Según Saucedo-García et al. (1212. Saucedo-García A, Anaya AL, Espinosa-García FJ, González MC. Diversity and communities of foliar endophytic fungi from different agroecosystems of Coffea arabica L. in two regions of Veracruz, Mexico. PLoS ONE. 2014; 9 (6): e98454. doi:10.1371/journal.pone.0098454. ), el conocimiento de la diversidad de los HE se relaciona con las técnicas microbiológicas utilizadas para su detección. Estos autores plantearon que los procedimientos basados en técnicas de cultivo tradicionales (desinfección del tejido vegetal y siembra en placas Petri, contentivas en medios de cultivo), no incluyen, por ejemplo, a los biótrofos obligados y a especies que solo forman micelios estériles, lo cual imposibilita su identificación taxonómica. La aplicación de técnicas moleculares hace más factible una identificación más real de la diversidad existente, así como de aspectos relacionados con su ubicación en los tejidos del hospedante y su fluctuación. Esta aproximación ha brindado nuevos elementos en diferentes estudios.

Dreyfuss y Chapela, citados por Kumar y Hyde (1313. Kumar DSS, Hyde KD. Biodiversity and tissue-recurrence of endophytic fungi in Tripterygium wilfordii. Fungal Diversity. 2004; 17: 69-90.), estimaron que los HE de las 270 000 especies de plantas que existen en este planeta, podrían representar 1,38×10⁶ especies fúngicas únicas. La enormidad de esta estimación se debe al hecho de que, de todas las especies de plantas examinadas hasta la fecha, se han detectado endófitos y, por otro lado, que la composición y la frecuencia de especies endófitas dependían del tipo de tejido, lo que sugiere que puedan encontrarse más de una especie endófita en un órgano vegetal (1313. Kumar DSS, Hyde KD. Biodiversity and tissue-recurrence of endophytic fungi in Tripterygium wilfordii. Fungal Diversity. 2004; 17: 69-90.).

Estudios llevados a cabo por Macaya-Sanz et al. en 2017 (1414. Macaya-Sanz D, Eugenio M.E, Martín-Sampedro R, Fillat U, Ibarra D, Del Barrio A, et al. Diversidad de hongos endófitos en especies forestales y su posible papel en la defensa de su hospedante y la degradación de la madera. 7mo Congreso Forestal Español. Gestión del Monte: Servicios ambientales y bioeconomía. 26-30 de Junio del 2017, Plasencia Cáceres, Extremadura. Ed. Soc. española de Ciencias Forestales. ISBN 978-84-941695-2-6.), mediante técnicas metagenómicas, apuntaron a que los hongos endófitos desempeñan diferentes funciones en las especies forestales. Sus resultados evidenciaron que la composición de la flora endófita varió considerablemente entre distintos hospedantes de la misma especie (Ulmus minor Mill.). Esta variación tuvo cierta relación con la tolerancia del árbol a la enfermedad de la grafiosis. A su vez, plantearon que la composición endofítica en eucalipto varió con el tiempo durante el proceso de degradación de la madera. Esta variación parece guardar una estrecha relación con la capacidad de las diferentes cepas para degradar los componentes de la madera, y para soportar los metabolitos potencialmente fungitóxicos presentes en ella. Este comportamiento evidencia que los HE no solo tienen funciones ecológicas relevantes cuando habitan en la planta viva, sino que una vez que esta o alguno de sus órganos muere, diferentes taxones de endófitos actúan de manera secuencial, y posiblemente complementaria, en la descomposición de los principales componentes de la madera. También observaron que los genotipos de olmos más susceptibles presentaron una menor riqueza de endófitos que los genotipos de tolerancia intermedia o alta.

Saucedo-García et al. (1212. Saucedo-García A, Anaya AL, Espinosa-García FJ, González MC. Diversity and communities of foliar endophytic fungi from different agroecosystems of Coffea arabica L. in two regions of Veracruz, Mexico. PLoS ONE. 2014; 9 (6): e98454. doi:10.1371/journal.pone.0098454. ) estudiaron la presencia y diversidad de HE en diferentes sistemas agroforestales del cafeto. Aunque no se encontró un patrón consistente de similitud comunitaria entre los diferentes sistemas agroforestales del cultivo, observaron que las plantaciones rústicas compartieron el mayor número de morfoespecies. Finalmente, sugirieron que la abundancia, riqueza, diversidad y comunidades de endófitos pudieron estar influenciadas, predominantemente, por la región cafetalera y, en menor medida, por el sistema agroforestal.

Por su parte, Wilberforcea et al. (1515. Wilberforce EM, Boddy L, Griffiths R, Griffith GW. Agricultural management affects communities of culturable root-endophytic fungi in temperate grasslands. Soil Biology & Biochemistry. 2003; 35: 1143-1154.), en sus investigaciones, eligieron tres sitios de pastizales de características físicas similares, pero con historiales de manejo diferentes. Estos autores concluyeron que las comunidades diferían en campos de manejo contrastante. La presencia y la ausencia de especies pareció afectarse estacionalmente; las diferencias en los sitios se manifestaron en abundancia relativa. Las comunidades presentes en los sitios fueron separables, en función de la identidad y abundancia de taxones existentes en los sistemas de raíces de los pastizales, especialmente al final del verano y principios del otoño. Si bien la causa pudo ser más difícil de probar, se demostró de manera concluyente que el contenido de Nitrógeno del suelo puede ser un mecanismo por el cual el manejo afecta a los hongos colonizadores de raíces.

Finalmente, los endófitos aislados del mismo hospedante pueden variar, dependiendo de la región en que este se encuentre (temperatura, elevación, precipitación, humedad relativa, entre otros), el tipo de vegetación, el tipo del tejido vegetal de donde se tome la muestra (hojas, raquis, venas, tallos, raíces) y su edad (Arnold et al citados por Gómez (1616. Gómez Krupko M. Aislamiento y evaluación antifúngica de hongos endófitos de Acalypha gaumeri Pax y K. Hoffm. [Tesis en opción al título de·Maestro en Ciencias Biológicas (Ciencias Biológicas: Opción Biotecnología) ]. Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. 2014. Págs. 99.).

Por lo tanto, es de suponer que, ante tanta diversidad, se imponga una clasificación no menos compleja. De forma más simplificada y resumida, se reconocen dos grupos principales de HE: los endofíticos clavicipitaceos (comúnmente conocidos también como C - endófitos) y los no clavicipitaceos (NC - endófitos). Tomando como base los artículos de Rodríguez et al. (1717. Rodríguez RJ, White Jr JF, Arnold AE, Redman RS. Fungal endophytes: diversity and functional roles. New Phytologist2009; 182: 314-330. doi: 10.1111/j.1469-8137.2009.02773.), Ruby Erach et al. (1818. Jalgaonwala RE, Vishwas MB, Totaram MR. A review: Natural products from plant associated endophytic fungi. J Microbiol. Biotech. Res. 2011; 1 (2): 21-32.) y Sánchez Fernández et al. (1919. Sánchez-Fernández RE, Sánchez-Ortiz BL, Monserrat Sandoval-Espinosa YK, Ulloa-Benítez Á, Armendáriz-Guillén B, García-Méndez MC, et al. Hongos endófitos: fuente potencial de metabolitos secundarios bioactivos con utilidad en agricultura y medicina. Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 2013; 16 (2):132-146. ), las características más importantes de cada clase pudieran enunciarse como sigue a continuación:

