Moringa oleifera Lamarck (Moringaceae) es un árbol originario del norte de la India, que crece en ambientes tropicales y subtropicales. Las hojas poseen alto valor nutricional: proteínas, aminoácidos esenciales, antioxidantes (ácido ascórbico, flavonoides, fenólicos y carotenoides), múltiples vitaminas (A, C y complejo B) y propiedades medicinales, por lo que constituye excelente alimento para animales y el hombre (11. Abd El-Hack ME, Alagawany M, Elrys AS, Desoky EM, Rolba HMN, Elnaha ASM, et al. Effect of Forage Moringa oleifera L. (moringa) on Animal Health and Nutrition and Its Beneficial Applications in Soil, Plants and Water Purification. Agriculture. 2018; 8 (145): 1-22.).
Morus alba Linneo (Moraceae) se encuentra ampliamente distribuida en Asia, Europa y África. Esta planta posee propiedades medicinales y se utiliza en la alimentación del gusano de seda (Bombyx mori L.), corderos, cabras, aves, entre otros (22. Hahn-Von-Hessberg CM, Grajales-Quintero A, Grajales-Hahn S. Experiencias del cultivo de la morera Morus alba. L., 1753 (Rosales: Moraceae) y su utilización en la alimentación de tilapia nilótica Oreochromis niloticus, Trew, 1984 (Perciformes: Cichlidae) para programas de seguridad alimentaria en el trópico. Bol.Cient.Mus.Hist.Nat.U.de Caldas. 2018; 22 (2): 42-48. ).
Ambos cultivos se afectan por numerosos patógenos; en M. oleifera se relacionaron Fusarium sp. (33. Lezcano JC, Alonso O, Trujillo M, Martínez E. Agentes fungosos asociados a síntomas de enfermedades en plántulas de Moringa oleifera Lamarck. Pastos y Forrajes. 2014; 37 (2): 166-172.), Aspergillus niger van Tieghem, Aspergillus flavus Link, Alternaria alternata (Fr.) Keissl., Fusarium oxysporum Schlecht. emend. Snyder Hansen, Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid y Rhizopus stolonifera (Ehrenb.) Vuill (44. Mridha MAU. Prospects of Moringa cultivation in Saudi Arabia. J. Appl. Environ. Biol. Sci. 2015; 5(3): 39-46.). Mientras que, en M. alba, se notificaron Cercospora moricola Cooke y Pseudocercospora mori (Hara) Deighton (55. Kumar R, Ahmad J. Isolation and characterization of fungal pathogens of mulberry leaves. Asian Journal of Agriculture & Life Sciences. 2017; 2(4): 1-5.).
El control de estos fitopatógenos se realiza, frecuentemente, mediante la aplicación indiscriminada de fungicidas sintéticos, la que ocasiona daños al ambiente y a la salud humana (66. Peña N, Antón A, Kamilaris A, Fantke P. Modeling ecotoxicity impacts in vineyard production: addressing spatial differentiation for copper fungicides. Sci. Total Environ. 2017; https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2017.10.243 ). El uso de controladores biológicos, dentro de ellos especies de Trichoderma, constituye una alternativa viable para disminuir los efectos adversos de estos agroquímicos. El Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) cuenta con cepas de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg con un elevado efecto antagónico frente a numerosas dianas (77. Infante D, Reyes Y, Peteira B, Martínez B. Variabilidad fisiológica y patogénica de cepas de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg. Métodos en Ecología y Sistemática. 2015;10(3):41-59.).
Los objetivos del presente trabajo fueron identificar morfológicamente las especies de Fusarium procedentes de morera (M. alba) y moringa (M. oleifora), presentes en una zona productora en el noreste de La Habana, y seleccionar cepas promisorias de T. asperellum para su control.
Durante el periodo comprendido de enero de 2018 a noviembre de 2019, se tomaron muestras de plantas de morera (cultivar Gui Sang You 62) y moringa con síntomas de marchitez, amarillamiento y necrosis de las raíces, procedentes de suelos pertenecientes a una zona productora en el Noreste de La Habana. Estas se procesaron en el Laboratorio de Micología Vegetal (LMV) del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), en el municipio San José de las Lajas, provincia Mayabeque, Cuba.
Las muestras sintomáticas se fraccionaron en trozos de 5 mm en condiciones asépticas, se sembraron en placas Petri (Ø=90 mm) con medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) (Biocen) más cloranfenicol (0,01 g.l-1) y se incubaron (28ºC±2ºC, oscuridad constante). A las 72 horas, se realizaron preparaciones de fragmentos de micelio de los aislados obtenidos y, según las estructuras observadas, se determinó su identidad genérica en un microscopio óptico [modelo N-800M (400x)].
