El hongo basidiomiceto Moniliophthora roreri H.C Evans et al. es un patógeno hemibiotrófico que causa la enfermedad en el cultivo de Theobroma cacao L. conocida como moniliasis. Este microorganismo fitopatógeno ataca al fruto en cualquier edad de desarrollo y puede ocasionar pérdidas económicas de hasta el 90 % de la producción (11. Bailey BA, Evans HC, Phillips‐Mora W, Ali SS, Meinhardt LW. Moniliophthora roreri, causal agent of cacao frosty pod rot. Molecular Plant Pathology, 2018; 19(7):1580-1594. Doi: 10.1111/mpp.12648.). En la literatura científica se describieron diferentes tácticas para el control de la enfermedad, entre las que se encuentran el control cultural, genético, químico y biológico (22. Ten Hoopen GM, Krauss U. Biological control of cacao diseases. In: B. A. Bailey.; L.W. Meinhardt (eds.). Cacao Diseases: A History of Old Enemies and New Encounters. Springer International Publishing Switzerland, 2016; p. 511-566.).

En los últimos años, el control biológico llamó la atención de investigadores, como un medio eficaz para manejar los agentes patógenos de las plantas y preservar el medio ambiente (33. Choudhary M, Ghasal PC, Yadav RP, Meena VS, Mondal T, Bisht JK. Towards Plant-Beneficiary Rhizobacteria and Agricultural Sustainability. In: V. S. Meena (ed.). Role of Rhizospheric Microbes in Soil. Springer Nature Singapore Pte Ltd., 2018; p. 1-46.). Se informó que los agentes de control biológico, particularmente los endófitos del género Bacillus, protegen a las plantas contra agentes fitopatógenos como hongos, bacterias y nematodos (44. Hong CE, Park JM. Endophytic bacteria as biocontrol agents against plant pathogens: current state-of-the-art. Plant Biotechnology Reports, 2016; 10(6): 353-357. Doi: 10.1007/s11816-016-0423-6., 55. Rabiey M, Hailey LE, Roy SR, Grenz K, Al-Zadjali MAS, Barrett GA, et al. Endophytes vs tree pathogens and pests: can they be used as biological control agents to improve tree health? European Journal of Plant Pathology, 2019; 155:711-729. Doi: https://doi.org/10.1007/s10658-019-01814-y.).

La actividad de control biológico exhibida por los Bacillus endófitos se debe, con frecuencia, a la producción de compuestos orgánicos volátiles (COV), que pueden proteger directamente a las plantas contra los fitopatógenos y/o indirectamente a través de la inducción de resistencia de las plantas (66. Lim SM, Yoon MY, Choi GJ, Choi YH, Jang KS, Shin TS, et al. Diffusible and volatile antifungal compounds produced by an antagonistic Bacillus velezensis G341 against various phytopathogenic fungi. Plant Pathol. J. 2017; 33(5): 488-498. Doi: 10.5423/PPJ.OA.04.2017.0073., 77. Xing M, Zheng L, Deng Y, Xu D, Xi P, Li M, et al. Antifungal activity of natural volatile organic compounds against litchi downy blight pathogen Peronophythora litchi. Molecules, 2018; 23:358. Doi: https://doi.org/10.3390/molecules23020358.). Estos compuestos se clasificaron químicamente en grupos de ésteres, alcanos, alquenos, alquinos, alcoholes, terpenoides, aldehídos, cetonas y compuestos que contienen azufre (88. Avalos M, van Wezel GP, Raaijmakers JM, Garbeva P. Healthy scents: microbial volatiles as new frontier in antibiotic research? Current opinion in microbiology, 2018; 45:84-91. Doi: https://doi.org/10.1016/j.mib.2018.02.011.). Entre estos compuestos, se informó que nonanal, 2-undecanona, ciclohexanol, n-decanal, benzotiazol, 2-etil-1-hexanol, pirazina (2,5-dimetil) y dimetil trisulfuro poseen actividad de biocontrol contra Ralstonia solanacearum (Smith.) Yabuuchi et al. y Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Ishiyama) Swings et al. (99. Xie S, Zang H, Wu H, Uddin Rajer F, Gao X. Antibacterial effects of volatiles produced by Bacillus strain D13 against Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Molecular plant pathology, 2018; 19(1): 49-58. Doi: https://doi.org/10.1111/mpp.12494.).