Estos aspectos pueden ser analizados en algunos artículos de revisión que a los autores de este trabajo les gustaría recomendar, debido a la profundidad con que abordan el tema. Entre ellos se encuentran los artículos presentados por: Rodríguez et al. (1717. Rodríguez RJ, White Jr JF, Arnold AE, Redman RS. Fungal endophytes: diversity and functional roles. New Phytologist2009; 182: 314-330. doi: 10.1111/j.1469-8137.2009.02773.) y Sánchez Fernández et al. (1919. Sánchez-Fernández RE, Sánchez-Ortiz BL, Monserrat Sandoval-Espinosa YK, Ulloa-Benítez Á, Armendáriz-Guillén B, García-Méndez MC, et al. Hongos endófitos: fuente potencial de metabolitos secundarios bioactivos con utilidad en agricultura y medicina. Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 2013; 16 (2):132-146. ). En el primero de los artículos mencionados, se resumen en una tabla las principales características de las diferentes clases de HE, sobre la base de criterios simbióticos como son la gama de hospedantes, el tejido colonizado, las colonización y biodiversidad en la planta, la transmisión y los beneficios. También se exponen en cada una de las clases aspectos de gran interés como los orígenes evolutivos, el impacto en el hospedante, el efecto en la resistencia/susceptibilidad de las plantas, los costos de la simbiosis y la función en la ecofisiología vegetal. En el segundo, además de tratar aspectos de la clasificación, se enfatiza en el uso potencial de metabolitos secundarios en la agricultura y la medicina.

Los endófitos fúngicos pueden presentar diferencias en los patrones de colonización y forma de transmisión a sus hospedantes. Generalmente, las especies que colonizan pastos son endófitos sistémicos, y suelen encontrarse también en las semillas, por lo que son transmitidos de modo vertical. Es común que los endófitos no sistémicos, de crecimiento inter e intracelular, sean transmitidos de una planta a otra, de modo horizontal (1616. Gómez Krupko M. Aislamiento y evaluación antifúngica de hongos endófitos de Acalypha gaumeri Pax y K. Hoffm. [Tesis en opción al título de·Maestro en Ciencias Biológicas (Ciencias Biológicas: Opción Biotecnología) ]. Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. 2014. Págs. 99.), a través de la dispersión de las esporas por polinizadores, fitófagos, viento, agua.

Las comunidades de HE pueden ser divididas, a su vez, en dos grupos principales: específicas (presentes en baja abundancia en un hospedero determinado) y de amplio espectro (encontrados en alta abundancia en diferentes especies vegetales). Los estudios mostraron que las plantas tropicales albergan gran diversidad de hongos de distribución específica (1616. Gómez Krupko M. Aislamiento y evaluación antifúngica de hongos endófitos de Acalypha gaumeri Pax y K. Hoffm. [Tesis en opción al título de·Maestro en Ciencias Biológicas (Ciencias Biológicas: Opción Biotecnología) ]. Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. 2014. Págs. 99.).

La especificidad de los endófitos puede alcanzar hasta el nivel de un tejido particular del hospedante. Por ejemplo, especies de Neotyphodium coenophialum (Morgan-Jones & W. Gams) Glenn, C.W. Bacon & Hanlin tienen como único hospedero a Festuca arundinacea (Schreb.) Čelak., mientras que, su estado sexual Epichloë festucae Leuchtm., Schardl y MR Siegel, tiende a colonizar Lolium perenne L. y a contadas especies del género Festuca (2020. Saikkonen K, Faeth SH, Helander M, Sullivan TJ. Fungal endophytes: A continuum of interactions with host plants. Annual Review of Ecology and Systematics. 1998; 29: 319-343.,2121. Sánchez MMS. Estudio de la micobiota endofítica asociada a las gramíneas Dactylis glomerata, Holcus lanatus, Ammophila arenaría y Elymus farctus. [Tesis en opción al Grado Científico de Doctor en Ciencias]. Universidad de Salamanca. España. 2009; 272 pág.).

En estudios se detectó un alto grado de especificidad por órganos o partes particulares de las plantas como raíz, hoja, corteza (2222. Gamboa-Gaitán MA. Hongos endófitos tropicales: Conocimiento actual y perspectivas. Acta Biológica Colombiana. 2006; 11: 3-20.). Sin embargo, en orquídeas epífitas y plantas leñosas no se encontraron evidencias de especificidad (2323. Lodge DJ. Diversidad mundial y regional de hongos. En: M. Hernández, A García, F. Álvarez y M. Ulloa (Eds.). Enfoques contemporáneos para el estudio de la biodiversidad. Ediciones Científicas Universitarias UNAM, México. 2001; 291-304 pág.). Según Suryanarayanan et al. (2424. Suryanarayanan TS, Thirunavukkarasu N, Govindarajulu MB, Sasse F, Jansen R, Murali TS. Fungal endophytes and bioprospecting. Fungal Biology Reviews. 2009; 23 (1-2): 9-19.), esta variación indica que los endófitos con una amplia gama de hospederos desarrollaron, a través del tiempo, diversos tipos de adaptaciones para contrarrestar los mecanismos de defensa de sus hospederos.

Los principales factores que pueden regular la colonización microbiana incluyen el genotipo de la planta, la etapa de crecimiento, el estado fisiológico, el tipo de tejidos vegetales, la competencia microbiana, algunas condiciones ambientales del suelo, así como algunas prácticas agrícolas (2525. Anteneh Ademe Mengistu. Endophytes: colonization, behaviour, and their role in defense mechanism. Hindawi International Journal of Microbiology. 2020; 1-8. Article ID 6927219, https://doi.org/10.1155/2020/6927219.).

Otro aspecto interesante es la combinación de factores como la dosis y el método de aplicación o inoculación. Tales factores son muy importantes al seleccionar la cepa fúngica, ya que determinarán no solo el porcentaje de colonización en la planta, sino también la capacidad de persistir en el ambiente durante un periodo de tiempo deseable, sin que produzca un efecto perjudicial para la salud o el medio ambiente (2626. Bamisope SB, Akutse KS, Dash CK, Qasim M, Aguila LCR, Ashraf HJ, et al. Effects of seedling age on colonization patterns of Citrus limon plants by endophytic Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae and their influence on seedlings growth. J. Fungi. 2020; 6 (29): 2-15. doi:10.3390/jof6010029. ).

Algunos estudios mostraron que el grado de colonización de los diferentes tejidos y órganos de la planta y su persistencia en el tiempo varían según el cultivo y la cepa de HE, pudiendo existir únicamente una colonización transitoria o llegar a transmitirse verticalmente y encontrarse en la semilla (2727. González Mas N. Respuesta de Aphis gossypii Glover (Homoptera: Aphididae) y sus enemigos naturales entomófagos a la colonización de plantas de melón por hongos entomopatógenos endófitos. [Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias]. Universidad de Córdoba, Argentina. 2019. 187 págs.).

Wheatley et al. (2828. Wheatley WM, Kemp HW, Simpson WR, Hume DE, Nicol HI, Kemp DR, et al. Viability of endemic endophyte (Neotyphodium lolii) and perennial ryegrass (Lolium perenne) seed at retail and wholesale outlets in south-eastern Australia. Seed Science and Technology. 2007; 35: 360-370. https://doi.org/10.15258/sst.2007.35.2.11.) plantearon que, debido a que la colonización de los ovarios por el endófito se produce durante la diferenciación floral, un estrés en este estadio podría afectar tanto la fecundidad de las plantas como la proporción de semillas simbióticas. También podría modificar la longevidad y su efecto en las semillas. Recientemente, se ha sugerido que el nivel de las especies reactivas de oxígeno tiene una función importante en la regulación de la interacción simbiótica pastos-endófito (2929. Eaton CJ, Cox MP, Scott B. What triggers grass endophytes to switch from mutualism to pathogenism? Plant Science. 2011; 180: 190-195.). Se plantea que una mayor carga de antioxidantes en las plantas simbióticas podría ser el mecanismo responsable de esta regulación y de la mayor tolerancia al estrés abiótico (3030. Hamilton CE, Bauerle TL. A new currency for mutualism? Fungal endophytes alter antioxidant activity in hosts responding to drought. Fungal Diversity. 2012; 54: 39-49.).