De los aislamientos obtenidos se realizaron cultivos monósporicos, los que se conservaron en tubos de ensayo con cuñas de PDA a 4ºC.
Los aislados de Fusarium se caracterizaron e identificaron mediante la siembra en tres medios de cultivos: hojas de clavel agar [Carnation Leaf piece Agar (CLA)], PDA y Spezieller Nährstoffarmer Agar (SNA), según la clave notificada por Leslie y Summerell (88. Leslie JF, Summerell BA. The Fusarium Laboratory Manual: Blackwell Publishing Professional, Ames, IA, EEUU. 2006: 388p.). Las estructuras fúngicas se visualizaron al microscopio óptico N-800M (400x). Todas las características de los aislados observadas se registraron y se documentaron mediante una cámara digital SONY.
Se utilizaron 13 cepas de T. asperellum (Ta) (Ta. 1, Ta. 3, Ta. 12, Ta. 13, Ta. 17, Ta. 25, Ta. 28, Ta. 56, Ta. 75, Ta. 78, Ta. 79, Ta. 85 y Ta. 90), y un aislamiento de Trichoderma sp. (Tsp. 81), procedentes del cepario del LMV, y cuatro aislados de Fusarium de morera (Fmra. 1 y Fmra. 2) y moringa (Fmga. 1 y Fmga. 2). Las cepas del antagonista se multiplicaron en placas Petri (Ø=90 mm) con medio de cultivo Agar Malta durante tres días (28ºC±2ºC y oscuridad) y, los aislados de Fusarium spp., en medio de cultivo PDA (25ºC±2ºC y oscuridad), durante siete días.
El efecto antagónico de Trichoderma sobre los fitopatógenos se evaluó por el método de cultivo dual (CD). Se evaluaron la antibiosis, competencia por espacio, porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) y el micoparasitismo (99. Martínez B, Solano T. Antagonismo de Trichoderma spp. frente a Alternaria solani (Ellis y Martin) Jones y Grout. Rev. Protección Veg. 1995; 10(3):221-225., 1010. Bell DK, Wells HD, Markam CR. In vitro antagonism of Trichoderma spp. against six fungal plant pathogens. Phytopathology. 1982; 72(4): 379-382., 1111. Samaniego G, Ulloa S, Herrera S. Hongos del suelo antagonistas de Phymatotrichum omnivorum. Rev. Mex. Fitopatología, 1989; 8:86-95.). Se utilizaron tres réplicas por cada tratamiento y un control de cada aislamiento de fitopatógeno, sembrado e incubado en las mismas condiciones, pero sin el antagonista.
Los datos obtenidos se procesaron por un Análisis de Varianza Simple (ANOVA); las medias se compararon según la Dócima de Rangos Múltiples de Duncan (p≤0,05), utilizando el paquete estadístico INFOSTAT Profesional (1212. Di Rienzo J, Balzarini M, González L, Tablada M, Guzmán W, Robledo C, et al. InfoStat Profesional versión 2.1. Universidad Nacional de Córdoba. Argentina. 2016. [Consultado: 24 de mayo de 2019]; Disponible en: http://www.infostat.com.ar ).
Las coloraciones de las colonias de los aislamientos presentaron variabilidad. El micelio fúngico del aislado Fmra. 1 (Fig. 1A) fue de color salmón; mientras que, el de Fmra. 2 (Fig. 1B) fue blanquecino. Las colonias de los aislamientos Fmga. 1 y Fmga. 2 (Fig. 1C y D) presentaron tonalidades crema. Los bordes de las colonias de los aislados fueron redondeados con textura afelpada. Las colonias de los cuatro aislamientos formaron anillos en el medio de cultivo.
Los aislamientos Fmra.1, Fmga. 1 y Fmga. 2, produjeron abundantes esporodoquios de color naranja pálido. Los macroconidios fueron rectos o ligeramente curvados, con la presencia de 3 a 7 septos, con células apicales romas y redondeadas, y una célula basal poco desarrollada con forma de pie (Fig. 2A). Los microconidios fueron ovales y fusiformes con 0-1 septo y se formaron en falsas cabezuelas en monofiálides (Fig. 2B). Las clamidosporas se formaron relativamente abundantes en el micelio, intercalares y terminales pareadas (Fig. 2C). Tales características concordaron con las notificadas por Leslie y Summerell (88. Leslie JF, Summerell BA. The Fusarium Laboratory Manual: Blackwell Publishing Professional, Ames, IA, EEUU. 2006: 388p.) para F. solani.
