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Artículo Original
 
Efectos de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg y Azofert ® sobre el crecimiento y desarrollo de Phaseolus vulgaris L.
Effects of Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg and Azofert ® on growth and development of Phaseolus vulgaris L.
 

iDIvonne González-Marquetti1Dirección de Sanidad Vegetal. Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA). Apartado 10. San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.

iDDanay Ynfante-Martínez1Dirección de Sanidad Vegetal. Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA). Apartado 10. San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.

iDSusana Gorrita1Dirección de Sanidad Vegetal. Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA). Apartado 10. San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.

iDBelkis Morales-Mena2Fisiología y Bioquímica Vegetal. Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INCA). San José de las Lajas. Provincia Mayabeque, Cuba.

iDMaría Caridad Nápoles2Fisiología y Bioquímica Vegetal. Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INCA). San José de las Lajas. Provincia Mayabeque, Cuba.

iDBelkis Peteira Delgado-Oramas1Dirección de Sanidad Vegetal. Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA). Apartado 10. San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.

iDBenedicto Martínez-Coca1Dirección de Sanidad Vegetal. Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA). Apartado 10. San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.

 

1Dirección de Sanidad Vegetal. Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA). Apartado 10. San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.

2Fisiología y Bioquímica Vegetal. Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INCA). San José de las Lajas. Provincia Mayabeque, Cuba.

 

* Autor por correspondencia: Benedicto Martínez Coca: bmcoca@censa.edu.cu; benedicto.martinez21@gmail.com

 

RESUMEN

El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto combinado de tres cepas de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg (Ta. 13, Ta. 78 y Ta. 90) con Azofert® (Rhizobium leguminosarum cepa CF1) sobre el crecimiento y desarrollo de plantas de frijol común Phaseolus vulgaris L. (cv. 'BAT-304') en condiciones semicontroladas. Las evaluaciones se realizaron en plantas de 32 días, sembradas en dos momentos: 1) siembra e inoculación de Trichoderma en el suelo al unísono; 2: siembra de las plantas siete días después de la inoculación del suelo con el hongo. Se determinó la altura de las plantas, la longitud de la raíz, el número de hojas, flores, zarcillos y vainas, la masa fresca y seca del área foliar y radicular, la capacidad endófita de Trichoderma en las raíces, la efectividad de nodulación de Rhizobium y la inducción de enzimas peroxidasas (POD), polifenoloxidasas (PPO) y fenilalanina amonio liasas (PAL). Los resultados de los tratamientos, en ambas formas de inoculación, se contrastaron según análisis de varianza simple seguido de la prueba de mínima diferencia significativa. Se comprobó la capacidad de las cepas de T. asperellum estudiadas de colonizar endofíticamente las raíces de P. vulgaris (cv. 'BAT-304') y su compatibilidad con Azofert®, en condiciones controladas. De manera general, los tratamientos a los que se les aplicó T. asperellum desde el momento de la siembra presentaron los mejores valores de los parámetros de crecimiento y desarrollo evaluados. La coinoculación de las cepas Ta. 13 y Ta. 78 con Azofert® tuvo un efecto sinérgico sobre la estimulación del crecimiento y la expresión de enzimas de defensa PAL, PPO y POD de P. vulgaris.

Palabras clave: 
enzimas vegetales; frijol; hongo endófito; promoción del crecimiento vegetal; Rhizobium.
 
ABSTRACT

The aim of this work was to evaluate the effect of Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg (Ta. 13, Ta. 78 and Ta. 90) combined with Azofert® on growth and development of Phaseolus vulgaris L. (cv. 'BAT-304') under semi-controlled conditions. Evaluations were carried out in 32-day-old plants sown at two times: 1) plant sowing and soil inoculation with Trichoderma at the same time, 2) plant sowing seven days after soil inoculation with the fungus. The plant height, root length, number of leaves, number of flowers, number of tendrils and pods, fresh and dry weight of plant aerial parts and roots, Trichoderma endophytic capacity in roots, nodulation effectiveness by Rhizobium and the induction of peroxidase enzymes (POD), polyphenoloxidases (PPO), and phenylalanine ammonium lyases (PAL) were determined. All results were contrasted according to simple analysis of variance followed by the least significant difference test. The co-inoculation of Ta. 13 and Ta. 78 with Azofert® had a synergist effect on growth and defense enzymes stimulation of P. vulgaris. The ability of the T. asperellum strains studied to endophytically colonize the roots of P. vulgaris (cv. 'BAT-304') and their compatibility with Azofert® were verified, under controlled conditions. In general, the treatments to which T. asperellum was applied from the moment of sowing presented the best values of the growth and development parameters evaluated. The co-inoculation of Ta. 13 and Ta. 78 with Azofert® had a synergistic effect on growth stimulation and expression of defense enzymes PAL, PPO and POD of P. vulgaris.