El aumento de la concentración de ozono en la tropósfera afecta la persistencia de la simbiosis pasto-endófito, con los efectos más críticos en la etapa reproductiva de la planta. Se observó que la simbiosis con endófitos afectó negativamente la longevidad de las semillas, y la mayor tasa de pérdida de viabilidad del endófito con relación a las semillas (3131. Ueno AC. Cambios mediados por el ozono sobre la simbiosis entre pastos y hongos endófitos de transmisión vertical. [Tesis presentada en opción del Grado Científico de Doctor en Ciencias ]. Universidad de Buenos Aires, Área Ciencias Agropecuarias. Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires. 2012;195 págs.).

En otra investigación se examinó la influencia de la edad de las plántulas en el éxito de la colonización endofítica de tres cepas de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuill (BB Fafu-12, BB Fafu-13 y BB Fafu-16) y una cepa de Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin (MA Fafu-1) en plantas de Citrus limon (L.) Osbeck. El porcentaje más alto de recuperación de hongos endofíticos se registró en las plántulas de tres meses de edad, respecto a las de cuatro y seis meses, donde los micelios fúngicos inoculados se reaislaron con éxito en el 65,6 % de los tejidos de hojas y tallos recién desarrollados sin tratar (2626. Bamisope SB, Akutse KS, Dash CK, Qasim M, Aguila LCR, Ashraf HJ, et al. Effects of seedling age on colonization patterns of Citrus limon plants by endophytic Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae and their influence on seedlings growth. J. Fungi. 2020; 6 (29): 2-15. doi:10.3390/jof6010029. ).

Se han utilizado varios métodos y protocolos experimentales para inocular artificialmente HE en plantas de cultivo. Estos métodos pueden ser: rociar hojas con suspensión de conidios, remojar semillas en suspensión de conidios, inyectar inóculo de hongos (conidios y/micelio) en los tallos, (d) sumergir las raíces de las plántulas en suspensión de conidios, y (e) empapar el suelo con suspensión de conidios. En una revisión del tema realizada por Spiridon y Eliopolus en el año 2020 (3232. Spiridon M, Eliopoulos PA. Endophytic entomopathogenic fungi: A valuable biological control tool against plant pests. Appl. Sci. 2020; 10 (360): 1-13. doi:10.3390/app10010360. ), se analizaron las ventajas y desventajas de cada uno de estos métodos y se presentaron los resultados más exitosos.

En el análisis de la diversidad de endófitos, las técnicas tradicionales, como los métodos dependientes del cultivo, se utilizaron de forma rutinaria en los estudios iniciales. No obstante, actualmente se conoce que estas metodologías limitaron nuevos descubrimientos debido a que algunos hongos no son cultivables. Las técnicas moleculares, como los métodos de secuenciación y huellas de ADN, se utilizan con éxito en la detección e identificación de HE. Sin embargo, las técnicas tradicionales siguen aplicándose, no solo como una primera aproximación, sino para la aplicación práctica de estos.

Dentro de las técnicas básicas o tradicionales se reconocen, de forma general, la observación directa y los métodos dependientes del cultivo. La primera se basa en la observación bajo microscopio óptico o electrónico de preparaciones de los tejidos de las muestras supuestamente colonizadas por HE. Según Ramesh Maheshwari (3333. Ramesh Maheshwari. What is an endophytic fungus? Current Science. 2006; 90 (10): 1309.), el requisito mínimo antes de que un hongo se denomine "endófito" debería ser la demostración de sus hifas en el tejido vivo. Este autor cita los trabajos de Sathe y Raghukumar, quienes utilizaron una técnica de blanqueamiento y tinción para demostrar hifas intracelulares en pastos marinos y esta técnica puede ser de aplicación general. En este caso solo se observan estructuras hifales, por lo que no es posible su uso con fines taxonómicos, para lo cual se requiere la observación de esporas (88. Xiang Sun, Liang-Dong Guo. Endophytic fungal diversity: review of traditional and molecular techniques. Mycology: An International Journal on Fungal Biology. 2012; 3 (1): 65-76). Los endófitos facultativos ofrecerían el mayor problema. Pueden ser oportunistas y se vuelven biotróficos bajo ciertas condiciones ambientales. Ambos tipos son desafiantes debido a sus interacciones con la planta, las modificaciones del crecimiento de la planta, sus capacidades biosintéticas e implicaciones evolutivas (3333. Ramesh Maheshwari. What is an endophytic fungus? Current Science. 2006; 90 (10): 1309.).

Por estas razones, se utilizan más los métodos dependientes de la siembra en medios de cultivo sintéticos, especialmente para estudios de diversidad y con pretensiones de aislamiento para la realización de otros estudios de caracterización cultural, morfofisiológica, molecular, patogénica (si se trata de ACB), dinámica de poblaciones, o como inóculos para su aplicación directa o para la detección de nuevos metabolitos secundarios biológicamente activos, útiles en la salud humana, animal o vegetal.

De forma general, en los métodos que implican la siembra en medios de cultivo, los tejidos de las plantas se someten a un paso de desinfección de las superficies. Este paso consta de varias fases (66. Mishra Y, Singh A, Batra A, Sharma MM. Understanding the biodiversity and biological applications of endophytic fungi: A Review. J Microb Biochem Technol. 2014, S8:004. doi:10.4172/1948-5948.S8-004.,88. Xiang Sun, Liang-Dong Guo. Endophytic fungal diversity: review of traditional and molecular techniques. Mycology: An International Journal on Fungal Biology. 2012; 3 (1): 65-76,3333. Ramesh Maheshwari. What is an endophytic fungus? Current Science. 2006; 90 (10): 1309.,3434. Syed Baker, Satish S. Endophytes: Natural Warehouse of Bioactive Compounds. Drug Invention Today. 2012; 4 (11): 548-553.,3535. Tayung K, Jha DK. Endophytic fungi as potential sources of bioactive natural products: prospects and challenges. Rev. Plant Pathol. 2014; 6: 299-334. r) que incluyen:

En la práctica, se puede suponer que los aislamientos son endófitos cuando se confirma la esterilización total de la superficie, es decir, no hay crecimiento de hongos al imprimir los tejidos vegetales esterilizados, o alícuotas de cultivo del agua del último enjuague, en la superficie de los medios nutritivos (88. Xiang Sun, Liang-Dong Guo. Endophytic fungal diversity: review of traditional and molecular techniques. Mycology: An International Journal on Fungal Biology. 2012; 3 (1): 65-76,3333. Ramesh Maheshwari. What is an endophytic fungus? Current Science. 2006; 90 (10): 1309.).

Una vez obtenidos los cultivos puros se debe proceder a la conservación, la cual puede efectuarse a través de la criopreservación, congelación, liofilización y ultracongelación; asimismo, mediante la inoculación de suspensión de esporas de los aislados en viales con arena, esferas de alginato, silicagel o suelo desecado, o cultivos en cuñas de agar (tubos de ensayo y/o eppendorf), en aceite de parafina, tejidos del hospedante secos, glicerol (25 %) y agua destilada estéril (3636. Shashank AT, Rakesh Kumar KL, Ramakrishna D, Kiran S, Kosturkova G, Gokare RA. Current Understanding of Endophytes: Their Relevance, Importance, and Industrial Potentials. IOSR Journal of Biotechnology and Biochemistry (IOSR-JBB). 2017; 3: 43-59. ISSN: 2455-264X).