El aislado Fmra. 2, procedente de morera, se caracterizó por presentar esporodoquios (Fig. 3C), macroconidios semicurvos, agudizados en sus extremos, con tres septos y célula basal con un pie; microconidios abundantes formados en falsas cabezuelas (Fig. 3A y B), de formas ovales, arriñonadas a elípticas en monofiálides cortas, 0-1 septo; clamidosporas terminales e intercalares, en cadenas y en grupos. Estos caracteres coincidieron con lo informado por Leslie y Summerell (88. Leslie JF, Summerell BA. The Fusarium Laboratory Manual: Blackwell Publishing Professional, Ames, IA, EEUU. 2006: 388p.) para F. oxysporum.
Por las características observadas en cada aislamiento y su comparación con las descritas en la clave utilizada (88. Leslie JF, Summerell BA. The Fusarium Laboratory Manual: Blackwell Publishing Professional, Ames, IA, EEUU. 2006: 388p.), se lograron identificar dos especies de Fusarium: Fusarium solani (Martius) Appel & Wollenweber emend. Snyder & Hansen donde se incluyeron los aislados (Fmra.1, Fmga. 1 y Fmga. 2), y Fusarium oxysporum Schlechtendahl emend. Snyder & Hansen (Fmra. 2).
Las especies F. oxysporum y F. solani son consideradas complejas, es decir, aglutinan varias especies que se identifican por técnicas moleculares (1313. O’Donnell K, Rooney AP, Proctor RH, Brown DW, McCormick SP, Ward TJ et al. Phylogenetic analyses of RPB1 and RPB2 support a middle Cretaceous origin for a clade comprising all agriculturally and medically important fusaria. Fungal Genetics and Biology. 2013; 52:20-31.) al nivel de regiones del genoma. El uso futuro de estas herramientas precisará la identificación de estos agentes causales.
Todas las cepas de T. asperellum y el aislamiento de Trichoderma sp. inhibieron el crecimiento micelial de los fitopatógenos desde las 48 horas previo al contacto hifal, en comparación con el control, lo que se evidenció a través del CD.
El efecto antagónico ocasionado por las cepas Ta. 1, Ta. 3, Ta. 13, Ta. 17, Ta. 25, Ta. 28, Ta. 75, Ta. 79, Ta. 85 y el aislado Tsp. 81, fue mayor frente al aislamiento Fmra. 1, lo que mostró diferencias significativas con el efecto provocado por las cepas Ta. 12, Ta. 56, Ta. 78 y Ta. 90.
En el enfrentamiento con el aislado Fmra. 2, las cepas Ta. 1, Ta. 13, Ta. 75, Ta. 78 y Ta. 79 provocaron un elevado efecto inhibitorio, con diferencias respecto a las restantes cepas. El aislado Fmga. 1 tuvo la mayor inhibición frente a las cepas Ta. 12, Ta. 13 y Ta. 85, con diferencias significativas con relación al resto de las cepas de Trichoderma evaluadas. El aislado de Fusarium más sensible en la antibiosis fue Fmga. 2, pues todas las cepas de Ta. inhibieron su crecimiento. Las cepas Ta. 1 y Ta. 78 se destacaron con el mayor efecto inhibitorio.
Según Karlsson et al. (1414. Karlsson M, Atanasova L, Jensen DF, Zeilinger S. Necrotrophic mycoparasites and their genomes. Microbiol. Spectrum. 2017; 5 (2):1-21.), las especies pertenecientes al género Trichoderma liberan enzimas extracelulares que participan en la degradación de la pared celular, tales como quitinasa, ß-1,3-glucanasa y proteasas. Es evidente que estas enzimas, entre otras, así como otros metabolitos, se excretan al medio por el antagonista antes del contacto de ambos hongos (patógeno-Ta). Estos pueden afectar la pared de Fusarium y provocar lisis, granulación y otros eventos que limitan el crecimiento del fitopatógeno. Resultados semejantes a los obtenidos en este estudio alcanzaron Cherkupally et al. (1515. Cherkupally R, Amballa H, Narasimha B. In vitro antagonistic activity of Trichoderma species against Fusarium oxysporum f. sp. melongenae. International Journal of Applied Agricultural Research. 2017; 12(1): 87-95.), ya que comprobaron que siete cepas de Trichoderma spp. causaron inhibición del crecimiento de Fusarium oxysporum f. sp. melongenae Matuo & Isigami antes del contacto a los dos días.