Keywords: 
plant enzymes; bean; endophyte fungus; plan growth promotion; Rhizobium.
 
 
 
INTRODUCCIÓN

El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) se considera uno de los alimentos claves para la seguridad alimentaria mundial por ser un cultivo de ciclo corto, exquisito sabor y elevado valor nutricional. Este grano forma parte de la dieta diaria del cubano y, por esta razón, en Cuba se implementan estrategias para el incremento de su rendimiento (11. Hernández Morales A. (Coordinación y Revisión General). La cadena de valor del frijol común en Cuba. Estudio de su situación en siete municipios de las provincias de Sancti Spíritus y Villa Clara. Editado por Programa de apoyo al fortalecimiento de cadenas agroalimentarias a nivel local (AGROCADENAS). 2016:175 pp. ISBN: 978-959-296-045-9). No obstante, aún la producción nacional no ha sido capaz de suplir las necesidades de la población debido a las diversas afectaciones por estrés abiótico o biótico que sufre esta leguminosa (22. Nuñez-Vázquez MC, Delgado-Acosta C, López-Padrón I, Martínez-González L, Reyes-Guerrero Y, Pérez-Domínguez G, et al. Nuevo bioestimulante y su influencia en la producción de frijol común. Cultivos Tropicales. 2020; 41(4):e08 Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0258-59362020000400008&lng=es&nrm=iso ).

La aplicación de bioproductos a los cultivos va teniendo cada vez más importancia en la obtención de alimentos con mejor calidad biológica, altos rendimientos, reducción de los costos de producción y menores daños a los ecosistemas. Estos bioproductos pueden actuar como biofertilizantes, bioestimulantes y/o bioplaguicidas (33. Carreras Solís B. Bioplaguicidas y Biofertilizantes. Tendencia de uso en LABIOFAM, Cuba. Cultura Científica y Tecnología. 2018; 15(66):15-19. http://dx.doi.org/10.20983/culcyt.2018.3.3 ). En el proceso productivo del frijol, usualmente se incorpora el biofertilizante Azofert®. Este inoculante, a base de bacterias del género Rhizobium, es capaz de asociarse con las plantas leguminosas y formar nódulos en sus raíces, dentro de los cuales fijan el nitrógeno del aire y lo brindan directamente a la planta (44. Nápoles MC, Cabrera JC, Onderwater R, Wattiez R, Hernández I, Martínez L, Núñez M. Señales en la interacción Rhizobium leguminosarum-frijol común (Phaseolus vulgaris L.). Cultivos Tropicales. 2016; 37(2):37-44. ).

Por su parte, Trichoderma spp. se encuentra entre los antagonistas más atractivos debido a su amplio espectro de acción para el control de plagas. Este antagonista se reconoce por su elevada capacidad reproductiva, plasticidad ecológica y por actuar a través de mecanismos directos e indirectos que proporcionan a la planta mejor adaptabilidad en el medio y resistencia a diferentes patógenos (55. Martínez B, Infante D, Peteira B. Taxonomía polifásica y variabilidad en el género Trichoderma. Rev. Protección Veg. 2015; 30 (especial):11-22. ). Durante el proceso de colonización de las raíces, Trichoderma estimula los mecanismos de defensa de las plantas contra numerosos microorganismos fitopatógenos (66. Hermosa R, Viterbo A, Chet I, Monte E. Plant-beneficial effects of Trichoderma and of its genes. Microbiology. 2012; 158:17-25. doi: 10.1099/mic.0. 052274-0).