Es importante tener en cuenta que la variación en el ambiente de crecimiento puede tener impactos significativos en la cantidad y diversidad de metabolitos secundarios de hongos. En el entorno industrial, la optimización de las condiciones de cultivo puede conducir a un aumento significativo de la producción de un compuesto de interés. Dicha optimización se convierte en un desafío en una situación de detección de descubrimiento de fármacos, ya que las condiciones ideales para un organismo pueden inducir una diversidad metabólica deficiente para un organismo diferente (3737. VanderMolen KM, Raja HA, El-Elimat T, Oberlies NH. Evaluation of culture media for the production of secondary metabolites in a natural products screening program. AMB Express. 2013; 3: 71.Disponible en: http://www.amb-express.com/content/3/1/71. Consultado: 1/8/2021).

Tradicionalmente, la taxonomía de los hongos se basa en el análisis de los caracteres morfológicos de las estructuras de reproducción. Sin embargo, para una alta proporción de HE resulta difícil su identificación mediante tales criterios, debido a que muchos de los aislados en el laboratorio permanecen en forma micelial, sin esporular en los medios de cultivos utilizados rutinariamente.

La morfología de las estructuras de reproducción (esporas y/o conidios, conidióforos, células conidiógenas, cuerpos fructíferos, etc.) y la apariencia de las colonias en el medio de cultivo son caracteres que ayudan a definir los taxones fúngicos de los HE. Teniendo en cuenta estos aspectos es comprensible que el trabajo taxonómico morfológico requiere de amplia y sólida experiencia.

En las últimas décadas, con la estandarización, desarrollo y aplicación de diferentes técnicas moleculares, esta tarea se ha simplificado, especialmente cuando los HE aislados no presenten estructuras de reproducción. Para estudios filogenéticos, diversos marcadores se aplican como son los genes 18S, 28S, C01 (Citocromo C Oxidasa subunidad 1 del ADN mitocondrial), tub2 (β-tubulina 2) y las regiones ITS (Espaciador interno de transcrito) y Tef1 (Factor de elongación), entre otros (2121. Sánchez MMS. Estudio de la micobiota endofítica asociada a las gramíneas Dactylis glomerata, Holcus lanatus, Ammophila arenaría y Elymus farctus. [Tesis en opción al Grado Científico de Doctor en Ciencias]. Universidad de Salamanca. España. 2009; 272 pág.,3838. Infante D, Martínez B, González N, Reyes Y. Mecanismos de acción de Trichoderma frente a hongos fitopatógenos. Rev Protección Veg. 2009; 24 (1): 14-21.).

La secuenciación del genoma, genómica comparativa, microarrays, secuenciación de próxima generación, metagenómica, metatranscriptómica y un método computacional adecuado, son algunas de las técnicas que se pueden utilizar para desentrañar la relación planta-endófito, y para mejorar la gestión agrícola de estos en términos de promoción del crecimiento vegetal, biocontrol y biorremediación (3939. Kaul S, Sharma T, Dhar MK. “Omics” tools for better understanding the plant-endophyte interactions. Front. Plant Sci. 2016; 7: 955. doi: 10.3389/fpls.2016.00955.,4040. Ayomide Emmanuel Fadiji, Oluranti OB. Metagenomics methods for the study of plant-associated microbial communities: A review. Journal of Microbiological Methods. 2020; 170: 105860.).

La señalización de un endófito con la planta y con otros endófitos coexistentes se puede rastrear y cuantificar para una caracterización integral de su asociación mutualista. Estas técnicas proporcionan una comprensión integral de las interacciones moleculares endofíticas y transducción de señales, expresión de genes entre especies y activación/desactivación de las cascadas de genes requeridas que conducen a la producción sostenida de un compuesto de interés (4141. Souvik Kusari, Hertweck C, Spiteller M. Chemical Ecology of Endophytic Fungi: Origins of Secondary Metabolites. Chemistry & Biology. 2012; 19 (7): 792-798., 4242. Hardoim PR, van Overbeek LS, Berg G, Pirttilä AM, Compant S, Campisano A, et al. The hidden world within plants: ecological and evolutionary considerations for defining functioning of microbial endophytes. Microbiol Mol Biol Rev. 2015. doi:10.1128/MMBR.00050-14.).

No obstante, uno de los principales problemas para lograr este objetivo es el desafío técnico de cómo separar el ADN del HE del de la planta. Este último es la mayoría de las veces dominante respecto al del endofítico, lo que dificulta el aislamiento y la secuenciación del metagenoma endófito en una cobertura alta. Ayomide y Oluranti, (2020) (4040. Ayomide Emmanuel Fadiji, Oluranti OB. Metagenomics methods for the study of plant-associated microbial communities: A review. Journal of Microbiological Methods. 2020; 170: 105860.), plantearon que para la extracción de ADN comúnmente se usan kits comerciales que tienen aproximadamente 95 % de aceptación entre todos los demás métodos relacionados. El método basado en bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB) también se utiliza para la extracción de ADN. En términos de producción y aceptabilidad de kits comerciales, MoBio Laboratories, Qiagen, EE. UU. y Macherey Nagel, Alemania, son empresas líderes según la evaluación realizada por estos autores.

En un estudio de la simbiosis entre los pastos de estación fría y hongos de la familia Clavicipitaceae (L. perenne y el hongo biotrófico E. festucae), a partir del análisis del transcriptoma de la planta, se revelaron cambios dramáticos en la expresión de los genes del hospedante involucrados en la defensa de patógenos, la activación de transposones y la biosíntesis y respuesta de hormonas. Además, se destacó lo finamente sintonizadas que están las asociaciones pasto-endófito y cómo la interferencia con las vías de señalización involucradas en el mantenimiento de estas asociaciones puede desencadenar un cambio de interacción mutualista a patógena (2929. Eaton CJ, Cox MP, Scott B. What triggers grass endophytes to switch from mutualism to pathogenism? Plant Science. 2011; 180: 190-195.).

Muhammad Waqas et al. (4343. Muhammad Waqas, Khan AL, Kamran M, Hamayun M, Kang S-M, Kim Y-H, et al. Endophytic fungi produce gibberellins and indoleacetic acid and promotes host-plant growth during stress. Molecules. 2012; 17: 10754-10773. doi:10.3390/molecules170910754.) encontraron que la aplicación y asociación endofítica de Penicillium sp. y Phoma glomerata (Corda) Wollenw y Hochapfel con plantas de pepino aumentaron significativamente la biomasa de la planta y los indicadores de crecimiento relacionados en condiciones de estrés salino y por sequía, inducidos por cloruro de sodio y polietilenglicol, respectivamente, en comparación con las plantas de control. La simbiosis endofítica (Penicillium sp. y P. glomerata) resultó en una asimilación significativamente mayor de nutrientes esenciales como potasio, calcio y magnesio, y redujo la toxicidad del sodio en comparación con las plantas de control durante el estrés por salinidad. En este caso, debido a los análisis bioquímicos y moleculares, se pudo determinar que dicho estrés se mitigó por las actividades de catalasa, peroxidasa y polifenol oxidasa, las cuales se redujeron significativamente en plantas endófitas, en comparación con las plantas control. Estas enzimas ayudan a las plantas a eliminar el H₂O₂ de las mitocondrias y a regular las respuestas al estrés. En condiciones de estrés, la infección con estos endófitos moduló significativamente el estrés a través de ácido abscísico regulado para una síntesis reducida, ácido jasmónico alterado y contenidos elevados de ácido salicílico en comparación con el control. Finalmente, se concluyó que los dos endófitos reprogramaron significativamente el crecimiento de las plantas hospedantes durante condiciones de estrés.