El objetivo de este trabajo fue determinar la actividad antifúngica in vitro de compuestos volátiles producidos por especies endófitas de Bacillus sobre el crecimiento micelial y esporulación de M. roreri.

La investigación se desarrolló en el Laboratorio de Fitopatología del Departamento de Protección Vegetal de la Estación Experimental Tropical Pichilingue, perteneciente al Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), Ecuador. La Estación se encuentra ubicada en el km 5 vía Quevedo, perteneciente al Cantón Mocache, provincia Los Ríos, geográficamente a 1° 05' de Latitud Sur y 79° 26' de Longitud Occidental, a una altitud promedio de 75 m.s.n.m.

Se utilizaron ocho cepas endófitas de Bacillus pertenecientes a la colección de cultivos microbianos del propio centro, seleccionadas a partir de su actividad antagonista in vitro frente a Moniliophthora roreri (1010. Vera MA. Selección de bacterias endófitas asociadas a Theobroma cacao, antagonistas de Moniliophthora roreri en Quinindé, Esmeraldas, Ecuador. [Tesis en Opción al Título Académico de Master en Agricultura Sostenible. Mención Sanidad Vegetal]. Universidad Central Marta Abreu de las Villas, 2019; 54p.). (Tabla 1)

La cepa de M. roreri usada en el estudio se aisló a partir de mazorcas del clon de cacao EET-103 tipo Nacional (Susceptible), con síntomas típicos de moniliasis y pertenece a la colección de cultivos microbianos del laboratorio de Fitopatología de la Estación Experimental Tropical Pichilingue.

Quince días antes de realizar los experimentos de confrontación, se multiplicó el hongo fitopatógeno M. roreri en medio de cultivo Papa-Dextrosa-Agar (PDA) (Difco) a 25±1ºC y fotoperíodo de 12 h luz/12 h oscuridad. con el fin de obtener abundante micelio y esporas.

Las cepas bacterianas endófitas se sembraron en tubos de ensayo (150 x 22 mm) con medio de cultivo Caldo Triptona Soya (TSB) (Difco) a pH 7 e incubaron (Incubadora, Modelo: Precision Scientific) en la oscuridad a 28±1ºC por tres días para permitir el crecimiento, esporulación y producción de metabolitos secundarios.

Posteriormente, el efecto de los compuestos volátiles emitidos por las cepas bacterianas endófitas sobre el crecimiento micelial de M. roreri se evaluó en cajas Petri (100 x 15mm). En la base de la caja se inoculó un disco de micelio (5 mm de diámetro) de M. roreri sobre el medio de cultivo Papa-Dextrosa-Agar (PDA) (Difco), siete días antes de la confrontación, para asegurar el crecimiento del hongo. En la parte superior (tapa), se inoculó la bacteria sobre medio de cultivo Triptona Soya Agar (TSA) (Difco). Las bacterias se inocularon diseminando 100 µl de una suspensión de 1 x 10⁸ UFC ml^-1. Posteriormente, las placas Petri se sellaron con Parafilm e incubaron a 28±1ºC y fotoperíodo de 12 h luz/ 12 h oscuridad durante 15 días (1111. de la Cruz NL. Volátiles de bacterias endófitas de cacao y su efecto sobre Moniliophthora roreri. [Tesis para optar por el grado de Maestría en Ciencias en Recursos Naturales y Desarrollo Rural], El Colegio de la Frontera Sur, Chiapas, México, 2014; 57 pp.).

El tratamiento control se inoculó con 100 µl de agua desionizada estéril en lugar de la suspensión de las bacterias endófitas.

El porcentaje de inhibición del crecimiento radial se calculó usando la fórmula descrita por Arrebola et al. (1212. Arrebola E, Sivakumar D, Korsten L. Effect of volatile compounds produced by Bacillus strains on postharvest decay in citrus. Biological Control, 2010; 53: 122-128. Doi: https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2009.11.010.).

Al concluir la confrontación, se evaluó el efecto de la emisión de compuestos volátiles de las bacterias sobre la esporulación. Para ello, se vertieron 10 ml de agua destilada sobre la tapa de la placa Petri donde creció M. roreri y se removió el micelio con una espátula Drigalsky metálica estéril hasta obtener una suspensión de esporas. La misma se cuantificó en cinco campos, usando una cámara de Neubauer, con la ayuda de un microscopio óptico (Carl Zeiss, aumento 400x).