El cepario del laboratorio de Micología Vegetal del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) dispone de cepas de T. asperellum que están caracterizadas morfofisiológica, patogénica y molecularmente (77. Cruz A, Rivero D, Echevarría A, Infante D, Martínez B. Trichoderma asperellum en el manejo de hongos fitopatógenos en los cultivos de arroz (Oryza sativa L.), frijol (Phaseolus vulgaris L.) y soya (Glycine max L.). Rev. Protección Veg. 2015; 30(supl.1):87-87., 88. Martínez-Coca BV. Diagnóstico, caracterización y algunas alternativas de manejo de enfermedades en cultivos de importancia económica. Rev. Protección Veg. 2013; 28(3):237-237.). Estas cepas son endófitas de las raíces de P. vulgaris, estimulan la germinación y el crecimiento del cultivo y aumentan la actividad de algunos grupos enzimáticos relacionados con la defensa vegetal (99. González-Marquetti I, Infante-Martínez D, Arias-Vargas Y, Gorrita-Ramírez S, Hernández-García T, de la Noval-Pons BM, et al. Efecto de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg sobre indicadores de crecimiento y desarrollo de Phaseolus vulgaris L. cultivar 'BAT-304'. Rev. Protección Veg. 2019; 34(2):e05. Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1010-27522019000200004&lng=es. ).

El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de cepas seleccionadas de T. asperellum combinadas con Azofert® sobre el crecimiento y desarrollo de P. vulgaris.

MATERIALES Y MÉTODOS

El experimento se realizó en una casa de malla del CENSA (22°59'29.1"N 82°09'12.3"W), a temperatura de 25±2ºC, humedad relativa entre el 80-85 % y fotoperiodo natural. Se usaron macetas que contenían como sustrato 400 g de suelo (ferralítico rojo típico) (1010. Costales D, Nápoles MC, Núñez M, Falcón A. Influencia de un análogo de brasinoesteroide sobre la nodulación de plántulas de soya (Glycine max (L) Merril. Cultivos Tropicales. 2008; 29(2):65-69.) y abono orgánico en proporción 3:1 (v/v), esterilizado por un intervalo de 30 minutos en autoclave a 120ºC, repitiendo la operación a las 24 horas.

Las cepas Ta. 13, Ta. 78 y Ta. 90 de T. asperellum, provenientes del Laboratorio de Micología Vegetal del CENSA, se conservaron en placas Petri de 9 cm de diámetro (Ø) contentivas de Agar Malta (AM) (BioCen) y se incubaron a una temperatura de 28ºC±2ºC en una incubadora (Friocell) y oscuridad constante. Posteriormente se sembraron en Papa Dextrosa Agar (PDA) (BioCen) durante cinco días, tiempo para el cual las placas se encontraron completamente esporuladas. A partir de estos cultivos puros, se prepararon los inóculos de las cepas de T. asperellum en forma de suspensión a una concentración de 107 conidios.ml-1 según cámara de conteo.

Para la siembra se usaron semillas de P. vulgaris cv. 'BAT-304', proporcionadas por el Instituto de Granos (Cuba) con 100 % de viabilidad. Se evaluaron dos momentos de siembra: 1) las semillas se sembraron inmediatamente después de la inoculación del suelo con T. asperellum y 2) la siembra de las semillas se realizó siete días después de la inoculación de T. asperellum.

Para evaluar el efecto combinado de Azofert® con las diferentes cepas de T. asperellum se estableció un grupo control de plantas no inoculadas. Por su parte, se consideraron tratamientos las plantas inoculadas con Azofert®, las inoculadas con cada una de las cepas de T. asperellum, así como las variantes combinadas (Tabla 1).

 
Tabla 1.  Tratamientos usados para evaluar los efectos de las cepas de T. asperellum y Azofert® sobre P. vulgaris (cv. 'BAT-304')/ Treatments used to evaluate the effects of the T. asperellum strains and Azofert® on P. vulgaris (cv. 'BAT-304')
TratamientosDescripción
ControlFrijol sin inocular
F+AFrijol inoculado con Azofert®
F+Ta.13Frijol inoculado con Ta. 13
F+Ta.78Frijol inoculado con Ta. 78
F+Ta.90Frijol inoculado con Ta. 90
F+A+Ta.13Frijol inoculado con Azofert® y Ta. 13
F+A+Ta.78Frijol inoculado con Azofert® y Ta. 78
F+A+Ta.90Frijol inoculado con Azofert® y Ta. 90
 

La inoculación con Azofert® se llevó a cabo mediante adición directa a las semillas a razón de 200 ml del producto por cada 50 kg de semillas, cinco minutos antes de la siembra.

Se utilizó un diseño experimental completamente aleatorizado. Para todos los análisis se realizaron tres réplicas y tres repeticiones para cada tratamiento, incluido el control.