Si el objetivo de la selección es la obtención de cepas promisorias de HE como ACB, como un primer paso se ejecutan ensayos in vitro, los cuales ofrecen conocimiento importante sobre la actividad y el espectro de acción de estos hongos. Para evaluar la capacidad de producir el efecto antifúngico de los HE, con frecuencia se desarrolla el ensayo de cultivo dual, que posibilita seleccionar hongos con propiedades antagonistas hacia otros hongos fitopatógenos. A través de este ensayo se determinan los mecanismos de acción del HE antagonista (antibiosis, competencia por espacio o nutrientes y el micoparasitismo,). Una vez seleccionadas las cepas promisorias, es necesario pasar al nivel experimental en condiciones de invernadero, antes de diseñar los experimentos de campo, cuyos resultados definen finalmente la aceptación práctica del ACB.

Otros aspectos a tener en cuenta al seleccionar una cepa de HE como ACB son los siguientes:

Para seleccionar cepas promisorias, como fuentes de productos naturales útiles y novedosos para el hombre, se han seguido diversas estrategias. Entre estas se pueden mencionar: a) aislamiento de microorganismos (endófitos, epífitos, saprófitos) que se encuentren relacionados con plantas utilizadas en la medicina tradicional o que presenten informes previos de actividad biológica; b) búsqueda de organismos microbianos en ambientes extremos o de gran biodiversidad; c) modificación de los parámetros de cultivo in vitro: composición del medio de cultivo, pH, aireación, fotoperiodo, temperatura; d) uso de elicitores o agentes modificadores epigenéticos para modular la expresión génica (4444. Chiang YM, Lee KH, Sanchez JF, Keller NP, Wang CC. Unlocking fungal cryptic natural products. Natural Product Communications. 2009; 4 (11): 1505-1510.); e) el co-cultivo de microorganismos en un mismo ambiente, entre otras. Los co-cultivos o cultivos duales pueden realizarse tanto en medios líquidos como en sólidos, aunque los primeros son más utilizados. No obstante, Bertrand et al. (4545. Bertrand S, Schumpp O, Bohni N, Monod M, Gindro K, Wolfender JL. De novo production of metabolites by fungal co-culture of Trichophyton rubrum and Bionectria ochroleuca. Journal of Natural Products. 2013; 76 (6): 1157-65.) informaron el estudio de las zonas de confrontación en co-cultivos fúngicos en medio sólido, como un método exitoso para la inducción de nuevos compuestos. Las interacciones en estos cultivos duales pueden conducir a la activación de mecanismos regulatorios complejos, que resultan en la generación de productos naturales nuevos y de gran diversidad estructural.

Si el aspecto de interés para la selección es la colonización de la planta hospedante, se debe analizar este comportamiento en condiciones semicontroladas y de campo. Para ello es importante el cálculo del porcentaje de frecuencia de colonización y el porcentaje de hongos dominantes endófitos. Los aislados de hongos endofíticos de cada segmento de tejido de la planta hospedante se analizan en función del porcentaje de densidad de colonización. Se analiza, además, el porcentaje relativo de ocurrencia de diferentes grupos de hongos y el porcentaje de tasa de infección endofítica (66. Mishra Y, Singh A, Batra A, Sharma MM. Understanding the biodiversity and biological applications of endophytic fungi: A Review. J Microb Biochem Technol. 2014, S8:004. doi:10.4172/1948-5948.S8-004.).

En la actualidad, el incremento de los estudios relacionados con los HE se debe a sus funciones en la interacción con las plantas. La naturaleza compleja de esta interacción les confiere a las plantas, entre otras, la capacidad de defenderse ante factores bióticos y abióticos adversos. Por esta razón, uno de los temas de investigación más analizados se relaciona con los estudios encaminados a su selección como agentes de control biológico (ACB) para el manejo de plagas. Los HE producen un amplio arsenal de metabolitos secundarios que mejoran la resistencia frente a patógenos y herbívoros, la absorción de nutrientes, promueven el crecimiento vegetal y la resistencia frente a estreses, tales como la salinidad, altas temperaturas, mayor tolerancia a la sequía, al estrés oxidativo, a suelos ácidos con altos contenidos de Zn y Al.

Se conoce que las dosis decrecientes y la aplicación del entomófago antes que el HE reducen los efectos negativos sobre varios grupos de entomófagos, como coccinélidos depredadores (8181. Pell JK, Vandenberg JD. Interactions among the aphid Diuraphis noxia, the entomopathogenic fungus Paecilomyces fumosoroseus and the coccinellid Hippodamia convergens. Biocontrol Sci Techn. 2002; 12: 217-224.,8282. Roy HE, Brown P, Rothery P, Ware RL, Majerus MEN. Interactions between the fungal pathogen Beauveria bassiana and three species of coccinellid: Harmonia axyridis, Coccinella septempunctata and Adalia bipunctata. Biocontrol. 2008; 53:265-276.), crisopas (8383. Portilla M, Snodgrass G, Luttrell R. Lethal and sub-lethal effects of Beauveria bassiana (Cordycipitaceae) strain NI8 on Chrysoperla rufilabris (Neuroptera: Chrysopidae). Florida Entomologist. 2017;100 (3):627-633.) y varias especies de parasitoides de pulgones (8484. Oreste M, Bubici G, Poliseno M, Tarasco E. Effect of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae on the Trialeurodes vaporariorum - Encarsia formosa system. J Pest Sci. 2016; 89:153-160. doi:10.1007/s10340-015-0660-4.,8585. Shrestha G, Enkegaard A, Reddy GVP, Skovgard H, Steenberg T. Susceptibility of larvae and pupae of the aphid parasitoid Aphelinus ribisnigri ribisnigri (Hymenoptera: Aphelinidae) to the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana. Annals of the Entomological Society of America. 2017; 110 (1):121-127. doi: 10.1093/aesa/saw066.). Los tratamientos con HE pueden considerarse de bajo riesgo para depredadores y parasitoides y, por tanto, compatibles con los mismos. El depredador C. carnea se alimenta de larvas de S. littoralis infectadas con M. brunneum (8686. Ríos-Moreno A, Quesada-Moraga E, Garrido-Jurado I. Treatments with Metarhizium brunneum BIPESCO5 and EAMa 01/58-Su strains (Ascomycota: Hypocreales) are low risk for the generalist predator Chrysoperla carnea. J Pest Sci 2018; 91:385-394.) y el parasitoide Aphidius ervi Haliday oviposita en pulgones infectados con Pandora neoaphidis (Remaudière & Hennebert) Humber. Sin embargo, existen pocos trabajos en los que se haya estudiado si la colonización endofítica de la planta puede tener un efecto sobre integrantes del tercer nivel trófico, y los pocos que hay tratan de su efecto sobre los parasitoides (2727. González Mas N. Respuesta de Aphis gossypii Glover (Homoptera: Aphididae) y sus enemigos naturales entomófagos a la colonización de plantas de melón por hongos entomopatógenos endófitos. [Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias]. Universidad de Córdoba, Argentina. 2019. 187 págs.).

