Para comparar la velocidad de crecimiento entre el antagonista y los fitopatógenos, a partir de monocultivos fúngicos con siete días de crecimiento, se tomaron discos de micelio (5 mm de diámetro) de las cepas en estudio; se depositaron en puntos equidistantes en placas Petri (90 mm de diámetro) que contenían medio de cultivo PDA. Se consideraron cuatro réplicas por hongo fitopatógeno en enfrentamiento dual y los respectivos controles sin el antagonista; el crecimiento micelial se registró durante 13 días (88. Macías de la CG, Vean F, Contreras EJC, Aguilar CN, Rodríguez HR. Cinética de crecimiento de Fusarium oxysporum cultivado en diferentes niveles de glucosa y pectina. Investig Cienc. 2016; 24(67):33-37.).

Las placas se mantuvieron a 28±2°C bajo un régimen de luz/oscuridad durante 8-16 horas, se tomó el registro del crecimiento a partir del segundo día de la siembra (99. Bunbury BAL, Walker AK. Trichoderma species show biocontrol potential in dual culture and greenhouse bioassays against Fusarium basal rot of onion. Biological Control2018; https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2018.11.007 ). Para calcular la competencia, se determinó la inhibición del crecimiento micelial (ICM) con la fórmula $PICR=\frac{R1-R2}{R1}x100\mathrm{}$

Donde:

Para estimar el porcentaje de micoparasitismo de T. asperellum Ta13-17 sobre los hongos fitopatógenos, se utilizó el procedimiento indicado en competencia por espacio en cultivos duales. Cuando el antagonista sobrecreció la cepa del patógeno (onceavo día), se comparó con la escala propuesta por Bell et al. (1111. Bell DK, Wells HD, Markham CR. “In vitro” antagonism of Trichoderma species against six fungal plant pathogens. Phytopathol Res. 1982;(72):379-382.) de cinco clases, a las que se les asignaron valores en porcentaje: 1=100 %; 2=92,05 %; 3=50 %; 4=7,95 % y 5=0 %, obtenidas con el programa 2LOG v. 1.0. (1212. Ochoa MA, Rivas V, Góngora C, Tovar S, Cristóbal J, Loeza K, et al. Sistemas computarizados en epidemiología: 2-Log ver. 1.0 y su aplicación en el diseño de escalas diagramáticas logarítmicas. XXIX Simposio Nacional de Parasitología Agrícola. 2000. Puerto Vallarta, México.).

Para determinar la capacidad de inhibición del crecimiento micelial (ICM) de los fitopatógenos, causada por metabolitos no volátiles producidos por el antagonista, se dejó crecer a T. asperellum Ta13-17 en medio de cultivo caldo de papa más dextrosa (PDB) durante 21 días; posteriormente, se filtró a través de una gasa estéril. El filtrado se colocó en tubos Falcón de 50 ml, se centrifugó cuatro veces (20 minutos, 3000 rpm) y se recuperó el sobrenadante en un matraz de 500 ml. Para eliminar las esporas del antagonista, el filtrado se pasó tres veces a través de un filtro millipore de 0,22 µm. Este filtrado se usó en la preparación de medio PDA (1:1 V/V). La incorporación del filtrado al medio PDA se realizó antes que solidificara. En el centro de la placa Petri se sembró un disco de micelio de 5 mm de cada cepa de los fitopatógenos de siete días de crecimiento (1313. Michel-Aceves AC, Otero-Sánchez MA, Rebolledo-Domínguez O, Lezama-Gutiérrez R, Ochoa-Moreno ME. Producción y efecto antagónico de quitinasas y glucanasas por Trichoderma spp., en la inhibición de Fusarium subglutinans y Fusarium oxysporum in vitro. Rev Chapingo Ser Hortic. 2005;11(2): 273-278.).

Cada cepa del hongo fitopatógeno se consideró como tratamiento con cuatro repeticiones, con sus respectivos testigos sembrados en medio PDA sin adición del filtrado. Las placas se incubaron a una temperatura entre 28±2°C. Se midió el radio de crecimiento de los fitopatógenos cada tres días hasta que los testigos llenaron las placas.

