y plaguicidas botánicos son escasos, se reconoce la importancia de abordar estos aspectos en el proceso de selección de candidatos promisorios para el desarrollo de nuevos productos destinados a la protección de plantas. Los nematodos entomopatógenos no son adecuados para actuar con rapidez y obtener resultados a corto plazo (3737. Sherwani SI, Khan HA. Modes of action of biopesticides. In: Biopesticides Handbook. 2015. p. 51-68.) y los aceites esenciales tienen bajo efecto residual, por ello puede ser una alternativa ventajosa la aplicación conjunta de estos tipos de bioproductos o un plaguicida que combine a ambos.

Los aceites esenciales y componentes evaluados serán aplicados en la práctica como formulaciones en cuya composición, además del ingrediente activo, estarán presentes diferentes excipientes y/o surfactantes que podrán incidir en la compatibilidad del producto con los nematodos. Aunque el (los) ingrediente(s) activo(s) hayan demostrado ser compatibles con la cepa de nematodos utilizada en el presente estudio, investigaciones posteriores deberán corroborar este comportamiento con el producto formulado para su utilización en el marco de los diferentes programas de manejo. Las variantes de uso combinado podrían abarcar la utilización conjunta de diferentes productos comerciales basados en nematodos entomopatógenos o en aceites esenciales y/o sus componentes hasta el desarrollo de nuevos formulados cuyo ingrediente activo contenga ambos tipos de agente.

Los aceites esenciales de C. sinensis y M. quinquenervia y los componentes canfeno, p-cimeno y piperitona, según los parámetros evaluados, no causan efectos negativos sobre la sobrevivencia e infectividad de H. amazonensis cepa HC1. Tomando en cuenta, además, el espectro de acción evidenciado hasta el momento por los aceites esenciales y la efectividad sobre diferentes plagas demostrada por el agente de control biológico BionemC, basado en la cepa HC1 de H. amazonensis, se podría proponer su uso combinado en programas de manejo integrado de plagas en diferentes cultivos. En hortalizas, caña de azúcar, frijol común, arroz, banana - plátano, se aplicarían estos productos para el manejo de diferentes plagas o de estados de una plaga (55. Pino O, Sánchez Y, Rojas MM, Rodríguez H, Abreu Y, Duarte Y, et al. Composición química y actividad plaguicida del aceite esencial de Melaleuca quinquenervia (Cav) S.T. Blake. Rev. Protección Veg. 2011;26(3):177-86. , 77. Duarte Y, Pino O, Infante D, Sánchez Y, Travieso C, Martínez B. Efecto in vitro de aceites esenciales sobre Alternaria solani Sorauer. Rev. Protección Veg. 2013;28(1):54-9. , 1212. Rodríguez MG. Entomopathogenic nematodes in Cuba: From laboratories to popular biological control agents for pest management in a developing country. In: Campos-Herrera R, editor. Nematode Pathogenesis of Insects and Other Pests-Ecology and Applied Technologies for Sustainable Plant and Crop Protection. Cham, Switzerland; Heidelberg, Germany; New York, NY, USA; Dordrecht, The Netherlands; London, UK: Springer; 2015. p. 343-364., 2727. Pino O, Sánchez Y, Rojas MM, Abreu Y, Correa TM. Composición química y actividad antibacteriana del aceite esencial de Pimpinella anisum L . Rev Protección Veg. 2012;27(3):181-7. , 3838. Sánchez Y, Correa TM, Abreu Y, Pino O. Efecto del aceite esencial de Piper auritum Kunth y sus componentes sobre Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson y Xanthomonas campestris pv. campestris (Pammel) Dowson. Rev Protección Veg. 2013;28(3):204-10. ). La implementación futura de la aplicación conjunta de estos agentes bioactivos tiene que estar respaldada por experimentos de campo en estos cultivos, porque las observaciones realizadas a nivel de laboratorio no pueden ser totalmente extrapoladas a las condiciones ambientales.

La eficacia es una característica clave para llegar a un producto comercialmente exitoso; sin embargo, no es la única con la que debe cumplir un producto natural para lograr su inserción en programas de manejo integrado de plagas. Los requisitos prácticos incluyen la compatibilidad con otros agroquímicos pues ningún producto por si solo logrará solucionar todos los problemas fitosanitarios de un cultivo. Adicionalmente su combinación representa ventajas económicas por la correspondiente reducción en los costos de aplicación. Los elementos novedosos aportados sobre la compatibilidad de plaguicidas botánicos y nematodos entomopatógenos son la base para su uso combinado dentro de los programas de manejo integrado de plagas y contribuyen a potenciar el rol de estos agentes bioactivos en el desarrollo de una producción sostenible de alimentos que conjugue buenos rendimientos agrícolas con un alto valor ecológico.