En un estudio se determinó que las larvas del parasitoide Aphelinus abdominalis Dalman fueron muy susceptibles a la alta concentración de esporas de B. bassiana (1x10⁹ c/ml), medida por las tasas de formación de momias y emergencia adulta, en comparación con el tratamiento de control. Por el contrario, B. bassiana no tuvo efectos sobre el desarrollo del parasitoide cuando las larvas de este se trataron con la menor concentración de esporas (1x10⁴ c/ml) o sus pupas se trataron con concentraciones de esporas altas o bajas. Por esta razón, sugieren que podría ser posible combinar B. bassiana y A. abdominalis para el manejo integrado de plagas de Nasonovia. ribisnigri Mosley (8585. Shrestha G, Enkegaard A, Reddy GVP, Skovgard H, Steenberg T. Susceptibility of larvae and pupae of the aphid parasitoid Aphelinus ribisnigri ribisnigri (Hymenoptera: Aphelinidae) to the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana. Annals of the Entomological Society of America. 2017; 110 (1):121-127. doi: 10.1093/aesa/saw066.).

En los bioensayos referidos anteriormente, de las larvas de crisopa verde (C. carnea) alimentadas con larvas de S. littoralis sanas y tratadas con cepas de M. brunneum, se confirmó la presencia de destruxina A a concentraciones bajas en las larvas de S. littoralis infectadas con cepa BIPESCO5, mientras que el metabolito no se detectó en C. carnea que consumieron larvas de S. littoralis tratadas con M. brunneum. Las larvas de crisopa se alimentaron preferentemente de presas sanas en comparación con las presas tratadas con M. brunneum. Además, las larvas de C. carnea alimentadas con presas sanas ganaron más peso que las alimentadas con individuos tratados. Ambos tratamientos de M. brunneum utilizados contra larvas de S. littoralis pueden considerarse de bajo riesgo para C. carnea, debido a la falta de mortalidad relacionada con hongos en el depredador y al no moverse la destruxina A de la presa al depredador. Sin embargo, se necesitan más estudios sobre otros no objetivos y con más cepas de M. brunneum para evaluar su posible uso simultáneo en el manejo integrado de plagas (8686. Ríos-Moreno A, Quesada-Moraga E, Garrido-Jurado I. Treatments with Metarhizium brunneum BIPESCO5 and EAMa 01/58-Su strains (Ascomycota: Hypocreales) are low risk for the generalist predator Chrysoperla carnea. J Pest Sci 2018; 91:385-394.).

Por su parte, González-Mas et al. (8787. González-Mas N, Cuenca-Medina M, Gutiérrez-Sánchez F, Quesada- Moraga E. Bottom-up effects of endophytic Beauveria bassiana on multitrophic interactions between the cotton aphid, Aphis gossypii, and its natural enemies in melon. Journal of Pest Science. 2019. doi.org/10.1007/s10340-019-01098-5. ) evaluaron la eficacia de depredación / parasitismo de larvas de crisopa, C. carnea, y del parasitoide bracónido, Aphidius colemani Viereck, cuando se les ofrecieron pulgones inoculados con B. bassiana directamente con una suspensión de hongos (solo bioensayo de crisopas) o se habían alimentado de plantas de melón colonizadas endofíticamente por este hongo. La aplicación de B. bassiana no influyó significativamente en el número de presas de pulgón consumidas por las crisopas o en el tiempo que tardaron en consumir cada pulgón. En este caso, las larvas de C. carnea prefirieron alimentarse de pulgones criados en plantas colonizadas por B. bassiana en comparación con las plantas de control. En otro ensayo, el número de pulgones parasitados por A. colemani y su proporción sexual no se afectaron, independientemente de si los pulgones se alimentaron de plantas colonizadas por B. bassiana o no. Finalmente, apoyan la hipótesis de que los hongos entomopatógenos endofíticos pueden usarse en combinación con otros enemigos naturales, como depredadores y parasitoides.

Zum Felde et al. (8888. Zum Felde A, Pocasangre LE, Carñizares Monteros CA, Sikora RA, Rosales FE, Riveros AS. Effect of combined inoculations of endophytic fungi on the biocontrol of Radopholus similis. Info Musa. 2006; 15 (1-2).) indicaron que la combinación de agentes de control biológico compatibles (Fusarium oxysporum Schltdl, T. atroviride) proporcionan una protección mejorada y más estable contra R. similis, en comparación con el uso de un solo agente de control biológico. Se necesitan más investigaciones para explorar los mecanismos por los cuales los hongos endófitos controlan a R. similis en los tejidos de la raíz del banano y su movimiento o transferencia de una generación de plantas a la siguiente. No obstante, se comprobó que cuando se establece la supresión de nematodos en el campo, esta se transfiere de las plantas madre a las hijas. La combinación de inoculaciones de endófitos mutualistas aumentó los niveles de control de nematodos y el crecimiento de las plantas en plantas 'Williams' inoculadas (7575. Zum Felde A. Studies on characteristics of the antogonistic relationship between Radopholus similis (Cobb) Thorne and the mutualistic endophytic fungi in Nematode Supressive Banana Plants (Musa AAA). [Tesis en opción al Grado Científico de Doctro en Ciencias]. Alemania Universidad de Bonn. 2008. 93p.).

Ocho aislamientos endofíticos compatibles, con conocida actividad antagonista contra R. similis aplicados individualmente, o de forma mixta en vitroplantas de banano del cultivar "Gran Enano" en invernadero, mostraron que la inoculación múltiple disminuyó significativamente la penetración del nematodo y redujo la población final de este en el sistema radical de la planta. El efecto aditivo y/o sinérgico de los mecanismos de acción de los agentes biológicos quedó demostrado en su actividad antagonista contra R. similis. Además, los resultados obtenidos en el bioensayo de promoción de crecimiento demostraron que las plantas protegidas con inoculaciones múltiples presentaron valores mayores en las variables peso total de la planta, peso radical y longitud radical en comparación con las inoculaciones individuales y los testigos (7676. Chaves N. Utilización de bacterias y hongos endofíticos para el control biológico del Nematodo Barrenador Radopholus similis (Cobb) Thorn. [Tesis en Opción al Grado Científico de Master en Ciencias]. Turrialba, CR. CATIE. 2007. 85p. ).

En bioensayos de laboratorio, se rociaron adultos de Hippodamia convergens Guerin con suspensiones de conidios de Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown & Smith a diferentes concentraciones y se evaluó la mortalidad; aunque una proporción de coccinélidos sucumbió a la infección (la mayor proporción fue de 22 % cuando las mariquitas habían sufrido estrés). Estos investigadores plantearon que es poco probable que estén en riesgo de infección como resultado directo de una aplicación de aerosol, a menos que haya periodos prolongados de alta humedad o los coccinélidos estaban estresados. Cuando se les proporcionaron cadáveres de Diuraphis noxia Kurdjumov no infectados o infectados con P. fumosoroseus como presa, los coccinélidos consumieron más pulgones no infectados. Los depredadores nunca consumieron cadáveres de pulgones de los que el hongo estaba en erupción o esporulando. Los depredadores contaminados con conidios de P. fumosoroseus pudieron transferir conidios a poblaciones sanas de D. noxia e iniciar la infección en los pulgones. Esta proporción de pulgones infectados fue mayor cuando los coccinélidos se contaminaron al buscar alimento entre cadáveres esporulantes (8181. Pell JK, Vandenberg JD. Interactions among the aphid Diuraphis noxia, the entomopathogenic fungus Paecilomyces fumosoroseus and the coccinellid Hippodamia convergens. Biocontrol Sci Techn. 2002; 12: 217-224.).