Durante el experimento, las plantas se regaron en días alternos con 20 ml de agua potable. Las plantas se retiraron de las macetas cuando alcanzaron el estadio de la floración a los 32 días posteriores a la germinación y se les midieron los siguientes indicadores: longitud de la parte aérea (cm), longitud de la raíz (cm), número de hojas, flores, zarcillos y vainas, masa fresca foliar y radicular (g), masa seca foliar y radicular (g). La longitud de la parte aérea y la raíz se midió mediante regla milimetrada. Por su parte, las masas frescas se determinaron en una balanza de precisión (Kern), mientras, las masas secas se obtuvieron mediante balanza infrarroja (Kern).

Para evaluar la colonización endofítica de las cepas de T. asperellum, las muestras de raíces se lavaron con agua corriente cuidadosamente y se secaron con papel de filtro Whatman No. 4. Las raíces se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1 % durante 30 segundos y posteriormente con alcohol al 70 % durante un minuto. Entre cada desinfección, las muestras se lavaron con agua destilada estéril tres veces. Seguidamente se cortaron con un bisturí estéril en secciones de 1 cm y se homogenizaron. Por último, se seleccionaron 12 segmentos al azar de los cuales se sembraron tres en placas Petri de 9 cm (Ø), contentivas con PDA, y se incubaron a 28ºC±2ºC y oscuridad constante. Se sembraron tres placas por cada tratamiento. Las evaluaciones se realizaron hasta la aparición de las estructuras del hongo.

Para evaluar la efectividad nodular de Rhizobium, se analizó el porcentaje de nódulos efectivos (%) según la coloración en el interior de los nódulos a través del corte transversal de estos (1111. Febles-González JM, Vega MB, do Amaral-Sobrinho NMB. La degradación de los suelos ferralíticos rojos en el Occidente de Cuba. I Seminario Internacional de Manejo Sostenible de Suelos Agrarios y de Recursos Naturales. 2013.).

Por su parte, las actividades enzimáticas específicas peroxidasa (POD), polifenoloxidasa (PPO), fenilalanina amonio liasa (PAL) se analizaron según métodos descritos por Peteira et al. (1212. Peteira B, Dueñas F, Arias Y, Martínez Y, Pino O. Caracterización de materiales promisorios de tomate obtenidos en el programa de mejoramiento para la resistencia al TYLCV. Fitopatología. 2008;43(3):105-119.).

Todos los análisis se realizaron mediante comparación con el Análisis de Varianza Simple y la prueba de mínima diferencia significativa LSD Fisher (α=0.10) usando el programa InfoStat versión 2017 (1313. Di Rienzo JA, Casanoves F, Balzarini MG, Gonzalez L, Tablada M, Robledo CW. InfoStat [programa de cómputo]. Córdoba, Argentina: Universidad Nacional de Córdoba; 2017 [Disponible en: http://www.infostat.com.ar/). ).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las plantas tratadas germinaron al tercer día mientras que las plantas control lo hicieron al quinto día después de la siembra. No se observaron diferencias en los tiempos de germinación entre las plantas que se trataron con las cepas de Trichoderma, Azofert® o la combinación de microorganismos. Estos resultados coinciden con los de Yadav et al. (1414. Yadav SK, Dave A, Sarkar A, Singh HB, Sarma BK. Co-inoculated biopriming with Trichoderma, Pseudomonas and Rhizobium improves crop growth in Cicer arietinum and Phaseolus vulgaris. Int. J. Environ. Agric. Biotech. 2013; 6(2):255-259. ), quienes observaron un incremento significativo de la germinación de semillas de Cicer arietinum L. y P. vulgaris que se habían inoculado con T. asperellum T42 y/o Rhizobium sp. RH4, pero no encontraron diferencias significativas entre las plantas inoculadas. El momento de siembra tampoco influyó en los tiempos de germinación de las plantas tratadas, debido a que en todos los casos la germinación se evidenció al tercer día posterior a la siembra.

En cuanto a la estimulación del crecimiento y desarrollo de las plantas de P. vulgaris, se observó que la inoculación con ambos agentes biológicos produjo el aumento del número de flores y zarcillos, así como el incremento de las masas frescas foliar y radicular, mientras que el resto de los parámetros evaluados no mostraron diferencias significativas entre los tratamientos. Estos cambios se produjeron, principalmente, durante el primer momento de siembra (Tabla 2).

