El frijol (Phaseolus vulgaris L.) es una de las leguminosas de grano más importante para el consumo humano. En Cuba, las condiciones de suelo y clima favorecen su cultivo, lo que conlleva a que se establezca en la mayoría del territorio nacional (11. Calero-Hurtado A, Díaz YP, Rodriguez E, Viciedo D, Calzada K. Efecto de la aplicación asociada entre Rhizobium leguminosarum y microorganismos eficientes sobre la produccióndel frijol común. Ciencia y tecnología agropecuearia. 2019; 20(2).). Sin embargo, diferentes factores limitan su producción, entre los que se destaca la presencia de la enfermedad del mosaico amarillo dorado del frijol, ocasionada principalmente por el begomovirus Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV), transmitido por la mosca blanca Bemisia tabaci (22. Echemendía A, Ramos González P, Peral Pérez R, Porras González Á, González Arias GA. Selección de genotipos de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) resistentes al virus del mosaico dorado amarillo del frijol (BGYMV) por hibridación de ácidos nucleicos. Fitosanidad. 2007;11(4):3-11., 33. Chang-Sidorchuk L, Alvarez HG, Martínez Zubiaur Y. Begomoviruses infecting common beans (Phaseolus vulgaris L.) in production areas in Cuba. Span. J. Agric. Res. 2018;16(2):23.).
Los genotipos de frijol susceptibles, infectados en las primeras etapas de desarrollo, generalmente muestran un amarillamiento sistémico intenso y pueden tener pérdidas totales debido a la alta incidencia de aborto de flores y la deformación de las vainas (44. Galvez GE, Morales FJ. Whitefly-transmitted viruses. En: Bean Production Problems in the Tropics. 2nd ed. H.F. Schwartz and M. A. Pastor-Corrales, eds. Centro Internacional de Agricultura Tropical, Cali, Colombia. 1989. p. 379-406).
La primera evidencia de esta enfermedad en Cuba se informó a mediados de la década del 70 y ocasionó graves pérdidas en la producción (55. Blanco N, Lastres N, Bencomo I. Incidencia de las enfermedades virosas del frijol en Cuba. Ciencias de la Agricultura [Cuba]. 1984;19:21-22.). La incidencia de BGYMV disminuyó a finales de los 90 y primeros años de la década de 2000, debido a la introducción de cultivares resistentes acompañados de programas de manejo y prevención (11. Calero-Hurtado A, Díaz YP, Rodriguez E, Viciedo D, Calzada K. Efecto de la aplicación asociada entre Rhizobium leguminosarum y microorganismos eficientes sobre la produccióndel frijol común. Ciencia y tecnología agropecuearia. 2019; 20(2).). Sin embargo, en los últimos años se ha observado un incremento de los síntomas de la enfermedad en las áreas de producción, posiblemente influenciados por el acceso limitado a nuevos cultivares y el aumento en la diversidad de semillas introducidos por los agricultores, dada la necesidad de aumentar los alimentos, ignorando los programas de mejoramiento genético para resistencia a los begomovirus (66. de la Fé Montenegro CF, Lamz Piedra A, Cárdenas Travieso RM, Hernández Pérez J. Respuesta agronómica de cultivares de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) de reciente introducción en Cuba. Cultivos Tropicales. 2016;37 (2): 102-107).
El mejoramiento genético para la resistencia a este virus es una de las estrategias más efectivas para el control de la enfermedad. Una de las fuentes de resistencia aplicada ampliamente al BGYMV es el gen recesivo bgm-1, derivado del cultivar local Garrapato (México) que condiciona una resistencia parcial sin mosaico como respuesta al patógeno (77. Urrea CA, Miklas PN, Beaver JS, Riley RH. A codominant RAPD marker useful for indirect selection of BGMV resistance in common bean. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1996;121(6):1035-1039). Ligado a este gen, se ha descrito el marcador molecular SCAR SR2 que es codominante y polimórfico, derivado del marcador RAPD R2 (88. Blair MW, Lina MR, Pedraza F, Morales F, Beeb S. Genetic mapping of the bean golden yellow mosaic geminivirus resistance gene bgm-1 and linkage with potyvirus resistance in common bean (Phaseolus vulgaris L.). Theor Appl Genet. 2007;114:261-271. ). El objetivo de este trabajo fue evaluar el comportamiento de genotipos de frijol frente a la enfermedad del mosaico amarillo dorado del frijol, así como la identificación del gen de resistencia bgm-1 a partir del marcador SR2 en genotipos de la colección de trabajo del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA).