Al evaluar la compatibilidad de los hongos B. bassiana y M. anisopliae con Chrysoperla externa Hagen, depredador de ninfas de Trialeurodes vaporariorum (Westwood), en condiciones de laboratorio, no hubo diferencias estadísticas en la mortalidad corregida en los estadios larvales II y III de C. externa, expuestos a B. bassiana, y para su estado larval frente a M. anisopliae, a altas concentraciones (1x10⁸ conidias ml^-1) de estos HE. Estos resultados indican que C. externa podría ser aplicada como entomófago en un esquema de manejo integrado de T. vaporariorum en cultivos de tomate, conjuntamente con hongos como B. bassiana y M. anisopliae (8989. Castro López MA, Martínez Osorio JW. Compatibility of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae with Chrysoperla externa depredator of Trialeurodes vaporariorum. Chilean J. Agric. Anim. Sci., ex Agro-Ciencia. 2019; 35 (1): 38-48.).

Los aislamientos de Metarhizium robertsii (formalmente conocido como M. anisopliae) (ESALQ 1622) y B. bassiana (ESALQ 3375) (en inoculaciones simples y combinadas en tratamientos de semillas), para suprimir el crecimiento de la población de ácaros rojos Tetranychus urticae Koch y la capacidad de promover el crecimiento de plantas de frijol Phaseolus vulgaris L., mostraron un alto potencial. El ácaro depredador Phytoseiulus persimilis Athias-Henriot no mostró diferencias en la tasa de depredación de T. urticae de las plantas tratadas y no tratadas, aunque los depredadores tenían más probabilidades de alimentarse de los ácaros de las plantas tratadas con hongos durante la primera mitad del ensayo y de los ácaros de las plantas de control durante el resto del ensayo. Se concluyó que, en general, los dos aislados de hongos tienen potencial como inoculantes de semillas para suprimir los ácaros en el frijol y la estrategia parece no tener conflicto con el uso de ácaros depredadores (9090. Canassa F, Tall S, Moral RA, de Lara IAR, Delalibera Jr.I, Meyling NV. Effects of bean seed treatment by the entomopathogenic fungi Metarhizium robertsii and Beauveria bassiana on plant growth, spider mite populations and behavior of predatory mites. Biological Control. 2019; 132: 199-208.).

En un experimento in vitro, se comparó la susceptibilidad de tres especies de coccinélidos, Harmonia axyridis Pallas, Coccinella septempunctata L. y Adalia bipunctata L. a la infección por B. bassiana (cepa comercial GHA) después de la exposición a tres dosis (10⁵, 10⁷, 10⁹ conidios ml^-1). Las dos subpoblaciones de H. axyridis (Japón y Reino Unido) fueron más resistentes a la infección por B. bassiana que A. bipunctata o C. septempunctata, sólo la dosis de 10⁹ conidios ml^-1 resultó mortal para H. axyridis, en contraste, C. septempunctata y A. bipunctata expuestos a la concentración de 1,0⁷ conidios ml^-1 del hongo, tuvieron un 80 % y 70 % de mortalidad, respectivamente. La inoculación con dosis altas (10⁹ conidios ml^-1) redujo la fecundidad de A. bipunctata a cero, pero a las concentraciones de 10⁵ y 10⁷ conidios ml^-1 la producción de huevos fue similar a los individuos de control. Por el contrario, todas las dosis de B. basssiana redujeron drásticamente la producción de huevos de H. axyridis (Reino Unido) (8282. Roy HE, Brown P, Rothery P, Ware RL, Majerus MEN. Interactions between the fungal pathogen Beauveria bassiana and three species of coccinellid: Harmonia axyridis, Coccinella septempunctata and Adalia bipunctata. Biocontrol. 2008; 53:265-276.).

Los resultados de la aplicación de B. bassiana a larvas, pupas y adultos del depredador Eriopis connexa Germar (ACB) mostraron que el entomopatógeno infectó al coleóptero. En el análisis de la interacción entre B. bassiana y el depredador a través de presas infectadas se encontró que los efectos del hongo sobre la supervivencia de las larvas fueron significativamente diferentes cuando se examinó la supervivencia acumulada (desde el primer estadio larvario hasta la edad adulta). La fecundidad diaria se redujo significativamente a los cinco días en comparación con el grupo de control. Por el contrario, no se observaron diferencias significativas entre los cinco días de oviposición en la tasa de huevos eclosionados. Este estudio mostró que, a pesar de haber recibido una sola dosis del hongo en su ciclo de vida, los parámetros poblacionales del depredador E. connexa se vieron afectados. Serían necesarios más estudios para ayudar a identificar las interacciones entre los enemigos naturales para aumentar y mejorar las oportunidades y desarrollar aún más los programas de control biológico de plagas (9191. Scorsetti AC, Pelizza S, Fogel MN, Vianna F, Schneider MI. Interactions between the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana and the Neotropical predator Eriopis connexa (Coleoptera: Coccinellidae): Implications in biological control of pest. Journal of Plant Protection Research. 2017; 57 (4): 389-395. doi: 10.1515/jppr-2017-0053.).

Se realizó un bioensayo con la cepa nativa del Delta del Mississippi (NI8 ARSEF8889) de B. bassiana, aislada de Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois), sobre Chrysoperla rufilabris (Burmeister). Los adultos del predador, tratados con el hongo a cuatro concentraciones de pulverización (7,02 × 10⁴, 10⁵, 10⁶, y 10⁷) esporas por mL), mostraron efectos significativos y la gravedad del impacto dependió de la concentración probada. El método de aplicación simuló pulverización atomizada y las concentraciones probadas La cepa de B. bassiana impactó todas las medidas demográficas de la reproducción y sobrevivencia de C. rufilabris. La tasa de aumento intrínseco y finito y las tasas de reproducción bruta y neta de adultos tratados con las concentraciones de prueba más altas disminuyeron significativamente, mientras que el tiempo de duplicación aumentó para adultos tratados con las concentraciones de pruebas más bajas. Sobre la base de estas observaciones, C. rufilabris será afectado por aerosoles de B. bassiana dirigidos a L. lineolaris si los adultos están presentes en el momento y lugar del tratamiento (8383. Portilla M, Snodgrass G, Luttrell R. Lethal and sub-lethal effects of Beauveria bassiana (Cordycipitaceae) strain NI8 on Chrysoperla rufilabris (Neuroptera: Chrysopidae). Florida Entomologist. 2017;100 (3):627-633.).

La virulencia de tres cepas de B. bassiana y una de M. anisopliae, seleccionadas previamente por su virulencia contra Galleria mellonella L. y Tenebrio molitor L., se probó contra Trialeurodes vaporariorum y su parasitoide Encarsia formosa Gahan en ensayos de laboratorio. La cepa comercial de B. bassiana ATCC 74040, tanto como cultivo fúngico puro como micoinsecticida formulado (Naturalis), se incluyó en los ensayos como control positivo. Todas las cepas de los entomopatógenos y el producto comercial fueron eficaces en el control de ninfa de T. vaporariorum. Sin embargo, las cepas de hongos entomopatógenos, y especialmente Naturalis, afectaron negativamente el desarrollo de E. formosa y su actividad parasitaria sobre las ninfas de T. vaporariorum. Este efecto fue más pronunciado cuando las cepas fúngicas se aplicaron antes de la parasitación. Este autor sugiere que la aplicación de hongos entomopatógenos es incompatible con la liberación de E. formosa en los cultivos (8484. Oreste M, Bubici G, Poliseno M, Tarasco E. Effect of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae on the Trialeurodes vaporariorum - Encarsia formosa system. J Pest Sci. 2016; 89:153-160. doi:10.1007/s10340-015-0660-4.).