La inoculación con la cepa Ta.13 logró el incremento del número de flores y la masa fresca de la raíz cuando se aplicó de forma independiente. Esto podría deberse a la capacidad de solubilización de nutrientes de algunas cepas de T. asperellum contribuyendo a la asimilación de estos por la planta y/o al incremento de las concentraciones del ácido giberélico en las hojas, fitohormona relacionada con la floración (1515. Zhao L. y Zhang Y. Effects of phosphate solubilization and phytohormone production of Trichoderma asperellum Q1 on promoting cucumber growth under salt stress. J. Integr. Agric. 2015; 14(8):1588-1597.).

En aquellas plantas inoculadas con Azofert® y Ta. 13, además del aumento en el número de flores, se pudo apreciar un incremento significativo del número de zarcillos y de la masa fresca foliar. Esto mostró que R. leguminosarum, como bacteria fijadora de N, incrementó la síntesis de proteínas y de la biomasa foliar propiciando la formación de las estructuras reproductivas.

Los resultados obtenidos en el presente trabajo no coinciden con los de investigaciones previas las cuales mostraron que la aplicación de Ta. 13, al momento de la siembra, incrementó significativamente la altura de las plantas de frijol de 15 días de edad (99. González-Marquetti I, Infante-Martínez D, Arias-Vargas Y, Gorrita-Ramírez S, Hernández-García T, de la Noval-Pons BM, et al. Efecto de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg sobre indicadores de crecimiento y desarrollo de Phaseolus vulgaris L. cultivar 'BAT-304'. Rev. Protección Veg. 2019; 34(2):e05. Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1010-27522019000200004&lng=es. ). Estas diferencias sugieren que el incremento de la longitud en la parte aérea de la planta producida con la inoculación de Trichoderma pudiera ser más notable en estadios tempranos del desarrollo del frijol. Por su parte, las plantas inoculadas con Ta. 90 incrementaron significativamente el número de zarcillos en las plantas, mientras que, las que se trataron con Azofert® combinado con las cepas Ta. 78 y Ta. 90, mostraron aumentos significativos en los números de flores y zarcillos con respecto a las plantas control (Tabla 2).

La inoculación con Trichoderma y/o Rhizobium no condujo a un incremento significativo de la biomasa de las plantas. Estos resultados coincidieron con los de Grabe et al. (1616. Gabre VV, Venancio WS, Moraes BA, Furmam FG, Galvão CW, Daniel Ruiz Potma Gonçalves, et al. Multiple Effect of Different Plant Growth Promoting Microorganisms on Beans (Phaseolus vulgaris L.) Crop. Braz. Arch. Biol. Technol. 2020; 63: e20190493. ), quienes no apreciaron un incremento significativo en las masas secas foliar y radicular en plantas de P. vulgaris (en estadio R6 o floración) que habían sido inoculadas con T. asperellum, Rhizobium tropici y T. asperellum + Rhizobium tropici al momento de la siembra. Sin embargo, se observó que la aplicación conjunta de la cepa Ta. 78 y Azofert® condujo a la acumulación de biomasa de la raíz comparado con las plantas que solo recibieron la inoculación con Azofert®. Este comportamiento pudiera estar relacionado con que las plantas coinoculadas con estas cepas también mostraron la mejor efectividad de la nodulación con respecto al control para ese momento de siembra (Fig. 1).

De manera general, los tratamientos a los que se les aplicó T. asperellum desde el momento de la siembra presentaron los mejores valores de los parámetros de crecimiento y desarrollo evaluados. Este hecho indica que el estadio fenológico de la planta pudiera influir en su mejor asimilación a los microorganismos benéficos, probablemente porque en estos primeros estadios aún no se han desarrollado respuestas defensivas lo suficientemente fuertes que limiten la colonización de los mismos.

Se constató la capacidad de colonizar endofíticamente las raíces de P. vulgaris (cv. 'BAT-304') por parte de las cepas de T. asperellum utilizadas en este estudio (Fig. 2). Se conoce que varias especies de Trichoderma pueden crecer dentro de las raíces y funcionar como endófitos facultativos (1717. Druzhinina IS, Seidl-Seiboth V, Herrera-Estrella A, Horwitz BA, Kenerley CM, Monte E, et al. Trichoderma: the genomics of opportunistic success. Nat. Rev. Microbiol. 2011; 9:749-759. ). La colonización por parte de microorganismos endófitos se ha asociado con la supresión de una amplia variedad de enfermedades en las plantas y con la promoción del crecimiento vegetal (1818. Neelipally RTKR, Anoruo AO, Nelson S. Effect of Co-Inoculation of Bradyrhizobium and Trichoderma on growth, development, and yield of Arachis hypogaea L. (Peanut). Agronomy 2020; 10:1415. doi:10.3390/agronomy10091415. ).