El porcentaje de inhibición del crecimiento radial se estimó con la fórmula propuesta por Samaniego (1010. Samaniego J, Ulloa A, Herrera T. Hongos del suelo antagónicos de Phymatorichum omnivorum. Rev Mex Fitopatol. 1989;7(1):86-95.).

Se determinó la esporulación en los tratamientos donde hubo crecimiento micelial del hongo fitopatógeno. Para ello se agregaron 10 ml de agua destilada estéril y se realizó un raspado de micelio con un porta objetos; se filtró a través de una gasa, se tomaron 10 µl de la solución de esporas y los conidios se contaron en una cámara Neubauer. Se calculó el porcentaje de inhibición de esporulación (IE) con la fórmula $\%IE=\frac{Test-Trat}{Test}x100$

Donde

Para determinar la inhibición de germinación de los conidios (IGC), se consideraron 100 conidios incorporados en placas Petri de 9 cm de diámetro, que contenían medio de cultivo PDA y filtrado de T. asperellum Ta13-17, así como 100 conidios en placas Petri solo con PDA como testigo. Se contabilizó el número de conidios germinados a las 48 h posteriores a la siembra (1313. Michel-Aceves AC, Otero-Sánchez MA, Rebolledo-Domínguez O, Lezama-Gutiérrez R, Ochoa-Moreno ME. Producción y efecto antagónico de quitinasas y glucanasas por Trichoderma spp., en la inhibición de Fusarium subglutinans y Fusarium oxysporum in vitro. Rev Chapingo Ser Hortic. 2005;11(2): 273-278.).

Se determinó la actividad enzimática de quitinasas y glucanasas de la cepa T. asperellum Ta13-17, en medio de cultivo mínimo (0,24 g de MgSO₄·7H₂O; 0,24 g de KCl; 1,2 g de NH₄NO₃; 0,0024 g de ZnSO₄·7H₂O; 0,0024 g de MgCl₂·7H₂O; 1,08 g de K₂HPO₄; 0,0024 g de FeSO₄·7H₂O), pH 5,6 ± 2. Se utilizaron matraces de 125 ml con 30 ml de medio y 3 µl de cloranfenicol.

Para la inducción de quitinasas se agregó 1 % de quitina coloidal y 0,5 % de micelio seco de Fusarium equiseti ITC32 para las glucanasas (1414. Romero CT, López PP, Ramírez LM, Cuervo PJ. Modelado cinético del micoparasitismo por Trichoderma harzianum contra Cladosporium cladosporioides aislado de frutos de cacao (Theobroma cacao). Chil J Agric Anim Sci. 2015; 31(3):32-45.). Se inoculó 1 ml de una suspensión de conidios de T. asperellum Ta13-17 a una concentración de 1 x 10⁶ conidios.ml^-1; se incubó a 28ºC, 12 horas luz/oscuridad y 60 % de humedad relativa, en un agitador rotatorio a 110 rpm. Se tomaron muestras del cultivo a los 3, 5 y 7 días; se extrajeron 10 ml en cada día de evaluación. Las muestras se centrifugaron a 3000 rpm durante 30 minutos y se congelaron a -20°C hasta su uso (1313. Michel-Aceves AC, Otero-Sánchez MA, Rebolledo-Domínguez O, Lezama-Gutiérrez R, Ochoa-Moreno ME. Producción y efecto antagónico de quitinasas y glucanasas por Trichoderma spp., en la inhibición de Fusarium subglutinans y Fusarium oxysporum in vitro. Rev Chapingo Ser Hortic. 2005;11(2): 273-278.).