Las diferentes respuestas obtenidas de la interacción endófitos - entomófagos, aun frente a una misma especie del primero, hace necesario la prueba y selección de cada agente en los distintos sistemas, cada cepa de HE tiene características intrínsecas, así como una maquinaria metabólica que responde en gran medida al nicho y/o condiciones donde ha evolucionado.

Por otro lado, debido a su propio origen y evolución, el desempeño ecológico de estos endófitos es diverso y en muchos casos desconocido. Se sugiere que algunas especies endófitas pueden cambiar a saprófitos o incluso llegar a inducir síntomas de la enfermedad. De hecho, se aislaron algunas especies de hongos en el trópico donde actúan endófitos, mientras que en zonas templadas son saprófitos (2222. Gamboa-Gaitán MA. Hongos endófitos tropicales: Conocimiento actual y perspectivas. Acta Biológica Colombiana. 2006; 11: 3-20.).

La interacción entre los hongos endófitos también podría tener consecuencias negativas para la inmunidad de las plantas y su desempeño potencial. Teniendo en cuenta que, como se planteó anteriormente, la represión de la vía del AS parece ser esencial para establecer y mantener la relación simbiótica (similar a lo que ocurre con los hongos micorrízicos), las plantas colonizadas con HE serán más susceptibles a patógenos biótrofos (ya que esta es la vía utilizada por las plantas para inducir los mecanismos de resistencia a los mismos). Por el contrario, si la vía del AS se activa debido a factores bióticos o abióticos se producirá un efecto negativo sobre el endófito (11. Peteira B. La resistencia inducida como alternativa para el manejo de plagas en las plantas de cultivo. Rev. Protección Veg. 2020; 35 (1): 1-12.).

Según plantea Martin Heil (9292. Martin Heil. The Microbe-Free Plant: Fact or Artifact. Cap. 114. En: Biological Nitrogen Fixation, Volume 2, First Edition. Edited by Frans J. de Bruijn. Published 2015 by John Wiley & Sons, Inc. 2015: 1163-1174. ), muchos endófitos son percibidos como patógenos e inducen respuestas de resistencia del hospedante, un efecto que parece ser el mecanismo general que subyace a sus efectos "indirectos". La falta de síntomas visibles de la enfermedad podría ser el resultado de un delicado equilibrio entre las respuestas de resistencia del hospedero que mantienen la tasa de crecimiento de los microorganismos en una magnitud tolerable y los microorganismos, suprimiendo la resistencia de la planta lo suficiente, como para permitir la colonización. Es la suma neta de todos sus efectos positivos (a menudo condicionales) (promoción del crecimiento, mejora de la resistencia, etc.) y de todos sus efectos negativos (que invariablemente comprenden el uso de nutrientes, pero también pueden incluir la supresión de ciertas señales de defensa). Esta suma decide si la colonización de una planta por un microorganismo puede considerarse un mutualismo, parasitismo o comensalismo bajo un conjunto definido de condiciones ambientales. Los estudios comparativos futuros deberán identificar los factores que deciden en qué parte de la “línea fina” de parásito a mutualista es más probable encontrar una combinación de endófito-hospedante dada.

Hasta la fecha, en tomate como en muchos otros cultivos hortícolas, la introducción artificial de HE se limita a un grupo restringido de microbios beneficiosos que incluyen especies pertenecientes al género Sarocladium, Beauveria, Metarhizium, Fusarium, Penicillium, Serendipita (antes Piriformospora), Pochonia, Pythium y Trichoderma (9393. Sinno M, Ranesi M, Gioia L, d’Errico G, Woo SL. Endophytic fungi of tomato and their potential applications for crop improvement. Agriculture. 2020; 10(587): 1-. 20. doi:10.3390/agriculture10120587. ). También se informó que el hongo mejor estudiado, B. bassiana, coloniza numerosos cultivos, como maíz, trigo, algodón, soja, tomate, vid, sorgo y cítricos; también reduce la infestación por plagas graves, principalmente larvas de polilla y pulgones. La presencia de endófitos resultó en una reducción significativa, tanto de la población de plagas como del daño a las plantas en la mayoría de los casos (3232. Spiridon M, Eliopoulos PA. Endophytic entomopathogenic fungi: A valuable biological control tool against plant pests. Appl. Sci. 2020; 10 (360): 1-13. doi:10.3390/app10010360. ).

La investigación en el tema de los endófitos abre amplias posibilidades para el estudio de la interacción planta-endófito y permite explorar su potencial como un sistema alternativo de expresión de genes que confieran resistencia a plagas y enfermedades, sin recurrir al uso de plantas transgénicas. En los hospederos, los endófitos transgénicos pueden ser usados como vehículo para la producción y entrega de productos generados a partir de genes de interés agronómico, cumpliendo funciones protectoras y proporcionando otras ventajas que se reflejen en una mayor productividad de la planta (9494. Abello JF, Kelemu S. Hongos endófitos: ventajas adaptativas que habitan en el interior de las plantas. Revista Corpoica Ciencia y Tecnología Agropecuaria. 2006; 7 (2):55-57.). Sin embargo, según estos autores, un factor que limita la implementación de esta herramienta, especialmente en los países en vía de desarrollo, es la falta de investigación y entendimiento de estos microorganismos, ya que actualmente se prioriza el uso de los recursos para la investigación en temas que generan soluciones a corto plazo, dejando de lado el potencial con que cuentan estos microorganismos y sus interacciones.

No obstante, los avances obtenidos y el incremento constante de investigaciones sobre los HE, aún quedan por dilucidar numerosos aspectos. Según Spiridon y Eliopolus (3232. Spiridon M, Eliopoulos PA. Endophytic entomopathogenic fungi: A valuable biological control tool against plant pests. Appl. Sci. 2020; 10 (360): 1-13. doi:10.3390/app10010360. ), es preciso que se investiguen: (a) los mecanismos fisiológicos que utilizan los endófitos para colonizar la planta y si estos mecanismos difieren según el punto de entrada en la planta; (b) si algunos aislados de hongos tienen más éxito como endófitos que otros y el grado en que su cepa determina su tasa de supervivencia dentro de la planta; (c) cómo viajan los hongos endofíticos a la planta, ya sea a través de semillas, conidios del suelo, entre otros; (d) las formas en que las plantas y los insectos que se alimentan son afectados por los endófitos; y (e) las formas en que los endófitos se benefician de las plantas. A pesar de los numerosos estudios sobre endófitos, es cierto que solo se han estudiado muy pocas especies. Se cree firmemente que todavía hay miles de endófitos inexplorados debido a la limitada investigación en este campo. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de descubrir y evaluar estas cepas endofíticas desconocidas.

Como se aprecia a través de este artículo de revisión, los hongos endófitos forman con sus hospedantes relaciones bióticas muy complejas e intensas, que en la actualidad no son posibles de comprender totalmente. Los avances de la ciencia sobre la agrupación de esos hongos, de acuerdo a sus efectos sobre las plantas y las combinaciones entre ellos, se consideran insuficientes, debido a la diversidad y complejidad de los mismos. En tal sentido, la introducción de los HE, en combinación con otros agentes de control biológico microbianos o invertebrados, requiere de un conocimiento profundo de las interacciones multitróficas que se desarrollan en determinado agroecosistema, la influencia de factores abióticos, aspectos referentes a su inoculación (tipo, dosis, frecuencia) que, de no tenerse en cuenta, pueden dar al traste con los efectos deseados.