El experimento se desarrolló en la finca de producción de semilla del INCA. La siembra se realizó sobre un suelo Nitisol ferrálico lixiviado típico (éutrico, ródico, arcíllico) (99. Hernández A, Pérez J, Bosh D, Castro N. Clasificación de los suelos de Cuba. 2015. Ediciones INCA, Mayabeque, Cuba. 1025, 93p. ISBN 978-959-7023-77-7), en época temprana, en septiembre de 2018, con condiciones favorables para una alta incidencia de la mosca blanca (Bemisia tabaci Gen.) (1010. Faure B, Benítez R, García A, Ortega L. Manual para la producción sostenible del frijol común. Artemisa, Cuba. Instituto de Investigaciones de Granos. 2017; 114 p.). Se realizaron parcelas experimentales en un diseño aumentado modificado con una densidad de siembra de 200000 plantas por hectárea. En la siembra se incluyeron los cultivares `Velasco Largo´, altamente susceptible a la enfermedad del mosaico amarillo dorado del frijol y `Delicia 364´ (DOR 364), catalogado como altamente resistente y con presencia del gen bgm-1 (1010. Faure B, Benítez R, García A, Ortega L. Manual para la producción sostenible del frijol común. Artemisa, Cuba. Instituto de Investigaciones de Granos. 2017; 114 p.).
Se evaluaron 61 genotipos procedentes de la colección de trabajo de frijol del Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INCA), donde se incluyen 34 líneas experimentales, 16 cultivares comerciales y materiales colectados en fincas de agricultores de alto valor comercial.
Se tomaron muestras de plantas en etapa de floración y se realizó la extracción de ADN (1111. Permingeat HR, Romagnoli MV, Vallejos RH. A simple method for isolating high yield and quality DNA from cotton (Gossypium hirsutum L.) leaves. Plant Mol. Biol. Rep. 1998; 16: 1-6). El ADN obtenido de cada una de las muestras de los 61 genotipos analizados se sometió a la amplificación por PCR con los marcadores moleculares SCAR SR2 (SR2-F: 5´CACAGCTGCCACAGGTGGGA3´ y SR2-R: 5´CACAGCTGCCCTAACAAAAT3´) para seleccionar plantas portadoras del gen de resistencia a BGYMV (88. Blair MW, Lina MR, Pedraza F, Morales F, Beeb S. Genetic mapping of the bean golden yellow mosaic geminivirus resistance gene bgm-1 and linkage with potyvirus resistance in common bean (Phaseolus vulgaris L.). Theor Appl Genet. 2007;114:261-271. ).
Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 25 µl que contenía, aproximadamente, 50 ng de ADN genómico, 12,5 μl de GoTaq Green Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) con una concentración de 1.5 mM MgCl2, 100 μM de dNTPs y 10 pmol de cada uno de los cebadores SR2-F y SR2-R. La reacción de PCR se realizó en un termociclador Heal Force TOUCH T 960 (Hong Kong) con el siguiente programa de amplificación: una desnaturalización inicial de 2 min a 94°C seguida de 30 ciclos de 30 s a 94°C, 1 min a 60°C y 1 min a 72°C, y una extensión final de 5 min a 72°C. Los productos de amplificación se visualizaron por medio de electroforesis en gel de agarosa al 2 % y tinción con bromuro de etidio en un transiluminador de luz ultravioleta. A partir de los resultados se analizó la presencia del gen bgm-1 en los genotipos.
La evaluación de la severidad de los síntomas de BGYMV se realizó mediante el examen de las plantas en la etapa de floración; se siguió la escala de nueve grados propuesta por CIAT (1212. CIAT: Sistema estándar para la evaluación de germoplasma de frijol, Centro Internacional de Agricultura Tropical, Cali, Colombia, 1991.), basándose solamente en la incidencia en campo de la enfermedad (Tabla 1).
A partir del análisis por PCR con los cebadores S2, fue posible identificar 19 genotipos con presencia del gen bgm-1 en estado recesivo (bgm-1/bgm-1), el cual ofrece resistencia a BGYMV (Tabla 2). Las líneas experimentales fueron las más representadas, con 16 genotipos con presencia del gen bgm-1. En los cultivares comerciales, solo dos (ʻTriunfo 70ʼ y el testigo ʻDelicias 364 ʼ) presentaron el gen bgm-1.
Se pudo evidenciar que el tamaño de los fragmentos amplificados fue de 530 pb en los genotipos resistentes o 570 pb en los genotipos susceptibles; presentaron resistencia en su combinación homocigota recesiva (bgm-1/bgm-1) y susceptibilidad en su combinación homocigota dominante (Bgm-1/Bgm-1) y heterocigota (Bgm-1/bgm-1), lo que permite la identificación de plantas resistentes al virus (88. Blair MW, Lina MR, Pedraza F, Morales F, Beeb S. Genetic mapping of the bean golden yellow mosaic geminivirus resistance gene bgm-1 and linkage with potyvirus resistance in common bean (Phaseolus vulgaris L.). Theor Appl Genet. 2007;114:261-271. ).
*Electroforesis en gel de agarosa al 2 % del ADN de genotipos de frijol amplificado por PCR con los cebadores SR2.
En cuanto a la evaluación de los síntomas, 16 de los 19 genotipos portadores del gen bgm-1 en homocigosis recesiva, mostraron grado 1, de acuerdo a la escala de síntomas utilizada, lo que confirma la efectividad de la presencia de este gen en estado recesivo para conferir resistencia a BGYMV. Sin embargo, los genotipos ʻSEN 97ʼ, ʻTriunfo 70ʼ y ʻP 219ʼ mostraron síntomas ligeros de la infección, típicos de la presencia de BGYMV a pesar de la presencia del gen en estado recesivo. A partir de estos resultados se pueden recomendar las siguientes líneas experimentales para continuar en el programa de mejoramiento genético para la resistencia a BGYMV: SEN 89, SEN 98, SEN 99, SMB 17, SCR 9, SCR 16, SEN 74, SEN 77, SCN 7, SEN 94, SEN 95, SCN 12, SMB 13.