La observación de nódulos en las raíces permitió apreciar que la inoculación con Trichoderma no afectó totalmente la colonización de Rhizobium (Fig. 1). Sin embargo, al menos durante el primer momento de siembra, la efectividad nodular fue baja; la combinación de Azofert® y Ta. 78 fue el tratamiento que mostró el mayor porcentaje (12 %). Freitas et al. observaron que la aplicación Trichoderma spp. no inhibió el proceso de nodulación en Vigna unguiculata (L.) Walp. cuando el hongo fue inoculado con rizobios (1919. Freitas-Chagas Junior A, Gonçalves de Oliveira A, Rodrigues dos Santos G, Barbosa- Reis H, França-Borges Chagas L, Oliveira-Miller L. Combined inoculation of rhizobia and Trichoderma spp. on cowpea in the savanna, Gurupi-TO, Brazil. Revista Brasileira de Ciências Agrárias. 2015; 10(1):27-33.). Se ha demostrado que algunas especies de Trichoderma afectan la interacción entre las leguminosas y las rizobacterias, y se han observado efectos positivos, negativos o neutros (2020. Martinez-Medina A, Pozo MJ, Cammue BPA, Vos CMF. Belowground Defence Strategies in Plants: The Plant-Trichoderma Dialogue. In: Vos C., Kazan K. (eds) Belowground Defence Strategies in Plants. Signaling and Communication in Plants. Springer, Cham. 2016. https://doi.org/10.1007/978-3-319-42319-7_13 ).

En cambio, los nódulos presentes en las raíces de aquellas plantas sembradas después de siete días de la inoculación del suelo con T. asperellum, mostraron mayores porcentajes de efectividad nodular, aunque estos valores no tuvieron diferencias significativas con respecto al control. Además, para este momento de siembra, la coinoculación mostró valores de porcentaje de nódulos efectivos significativamente superiores al tratamiento con Azofert®. Hoyos-Carvajal et al. (2121. Hoyos-Carvajal L, Orduz S, Bissett J. Growth stimulation in bean (Phaseolus vulgaris L.) by Trichoderma. Biological control. 2009; 51(3):409-416.) plantearon que algunos aislamientos de T. asperellum, al solubilizar el fosfato a partir de Ca3PO4 y/o roca fosfórica, aumentan su disponibilidad para las plantas. Por lo tanto, el incremento en la efectividad de los nódulos en los tratamientos coinoculados podría ser consecuencia del aumento de fósforo, nutriente clave para el éxito de la nodulación (2222. Mweetwa AM, Chilombo G, Gondwe BM. Nodulation, nutrient uptake and yield of common bean inoculated with Rhizobia and Trichoderma in an acid soil. J. Agric. Sci. 2016; 8(12):61-71.).

En ambos momentos de siembra se encontraron nódulos en plantas provenientes de semillas que no habían recibido la aplicación de Azofert®. Esto sugiere presencia de rizobacterias endófitas en las semillas usadas en el experimento. En este sentido, Mora et al. (2323. Mora Y, Díaz R, Vargas-Lagunas C, Peralta H, Guerrero G, Aguilar A, et al. Nitrogen-fixing rhizobial strains isolated from common bean seeds: phylogeny, physiology, and genome analysis. Applied and Environmental Microbiology. 2014; 80(18):5644-5654. ) y Peralta et al. (2424. Peralta H, Aguilar A, Díaz R, Mora Y, Martínez-Batallar G, Salazar E, et al. Genomic studies of nitrogen-fixing rhizobial strains from Phaseolus vulgaris seeds and nodules. BMC Genomics. 2016; 17:711. https://doi.org/10.1186/s12864-016-3053-z ) informaron que varias cepas de rizobios fijadoras de nitrógeno fueron capaces de colonizar semillas de P. vulgaris, lo que podría explicar la aparición de nódulos pequeños, en ocasiones inefectivos, en las raíces de plantas no inoculadas.