Los experimentos se repitieron dos veces y se montaron bajo un diseño completamente aleatorizado con cinco repeticiones por tratamiento y control.

Los datos correspondientes al porcentaje de inhibición del crecimiento radial y esporulación de M. roreri. producto del efecto de los compuestos volátiles bacterianos. se sometieron a la prueba de Kruskal-Wallis y comparación múltiple de medias no paramétrica Se utilizó el paquete estadístico STATISTICA versión 12.0 sobre Windows (1313. StatSoft, Inc. STATISTICA (data analysis software system), version 12. 2014, www.statsoft.com ).

Se produjo inhibición del crecimiento micelial de M. roreri debido a los metabolitos volátiles emitidos por los aislados bacterianos durante 15 días de confrontación (Fig. 1 y 2), con diferencias estadísticas significativas entre los aislados bacterianos.

Los metabolitos de los aislados bacterianos 33, 45-1, 9-2, 24, 51-2 y 29-2 produjeron los mayores porcentajes de inhibición del crecimiento micelial de M. roreri, con valores superiores al 62,5 %, sin diferencias significativas entre ellos; mientras que, el aislado 33 difirió con 53-4 y 72 y el 45-1 solo difirió del aislado 53-4. Este último fue el que tuvo el menor porcentaje de inhibición del crecimiento micelial con 56,25 %.

Los porcentajes de inhibición del crecimiento micelial obtenidos en este trabajo fueron superiores a los informados por de la Cruz et al. (1111. de la Cruz NL. Volátiles de bacterias endófitas de cacao y su efecto sobre Moniliophthora roreri. [Tesis para optar por el grado de Maestría en Ciencias en Recursos Naturales y Desarrollo Rural], El Colegio de la Frontera Sur, Chiapas, México, 2014; 57 pp.); de acuerdo con sus resultados, los compuestos volátiles emitidos por las bacterias endófitas B. pumilus CFFSUR-B34 y B. muralis CFFSUR-B38, solo alcanzaron una inhibición máxima de 37,5 % en M. roreri. Esto podría deberse, fundamentalmente. a las cepas utilizadas y el tipo de especie.

Por otro lado, estos resultados demostraron la actividad antifúngica de las bacterias endófitas provenientes de mazorcas de cacao sobre M. roreri, debido a la emisión de compuestos volátiles. En nuestro estudio no se identificaron los mismos; sin embargo, diversos investigadores informaron acerca de la emisión de compuestos volátiles (benzaldehído, el 1,2-bencisotiazol-3 (2 H) y el 1,3-butadieno) en cepas de Bacillus spp., con capacidad para inhibir el crecimiento de agentes fitopatogenos (44. Hong CE, Park JM. Endophytic bacteria as biocontrol agents against plant pathogens: current state-of-the-art. Plant Biotechnology Reports, 2016; 10(6): 353-357. Doi: 10.1007/s11816-016-0423-6., 1414. Tahir HAS, Gu Q, Wu H, Niu Y, Huo R, Gao X. Bacillus volatiles adversely affect the physiology and ultra-structure of Ralstonia solanacearum and induce systemic resistance in tobacco against bacterial wilt. Scientific reports, 2017; 7(1): 1-15. Doi: https://doi.org/10.1038/srep40481.).

Wu et al. (1515. Wu Y, Yuan J, Raza W, Shen Q, Huang Q. Biocontrol traits and antagonistic potential of Bacillus amyloliquefaciens strain NJZJSB3 against Sclerotinia sclerotiorum, a causal agent of canola stem rot. Journal of Microbiology & Biotechnology, 2014; 24:1327. Doi: http://dx.doi.org/10.4014/jmb.1402.02061.) informaron que los compuestos volátiles emitidos por B. amyloliquefaciens poseen actividad antimicrobiana de amplio espectro contra los hongos fitopatógenos Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum J.H. Owen, Fusarium oxysporum Schleicher Fr. f.sp. niveum (E. Smith) W. C. Snyder & H. N. Hans., Rhizoctonia solani Kühn, Fusarium oxysporum f. sp. cubense (E.F. Sm.), W.C. Snyder & H.N. Hansen y Verticillium dahliae Kleb. Años más tarde, Tahir et al. (1414. Tahir HAS, Gu Q, Wu H, Niu Y, Huo R, Gao X. Bacillus volatiles adversely affect the physiology and ultra-structure of Ralstonia solanacearum and induce systemic resistance in tobacco against bacterial wilt. Scientific reports, 2017; 7(1): 1-15. Doi: https://doi.org/10.1038/srep40481.) encontraron que los compuestos volátiles emitidos por B. amyloliquefaciens FZB42 y Bacillus artrophaeus LSSC22 protegieron las plantas de tabaco (Nicotiana tabacum L.) obtenidas in vitro y crecidas en macetas contra Ralstonia solanacearum (Smith.) Yabuuchi et al.