Los genotipos ʻCUFIG145ʼ, ʻCul 156ʼ y ʻRED -KLOUDʼ presentaron los mayores valores de severidad (grado 7 y 8) identificados en campo, con síntomas generales intensos similares a los detectados en ʻVelasco Largoʼ (testigo susceptible), por lo que no se recomienda la introducción de estos cultivares comerciales en la producción.
Por otro lado, se detectaron 32 genotipos sin síntomas o síntomas ligeros (grados 1 y 2) y no presentaron el gen bgm-1 en estado de resistencia, lo que pudiera indicar la presencia de otros genes de resistencia relacionados con la enfermedad del mosaico amarillo dorado del frijol. Por tanto, se recomienda profundizar en su estudio para la detección de otras posibles fuentes de resistencia.
Aunque en términos prácticos, el gen bgm-1 es el más importante para conferir resistencia a BGYMV (1313. Beebe SE, Ochoa I, Skroch P, Nienhuis J, Tivang J. Genetic diversity among common bean breeding lines developed for Central America. Crop Sci. 1995; 35(4):1178-1183., 1414. Singh SP, Morales FJ, Miklas PN, Terán H. Selection for bean golden mosaic resistance in intra- and interracial vean populations. Crop. Sci. 2000; 40:1565-1572.), este gen está asociado con la resistencia a los síntomas generales de la enfermedad como amarillamiento o clorosis, pero no con síntomas como el enanismo, que se relaciona con otros factores de resistencia como el gen Dwf (88. Blair MW, Lina MR, Pedraza F, Morales F, Beeb S. Genetic mapping of the bean golden yellow mosaic geminivirus resistance gene bgm-1 and linkage with potyvirus resistance in common bean (Phaseolus vulgaris L.). Theor Appl Genet. 2007;114:261-271. ). Otros genes de resistencia son más eficaces cuando están presentes con el gen bgm-1, como son Bgp1, ligado al desarrollo normal de las vainas durante la infección (1515. Acevedo M, Molina A, Angel JC, Muñoz C, Beaver J. Inheritance of normal pod development in bean golden yellow mosaic resistant common bean. J Am Soc Hort Sci. 2004;129(4):549-552.), o el locus W12 de resistencia a BGYMV (1616. Miklas PN, Delorme R, Stone V, Daly MJ, Stavely JR, Basset MJ, et al. Bacterial, fungal and viral disease resistance loci mapped in a recombinant inbred common bean population (“Dorado”/XAN 176). J Am Soc Hort Sci. 2000; 125:476-481).
El gen bgm-1 reduce el mosaico y el amarillamiento sistémico, típicos de la enfermedad; ha sido especialmente importante y efectivo en América Central (1313. Beebe SE, Ochoa I, Skroch P, Nienhuis J, Tivang J. Genetic diversity among common bean breeding lines developed for Central America. Crop Sci. 1995; 35(4):1178-1183.) y ha demostrado que es un gen estable y valioso para generar cultivares tolerantes al mosaico amarillo dorado del frijol (88. Blair MW, Lina MR, Pedraza F, Morales F, Beeb S. Genetic mapping of the bean golden yellow mosaic geminivirus resistance gene bgm-1 and linkage with potyvirus resistance in common bean (Phaseolus vulgaris L.). Theor Appl Genet. 2007;114:261-271. ).
BGYMV es la enfermedad viral del frijol más seria y limitante en Centroamérica y el Caribe. Para controlar esta enfermedad, es necesario pirimidizar genes que confieran resistencia, no solo a BGYMV, sino también a otras enfermedades transmitidas por la mosca blanca. La selección asistida por marcadores permite eliminar segregantes en generaciones tempranas y optimiza el espacio y los recursos dedicados a la población en desarrollo y permite hacer una selección en líneas avanzadas para confirmar la presencia de genes de resistencia a BGYMV antes de incluir estás líneas como progenitoras (88. Blair MW, Lina MR, Pedraza F, Morales F, Beeb S. Genetic mapping of the bean golden yellow mosaic geminivirus resistance gene bgm-1 and linkage with potyvirus resistance in common bean (Phaseolus vulgaris L.). Theor Appl Genet. 2007;114:261-271. ).
Los resultados en este trabajo son un soporte al programa de mejoramiento del frijol común en Cuba, pues permitieron la identificación de una fuente de resistencia a esta importante enfermedad y conocer su presencia y la reacción en campo en cultivares comerciales, en cultivares que están en la producción a nivel local y en líneas experimentales que están próximas a ser liberadas por su comportamiento agronómico.
Ello permite clasificar en breve tiempo los genotipos presentes en la colección y el empleo de estos materiales como fuentes de resistencia a la enfermedad para progresar en la obtención de nuevos genotipos y la clasificación de su comportamiento ante el BGYMV.