Por otra parte, la aplicación combinada de Azofert® y T. asperellum incrementó marcadamente la expresión de enzimas de defensa PAL, PPO y POD en el primer momento de siembra (Fig. 3). Las plantas tratadas con Azofert® y Ta. 78 mostraron las mayores actividades enzimáticas en los tres complejos enzimáticos estudiados, con diferencias significativas con respecto al control. Las plantas que fueron inoculadas con Azofert® y Ta. 13 expresaron elevadas actividades PAL y PPO, mientras que las que tenían Azofert® y Ta. 90 lo hicieron en el caso de los complejos PPO y POD

 
Tabla 2.  Efectos de cepas de T. asperellum y Azofert® sobre el crecimiento y desarrollo de P. vulgaris (cv. 'BAT-304') / Effect of T. asperellum strains and Azofert® on growth and development indicators of P. vulgaris (cv. 'BAT-304')
Momento de siembraTratamientoLongitud parte aérea (cm)LOngitud Raíz (cm)No. HojasNo. FloresNo. ZarcillosNo. VainasMasa Fresca Foliar (g)Masa Fresca Raíz (g)Masa Seca Foliar (g)Masa Seca Raíz (g)
IControl98,16 ± 6,51a23,64 ± 2,25ab24,67 ± 1,77a1,56 ± 0,59c0,00 ± 1,44b0,33 ± 0,24ab9,57 ± 2,10bc3,97 ± 1,15b1,69 ± 0,47a0,53 ± 0,15ab
F+Ta.13102,42 ± 6,51a28,33 ± 2,25a24,11 ± 1,77a3,44 ± 0,59ab0,00 ± 0,83b0,44 ± 0,24ab14,62 ± 2,10ab7,23 ± 1,15a2,54 ± 0,47a0,60 ± 0,15ab
F+Ta.78105,21 ± 6,51a26,64 ± 2,25ab19,44 ± 1,77b2,33 ± 0,59bc0,22 ± 0,83b0,00 ± 0,24b10,83 ± 2,10abc5,90 ± 1,15ab1,69 ± 0,47a0,55 ± 0,15ab
F+Ta.9093,29 ± 6,51a24,66 ± 2,25ab21,33 ± 1,77ab2,44 ± 0,59bc4,33 ± 0,83a0,44 ± 0,24ab10,82 ± 2,10abc4,23 ± 1,15b1,79 ± 0,47a0,54 ± 0,15ab
F+A106,73 6,51a23,33 ± 2,25ab24,33 ± 1,77a2,00 ± 0,59c0,22 ± 0,83b0,44 ± 0,24ab8,90 ± 2,10c3,95 ± 1,15b1,68 ± 0,47a0,42 ± 0,15 b
F+A+Ta.13101,54 ± 6,51a25,29 ± 2,25ab24,11 ± 1,77a4,56 ± 0,59a3,44 ± 0,83a0,56 ± 0,24ab15,53 ± 2,10a6,56 ± 1,15ab2,72 ± 0,47a0,78 ± 0,15ab
F+A+Ta.7892,01 ± 6,51a21,99 ± 2,25b19,56 ± 1,77b4,11 ± 0,59a5,00 ± 0,83a0,56 ± 0,24ab14,33 ± 2,10ab5,97 ± 1,15ab2,52 ± 0,47a0,82 ± 0,15a
F+A+Ta.90102,66 ± 6,51a21,98 ± 2,25b21,89 ± 1,77ab4,00 ± 0,59a4,44 ± 0,83a0,67 ± 0,24a13,04 ± 2,10abc4,66 ± 1,15ab2,72 ± 0,47a0,59 ± 0,15ab
IIControl114,82 ± 11,93a26,22 ± 3,24ab29,60 ± 2,78a6,80 ± 1,26bc5,20 ± 0,66a1,40 ± 0,40ab14,29 ± 2,30ab4,89 ± 1,28abc1,95 ± 0,30a0,57 ± 0,13abc
F+Ta.1394,26 ± 11,93abcd26,24 ± 3,24ab28,80 ± 2,78ab6,60 ± 1,26bc4,40 ± 0,66abc1,00 ± 0,40abc10,82 ± 2,30ab2,66 ± 1,28bc1,55 ± 0,30ab0,35 ± 0,13bc
F+Ta.7894,06 ± 10,08abcd19,86 ± 2,74b23,86 ± 2,35abc8,14 ± 1,07ab4,71 ± 0,56ab0,43 ± 0,34c15,24 ± 2,30ab5,49 ± 1,28ab1,59 ± 0,30ab0,66 ± 0,13ab
F+Ta.9072,38 ± 13,34cd24,15 ± 3,63ab22,25 ± 3,11bc4,25 ± 1,41c2,75 ± 0,73c0,25 ± 0,45c8,88 ± 2,81b3,94 ± 1,57abc0,62 ± 0,36c0,29 ± 0,16c
F+A98,34 ± 11,93abc27,38 ± 3,24a24,00 ± 2,78abc7,00 ± 1,26bc3,60 ± 0,66bc1,80 ± 0,40a11,79 ± 2,30ab2,49 ± 1,28bc1,25 ± 0,30abc0,44 ± 0,13abc
F+A+Ta.1383,03 ± 9,43bcd25,18 ± 2,56ab23,88 ± 2,20abc8,50 ± 1,00ab3,50 ± 0,52bc1,00 ± 0,32abc15,74 ± 2,30a6,45 ± 1,28a1,93 ± 0,30a0,76 ± 0,13a
F+A+Ta.78104,48 ± 13,34ab25,88 ± 3,63ab27,75 ± 3,11abc11,00 ± 1,41a2,75 ± 0,73c0,50 ± 0,45bc10,31 ± 2,81ab3,06 ± 1,57abc1,62 ± 0,36ab0,51 ± 0,16abc
F+A+Ta.9071,84 ± 8,89d25,39 ± 2,42ab21,56 ± 2,07c10,11 ± 0,94a3,00 ± 0,49c0,33 ± 0,30c9,74 ± 2,30b2,17 ± 1,28c1,08 ± 0,30bc0,42 ± 0,13bc