Con respecto a la inhibición de la esporulación de M. roreri, los aislados bacterianos 33, 45-1, 9-2, 24, 29-2 y 51-2 produjeron valores superiores al 60,85 %, sin diferencias significativas entre ellos; mientras que el aislado 33 difirió con el 53-4 y 72, y el 45-1 solo difirió del aislado 72. Este último fue el que tuvo el menor porcentaje de inhibición de esporulación con 50,6 %. (Fig. 3)

Los resultados del presente trabajo, respecto al efecto de los metabolitos volátiles emitidos por las bacterias endófitas sobre la inhibición de la esporulación de M. roreri, son un hallazgo que proporciona nuevas posibilidades de control de la enfermedad. Además, concuerdan con los informes de la Cruz et al. (1111. de la Cruz NL. Volátiles de bacterias endófitas de cacao y su efecto sobre Moniliophthora roreri. [Tesis para optar por el grado de Maestría en Ciencias en Recursos Naturales y Desarrollo Rural], El Colegio de la Frontera Sur, Chiapas, México, 2014; 57 pp.), quienes encontraron otros aislados endófitos del género Bacillus (B. muralis CFFSUR-B38, B. pumilus CFFS81UR-B34) aislados de hojas de cacao, capaces de emitir volátiles que disminuyeron en más de 81 % la formación de esporas de M. roreri.

Diferentes investigaciones demostraron el efecto negativo que provocan los compuestos volátiles de Bacillus sobre las funciones fisiológicas de los hongos, tales como la esporulación y germinación de esporas. Massawe et al. (1616. Massawe VC, Hanif A, Farzand A, Mburu DK, Ochola SO, Wu L, et al. Volatile compounds of endophytic Bacillus spp. have biocontrol activity against Sclerotinia sclerotiorum. Phytopathology, 2018; 108 (12):1373-1385. Doi: https://doi.org/10.1094/PHYTO-04-18-0118-R ) determinaron que ocho compuestos volátiles de Bacillus velezensis VM 11 redujeron la producción de esclerocios del hongo ascomycete Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary. y provocaron cambios morfológicos en las células miceliales.

Otros autores, como Nawaz et al. (1717. Nawaz HH, Rajaofera MN, He Q, Anam U, Lin C, Miao W. Evaluation of antifungal metabolites activity from Bacillus licheniformis OE-04 against Colletotrichum gossypii. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2018; 146: 33-42. Doi: https://doi.org/10.1016/j.pestbp.2018.02.007.), evaluaron la actividad de los metabolitos antifúngicos producidos por Bacillus licheniformis OE04 contra Colletotrichum gossypii Southw. Estos investigadores hallaron que la cepa en estudio inhibió in vitro de la germinación de esporas de C. gossypii. Ese estudio demostró el efecto potencial de B. licheniformis, como alternativa para el control de la antracnosis del algodón.

Recientemente, Rong et al. (1818. Rong S, Xu H, Li L, Chen R, Gao X, Xu Z. Antifungal activity of endophytic Bacillus safensis B21 and its potential application as a biopesticide to control rice blast. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2020; 162: 69-77. Doi: 10.1016/j.pestbp.2019.09.003.) informaron a la bacteria endofítica Bacillus safensis B21 con potencialidades bioplaguicidas para el control del añublo del arroz causado por el hongo fitopatógeno Magnaporthe grisea (T.T. Hebert) M.E. Barr. Estos autores adjudican ese efecto, principalmente, a la producción de compuestos antifúngicos bioactivos como las iturinas.

El presente trabajo demuestra la actividad antifúngica in vitro que ejercieron los metabolitos volátiles emitidos por las especies endófitas del género Bacillus, aisladas de mazorcas de cacao, sobre el crecimiento micelial y esporulación de M. roreri. Este resultado proporciona nuevas posibilidades para el control de la moniliasis.