Del análisis integral del efecto de las cepas de Ta y el aislamiento de Tsp. sobre el crecimiento de los aislamientos de Fusarium procedentes de morera y moringa antes del contacto hifal, se determinó que las más destacadas fueron Ta. 1 y Ta. 13 (Tabla 1).
En estudios futuros se debe esclarecer los metabolitos y la cantidad de estos liberados por estas cepas, involucrados en la inhibición del crecimiento del patógeno.
Letras distintas en las columnas indican diferencias significativas según Duncan (p≤0,05)
Todas las cepas de T. asperellum y el aislado de Tsp. mostraron un crecimiento micelial más rápido que los aislamientos de Fusarium de morera y moringa. A las 72 horas, las cepas Ta. 3, Ta. 12, Ta. 56, Ta. 75, Ta. 79, Ta. 90 y el aislado Tsp. 81 se desarrollaron en toda el área de la placa, por lo que se ubicaron en la clase 1 de la escala de Bell et al. (1010. Bell DK, Wells HD, Markam CR. In vitro antagonism of Trichoderma spp. against six fungal plant pathogens. Phytopathology. 1982; 72(4): 379-382.), y las restantes en la clase 2 (Fig. 4).
Similares resultados obtuvieron Duarte et al. (1818. Aswini A, Sharmila T, Raaga K, Sri Deepthi R, Krishna MSR. In vitro antifungal activity of Trichoderma strains on pathogenic fungi inciting hot pepper (Capsicum annuum L.). J. Chem. Pharm. Res. 2016; 8(4):425-430.), quienes ubicaron en la clase 1 a cepas de T. asperellum, al enfrentarlas a diferentes especies de Fusarium procedentes de frijol (Phaseolus vulgaris L.). En el presente estudio, las cepas de Ta. tuvieron mejor respuesta que las de T. asperellum probadas por Michel-Aceves et al. (1919. Tsegaye E, Ma J, Mei J, Li M, Wu B, Jiang X. Antagonistic Potential of Different Isolates of Trichoderma against Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, and Botrytis cinerea. European Journal of Experimental Biology. 2018; 18(2): 1-8.), quienes las ubicaron en la clase 2 frente a aislamientos de F. oxysporum procedentes de Jamaica (Hibiscus sabdariffa L.).
Todas las cepas de T. asperellum y el aislado de Trichoderma sp. presentaron inhibición del crecimiento de los fitopatógenos (Tabla 2). No obstante, hubo variabilidad en este indicador entre las cepas del antagonista frente a los distintos aislamientos de Fusarium. La cepa Ta.13 frente al aislado Fmra.1 presentó el mayor porcentaje de inhibición con 56 %; frente a Fmra. 2 sobresalió el aislado Tsp. 81 (48 %); Ta. 1 (48, 33 %) y Tsp. 81 (50 %) destacaron frente a Fmga. 1; frente a Fmga. 2 las cepas Ta. 13, Ta. 78 y Ta. 85 presentaron porcentajes de 45,83 %. Estos resultados presentan una misma tendencia a los evaluados por Aswini et al. (1818. Aswini A, Sharmila T, Raaga K, Sri Deepthi R, Krishna MSR. In vitro antifungal activity of Trichoderma strains on pathogenic fungi inciting hot pepper (Capsicum annuum L.). J. Chem. Pharm. Res. 2016; 8(4):425-430.) y Tsegaye et al. (1919. Tsegaye E, Ma J, Mei J, Li M, Wu B, Jiang X. Antagonistic Potential of Different Isolates of Trichoderma against Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, and Botrytis cinerea. European Journal of Experimental Biology. 2018; 18(2): 1-8.), quienes notificaron porcentajes de inhibición de F. oxysporum alrededor de 50 % al enfrentarlos a aislamientos de Trichoderma.
Letras distintas en las columnas indican diferencias significativas según Duncan (p≤0,05)
Las cepas Ta. 1, Ta. 13, Ta. 78, Tsp. 81 y Ta. 85 mostraron los mayores porcentajes de inhibición frente a los aislamientos de F. solani y F. oxysporum.
Todas las cepas de T. asperellum evaluadas mostraron actividad micoparasítica sobre los aislamientos de Fusarium de morera y moringa, con dos o más tipos de interacciones hifales, con predominio de la granulación y la vacuolización (Tabla 3).