Para la actividad de quitinasas, se recuperó 1 ml del sobrenadante de las muestras y se agregó 1 ml de quitina coloidal (sustrato), incubándose por 1 hora a 50°C. Posteriormente, se adicionó 1 ml de NaOH al 1 % y se centrifugó a 3 000 rpm durante 10 minutos. Se recuperó 1 ml del sobrenadante y se agregó 1 ml de ácido 3,5-dinitrosalicilico (DNS) (1515. Miller GL. Use of DinitrosaIicyIic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem. 1959; 31(3):426-428.). Para detener la reacción, se mezcló en vortex y se llevó a ebullición durante cinco minutos y se enfrió en hielo inmediatamente. Por último, se adicionaron 2 ml de agua destilada, se mezcló y se realizó la lectura en un espectrofotómetro (RAYLEÍGH UV-2601) a 540 nm. La curva patrón se determinó con N-acetil glucosamina (NAG) a partir de una solución estándar de 1 mg.ml^-1.

Para determinar la actividad de glucanasas, se tomaron 250 µl de laminarina a 0,5 % disuelta en buffer de acetato de sodio (0,05 M; pH 5) y se agregaron 250 µl de la muestra; se incubó a 40°C durante 30 minutos. Posteriormente, se detuvo la reacción y se agregaron 500 µl de DNS, se llevó a ebullición durante cinco minutos, se enfrió y se agregó 1 ml de agua destilada, se agitó en vortex y se dio lectura en el espectrofotómetro a 540 nm, se comparó con la curva patrón a base de una solución estándar de 1 mg.ml^-1 de glucosa (1616. Ayoubi N, Zafari D, Mirabolfathy M. Evaluation of β-1,3-glucanase and β-1,4-glucanase enzymes production in some Trichoderma species. Arch. Phytopathol. Pflanzenschutz. 2014;47(16):1929-1941.). Se reportaron las unidades de actividad enzimática de quitinasas (UQ) expresada como micromoles de N-acetilglucosamina y, para el caso de glucanasas (UG), expresada como µmoles de glucosa/minuto en las condiciones dadas de cada reacción, respectivamente.

La distribución de los tratamientos se hizo en un diseño experimental completamente al azar. Con la información que se obtuvo se realizaron análisis de varianza (ANDEVA) y, cuando hubo diferencias estadísticas significativas, se hizo una comparación de medias con el método de Tukey (p≤0,05). Los datos en porcentaje se transformaron mediante la función de arcoseno: $arcseno\sqrt{\frac{y}{100}}$ . Los análisis se hicieron en el paquete estadístico InfoStat Ver. Libre.

T. asperellum Ta13-17 alcanzó la mayor superficie de crecimiento desde el día tres de la siembra (Fig. 1), seguido por C. lunata (ITC22), que logró el máximo crecimiento hasta el día siete. Los hongos F. oxysporum (ITC33), C. cassiicola (ITC23), F. equiseti (ITC32) y A. alternata (ITC24) presentaron crecimiento lento en comparación con el antagonista, incluso no alcanzaron a cubrir por completo el espacio en el que crecen. A. alternata (ITC24) presentó el menor crecimiento con 3,24 cm de radio.

La prevalencia de las especies de Trichoderma en distintos sustratos y ambientes muestra la capacidad y su plasticidad biológica para competir por recursos nutricionales, lo que favorece su tasa de crecimiento en diferentes sustratos (66. Zeilinger S, Gruber S, Bansal R, Mukherjee KP. Secondary metabolism in Trichoderma-Chemistry meets genomics. Fungal Biology. 2016;(30):74-90.).

Al quinto día de evaluación, el mayor porcentaje de inhibición micelial fue en A. alternata (ITC24) y en F. oxysporum (ITC33) (Tabla 1). En un estudio con dos aislados de T. asperellum contra Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., Curvularia lunata (Wakker) Boedijn y Fusarium oxysporum Smith & Swingle, los porcentajes de inhibición en el crecimiento micelial fueron de 49, 53 y 84 %, respectivamente (1717. Ramírez OJ, Trujillo SJ, Osorio EV, Jaramillo CM, Botero BL. In vitro antagonism of Trichoderma asperellum against Colletotrichum gloeosporioides, Curvularia lunata, and Fusarium oxysporum. Rev. UIS Ingenierías. 2019; 18(2):159-165 DOI: 10.18273/revuin.v18n2-2019015.).