Leyenda: (V) Vacuolización, (G) Granulación, (E) Enrollamiento, (L) Lisis y (P) Penetración
De las cepas de T. asperellum evaluadas, se destacaron Ta. 3 y Ta. 17 (penetración y enrollamiento) frente a Fmra. 1; frente a Fmra. 2 (Fig. 5A, B y C), sobresalieron Ta. 3, Ta. 28, Ta. 75 y Ta. 79 (penetración, enrollamiento y lisis); las cepas Ta. 79 y Ta. 85 (penetración) frente a Fmga. 1; y Ta. 12, Ta. 25, Ta. 28 y Ta. 56 (penetración y enrollamiento) frente a Fmga. 2 (Fig. 5D).
En el micoparasitismo participa una gama de enzimas líticas, que degradan la pared celular de los hongos patógenos y permiten la penetración de las hifas del antagonista en las de estos (2020. Vargas-Hoyos HA, Gilchrist-Ramelli E. Producción de enzimas hidrolíticas y actividad antagónica de Trichoderma asperellum sobre dos cepas de Fusarium aisladas de cultivos de tomate (Solanum lycopersicum). Revista Mexicana de Micología. 2015. 42: 9-16. ). Más específicamente, Ghorbanpour et al. (2121. Ghorbanpour M, Omidvari M, Abbaszadeh-Dahaji P, Omidvar R, Kariman K. Mechanisms underlying the protective effects of beneficial fungi against plant diseases. Biol. Control. 2018; 117: 147-157) demostraron que la actividad quitinolítica de cepas de Trichoderma frente a diversos fitopatógenos con quitina en la composición de su pared celular, se asocia con diferentes genes de la enzima quitinasa (ech42, chi33, nag1 y chi18-13). González et al. (2222. González I, Infante D, Martínez B, Arias Y, González N, Miranda I, et al. Induction of chitinases and glucanases in Trichoderma spp. strains intended for biological control. Biotecnología aplicada. 2012; 29: 12-16.) evidenciaron actividad quitinasas y ß-1,3-glucanasas por algunas de las cepas en estudio (Ta. 17, Ta. 25, Ta. 75, Ta. 79 y Ta. 85), lo que pudiera explicar la penetración de las hifas de estas cepas en las de Fusarium; no obstante, se debe profundizar más en los estudios de este modo de acción.
Estos resultados se corresponden con los obtenidos por Martínez et al. (2323. Martínez-Coca B, Infante D, Caraballo W, Duarte-Leal Y, Echevarría-Hernández A. Antagonismo de cepas de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg frente a aislamientos de Fusarium spp. procedentes de garbanzo. Rev. Protección Veg. 2018; 33 (2):1-13.) y Duarte et al. (1616. Duarte-Leal Y, Pozo-Martínez L, Martínez-Coca B. Antagonismo in vitro de cepas de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg frente a aislados de Fusarium spp. Rev. Protección Veg. 2018; 33(1):1-10.), al observar micoparasitismo por penetración, lisis, enrollamiento, granulación y vacuolización en hifas de los aislamientos de Fusarium nygamai (F-11), Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (F. 50 y F. 51) (2323. Martínez-Coca B, Infante D, Caraballo W, Duarte-Leal Y, Echevarría-Hernández A. Antagonismo de cepas de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg frente a aislamientos de Fusarium spp. procedentes de garbanzo. Rev. Protección Veg. 2018; 33 (2):1-13.), y F. dlaminii y F. solani (1616. Duarte-Leal Y, Pozo-Martínez L, Martínez-Coca B. Antagonismo in vitro de cepas de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg frente a aislados de Fusarium spp. Rev. Protección Veg. 2018; 33(1):1-10.). Además de esta especie, cepas de T. harzianum, Trichoderma viride Pers. y Trichoderma hamatum (Bonord.) Bainier ocasionaron lisis en hifas de aislamientos de F. oxysporum de tomate (Solanum lycopersicum L.) (2424. Ojha S, Chatterjee NC. Mycoparasitism of Trichoderma spp. in biocontrol of fusarial wilt of tomato. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 2018; 44(8): 771-782.).
Se determinó que, en morera, aislamientos de F. oxysporum y, en moringa, este y F. solani, son causantes de amarillamiento y necrosis de la raíz. De acuerdo a los resultados del antagonismo de las cepas de T. asperellum y el aislado de Trichoderma sp. frente a estos aislados (Fmra. 1, Fmra. 2, Fmga. 1 y Fmga. 2), se seleccionaron las cepas Ta. 1, Ta. 3 y Ta. 13 como las más promisorias, las cuales se deben probar en condiciones de vivero y campo para determinar su eficacia técnica.