Los resultados de otros autores con estudios en Trichoderma spp. estimaron inhibiciones entre 70 y 76 % en el crecimiento micelial de los fitopatógenos Rhizoctonia solani J.G. Kühn y M. phaseolina (Tassi) Goid (1818. Rahman KM, Haque Z, Rasool F, Salati K, Khan U, Mohiddin FA, et al. Management of root-rot disease complex of mungbean caused by Macrophomina phaseolina and Rhizoctonia solani through soil application of Trichoderma spp. Crop Prot. 2019; doi: https://doi.org/10.1016/j.cropro.2019.01.014. , 1919. Sánchez- GBM, Espinosa HE, Villordo PE, Rodríguez GR, Mora AMA. Identificación molecular y evaluación antagónica in vitro de cepas nativas de Trichoderma spp. sobre hongos fitopatógenos de raíz en frijol (Phaseolus vulgaris l.) cv. Montcalm. Agrociencia. 2017;(51): 63-79.). En otro trabajo evaluaron cinco especies de Trichoderma contra C. gloeosporioides y observaron, con T. asperellum y T. longibranchiatum Rifai, inhibiciones en crecimiento micelial con valores de 22,5 y 21,9 %, en su orden (2020. De la Cruz QR, Roussos S, Rodríguez HR, Hernández CD, Aguilar CN. Growth inhibition of Colletotrichum gloeosporioides and Phytophthora capsici by native Mexican Trichoderma strains. KIJOMS. 2018;(20):1-7. https://doi.org/10.1016/j.kijoms.2018.03.002 ). En el mismo contexto, un estudio indicó con otra cepa de T. asperellum efectividad antagónica contra distintas cepas de Fusarium aisladas de melón, con inhibiciones miceliales del 54,9 al 74,1 % (2121. Espinoza ACA, Gallegos MG, Hernández CFD, Ochoa FYM, Cepeda SM, Castillo RF. Antagonistas microbianos a Fusarium spp., como agente causal de pudrición de raíces y tallo en melón. Ecosistemas y recursos agropecuarios. 2019;6(16): 45-55. DOI: 10.19136/era.a6n16.1843.).

En condiciones adversas, el género Trichoderma está adaptado para colonizar sustratos y sobrevivir en forma de clamidosporas, lo que le da una ventaja en la competencia por espacio y nutrientes contra otros microorganismos (2222. Osorio HE, Hernández CFD, Rodríguez HR, Varela FSE, Estrada DB, López SJA. Actividad antagónica de Trichoderma spp. sobre Rhizoctonia solani in vitro. Investigación y Ciencia de la Universidad Autónoma de Aguascalientes. 2016;(67):5-11.).

En el micoparasitismo de T. asperellum Ta13-17, se tuvieron diferencias estadísticas significativas (p≤0,01). En C. lunata (ITC22) y A. alternata (ITC24) se registró 100 %; el antagonista cubrió, creció y esporuló por encima de estos hongos fitopatógenos. En el resto de las especies fitopatógenas: C. cassiicola (ITC23), F. equiseti (ITC32) y F. oxysporum (ITC33), el micoparasitismo fue de 92 al 94 %; el antagonista creció aproximadamente tres cuartas partes del medio de cultivo (Tabla 1).

En otro estudio, cepas de Trichoderma colonizaron 100 % de la superficie del medio con crecimiento sobre los siguientes fitopatógenos: F. solani (Mart.) Sacc, F. oxysporum (Mart.) Sacc y F. verticillioides (Sacc.) Nirenberg, 10 días después de la inoculación (1818. Rahman KM, Haque Z, Rasool F, Salati K, Khan U, Mohiddin FA, et al. Management of root-rot disease complex of mungbean caused by Macrophomina phaseolina and Rhizoctonia solani through soil application of Trichoderma spp. Crop Prot. 2019; doi: https://doi.org/10.1016/j.cropro.2019.01.014. ). También, una cepa de T. asperellum contra F. oxysporum ejerció micoparasitismo, lo que sugiere la consistencia de esta especie antagonista contra aislados de Fusarium (44. Cruz TA, Rivero GD, Martínez CB, Echevarría HA, Rodríguez AT. Evaluación de la actividad antifúngica de Trichoderma asperellum Samuels ante patógenos fúngicos que afectan al cultivo de la soya (Glycine max L.). Cultivos Tropicales. 2017;38(4): 15-21.).

El proceso micoparasítico de Trichoderma es complejo, ya que involucra el crecimiento quimiotrófico hacia el hongo fitopatógeno, estimulado por aminoácidos y azúcares, mediado por lectinas, seguido por la formación de estructuras especializadas, similares a los apresorios que contienen solutos osmóticamente como el glicerol, lo que facilita la penetración, la secreción de enzimas hidrolíticas extracelulares y, con ello, la muerte del fitopatógeno (2222. Osorio HE, Hernández CFD, Rodríguez HR, Varela FSE, Estrada DB, López SJA. Actividad antagónica de Trichoderma spp. sobre Rhizoctonia solani in vitro. Investigación y Ciencia de la Universidad Autónoma de Aguascalientes. 2016;(67):5-11.).

A partir del día seis de establecido el experimento, el filtrado libre de células de T. asperellum Ta13-17 causó inhibición de crecimiento en los hongos fitopatógenos en estudio. Solo en C. cassiicola (ITC23) no hubo inhibición de crecimiento micelial por encima del 50 %; en el resto de los fitopatógenos, la inhibición micelial fue superior al 80 % (Tabla 2).

En las siguientes evaluaciones en C. lunata (ITC22) y F. equiseti (ITC32) se mantuvo una inhibición de al menos 92 %.

Sin embargo, en A. alternata (ITC24) y F. oxysporum (ITC33), la actividad antifúngica del filtrado disminuyó. Estos resultados sugieren que los metabolitos secundarios en el medio de cultivo se volatilizaron e hizo que se perdiera efectividad en el transcurso del tiempo, incluso pudo estar asociado a una baja concentración de metabolitos en el medio de cultivo (2222. Osorio HE, Hernández CFD, Rodríguez HR, Varela FSE, Estrada DB, López SJA. Actividad antagónica de Trichoderma spp. sobre Rhizoctonia solani in vitro. Investigación y Ciencia de la Universidad Autónoma de Aguascalientes. 2016;(67):5-11.). Finalmente, en C. cassiicola (ITC23) no se observaron cambios en la inhibición del crecimiento micelial (Tabla 2). El filtrado del antagonista causó inhibición total en la esporulación y germinación de conidios, excepto en C. lunata (ITC22) y en F. oxysporum (ITC33). (Tabla 2)

En otro estudio con F. oxysporum se reportaron porcentajes de inhibición micelial superior al 40 % con dos de 25 filtrados de cepas de Trichoderma; las cepas que evaluaron fueron capaces de reducir al menos 30 % la germinación de conidios del patógeno (1313. Michel-Aceves AC, Otero-Sánchez MA, Rebolledo-Domínguez O, Lezama-Gutiérrez R, Ochoa-Moreno ME. Producción y efecto antagónico de quitinasas y glucanasas por Trichoderma spp., en la inhibición de Fusarium subglutinans y Fusarium oxysporum in vitro. Rev Chapingo Ser Hortic. 2005;11(2): 273-278.).

La capacidad antagonista del género Trichoderma se debe, principalmente, a la producción de antibióticos como peptaibol, trichozianinas A1 y B1, con actividad inhibitoria en la germinación de esporas y en la elongación de hifas de hongos fitopatógenos (44. Cruz TA, Rivero GD, Martínez CB, Echevarría HA, Rodríguez AT. Evaluación de la actividad antifúngica de Trichoderma asperellum Samuels ante patógenos fúngicos que afectan al cultivo de la soya (Glycine max L.). Cultivos Tropicales. 2017;38(4): 15-21.).

La excreción de metabolitos difusibles en el entorno, por parte de Trichoderma spp., ocurre desde periodos muy tempranos de la interacción. Estos metabolitos secundarios son producto de un proceso celular estrictamente regulado, donde influyen las condiciones ambientales y la expresión de genes, controlado por interacciones con otros microorganismos, señalización de pH y complejos de proteínas (66. Zeilinger S, Gruber S, Bansal R, Mukherjee KP. Secondary metabolism in Trichoderma-Chemistry meets genomics. Fungal Biology. 2016;(30):74-90.).

En ambos medios de cultivo se produjo actividad enzimática independiente del inductor utilizado. La producción de quitinasas se mantuvo constante en los tres días de evaluación. La actividad de glucanasas se incrementó en el día siete con 0,203 UG. Se tienen reportes con T. asperellum que la mayor actividad enzimática de glucanasas se produce cuando se tiene un medio con suplemento con pared celular del fitopatógeno; mientras que, la producción de quitinasas en medio enriquecido con quitina, alcanzó un máximo después de siete días de crecimiento y disminuyó a partir de entonces (2323. Vargas HHA, Gilchrist RE. Producción de enzimas hidrolíticas y actividad antagónica de Trichoderma asperellum sobre dos cepas de Fusarium aisladas de cultivos de tomate (Solanum lycopersicum). Rev Mex Micol. 2015;42: 9-16.). La mayor producción de quitinasas por Trichoderma spp. en medio basal enriquecido con quitina se reportó al tercer y séptimo día de evaluación del cultivo (2424. González I, Infante D, Peteira B, Martínez B, Arias Y, González N, et al. Caracterización bioquímica de aislamientos de Trichoderma spp. promisorios como agentes de control biológico. I. Expresión de actividad quitinasa. Rev Protección Veg. 2010;25(1):58-63. ). La mejor producción de glucanasas se reportó en el día uno y tres en medio basal enriquecido con gelatina (2525. González I, Infante D, Peteira B, Martínez B, Arias Y, González N, et al. Caracterización bioquímica de aislamientos de Trichoderma spp. promisorios como agentes de control biológico. II. Expresión de actividad glucanasa. Rev Protección Veg. 2011;26(1): 23-29.).

La producción de estas enzimas para el día siete podría estar asociado con el inicio del micoparasitismo que ejerció T. asperellum Ta13-17 con los fitopatógenos cuando se confrontaron. Se encontró que, aproximadamente en el día siete de la confrontación, el antagonista y el fitopatógeno entran en contacto y comienza la actividad de micoparasitismo; para facilitar la penetración del antagonista las enzimas extracelulares, principalmente quitinasas, glucanasas y proteasas, juegan un papel importante en la hidrólisis de paredes celulares del fitopatógeno (55. Naglot A, Goswami S, Rahman I, Shrimali DD, Yadav KK, Gupta VK, et al. Antagonistic Potential of Native Trichoderma viride Strain against Potent Tea Fungal Pathogens in North East India. Plant Pathol J. 2015;(31):278-289., 2626. Awad NE, Kassem HA, Hamed MA, El-Feky AM, Elnaggar MAA, Mahmoud K, et al. Isolation and characterization of the bioactive metabolites from the soil derived fungus Trichoderma viride. Mycology. 2018; 9:1, 70-80. https://doi.org/10.1080/21501203.2017.1423126 ).

El tiempo en el que se alcanza la máxima actividad enzimática depende del medio empleado y del aislamiento estudiado. Las enzimas líticas producidas por Trichoderma spp. son las responsables de la inhibición in vitro, y pueden contribuir al control de fitopatógenos cuando se aplican estos inoculantes microbianos en invernadero y campo (1515. Miller GL. Use of DinitrosaIicyIic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem. 1959; 31(3):426-428.).