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p >0,10)/ Media with a common letter are not significantly different (p> 0.10)

 

 
Fig. 1.  Efectividad de la nodulación en raíces de P. vulgaris (cv. 'BAT-304') inoculadas con Azofert® y cepas de T. asperellum. Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p >0,10)/ Effectiveness of nodulation in P. vulgaris (cv. 'BAT-304') roots inoculated with Azofert® and T. asperellum strains. Means with a common letter are not significantly different (p> 0.10)
 

 
Fig. 2.  Colonización de las raíces de P. vulgaris (cv. 'BAT-304') por T. asperellum (A, B y C: Ta. 13, Ta. 78 y Ta. 90, respectivamente) / Endophytic colonization of roots of P. vulgaris (cv. 'BAT-304') by T. asperellum (A, B and C: Ta. 13, Ta. 78 and Ta. 90, respectively)
 

Las plantas inoculadas con Azofert® y Ta. 78 por separado, que se sembraron en el primer momento, presentaron valores de actividad enzimática PPO y POD superiores a las plantas control. En cambio, los tratamientos que habían sido plantados en el segundo momento mostraron niveles de actividades enzimáticas inferiores a los del primero. No obstante, algunos tratamientos tuvieron incrementos significativos con respecto al control; se destacó la combinación de la cepa Ta. 13 con Azofert® por producir una elevada expresión de PAL y PPO en las plantas.

 
Fig. 3.  Efecto de T. asperellum y Azofert® sobre la producción de enzimas defensivas en P. vulgaris (cv. 'BAT-304'), en dos momentos de siembra de las semillas con relación a la aplicación del hongo al suelo. Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p>0,10)/ Effect of T. asperellum and Azofert® on production of defence enzymes in P. vulgaris (cv. 'BAT-304') at two moments respect to the application of the fungus into the soil. Means with letters in common are not significantly different (p > 0.10)
 

La actividad de la PPO fue elevada para las tres combinaciones de Rhizobium con T. asperellum lo que coincidió con lo informado por Saber et al. (2525. Saber WlA, Abd ELHal KM, Ghonocm KM. Synergistic effect of Trichoderma and Rhizobium on both biocontrol of chocolate spot disease and induction of nodulation, physiological activities and productivity of Vicia faba. Res. J. Microbiol. 2009; 4(8):286-300), quienes observaron elevados niveles de la actividad de esta enzima con la aplicación dual de R. leguminosarum y Trichoderma en plantas de Vicia faba L. Esta enzima cataliza la oxidación de fenoles a quinonas con la consecuente formación de complejos de proteínas que evitan la depredación de los tejidos vegetales por parte de las plagas y propicia la formación de barreras estructurales para patógenos invasores (2626. Boeckk T, Winters AL, Webb KJ, Kingston-Smith AH. Polyphenol oxidase in leaves: is there any significance to the chloroplastic localization? J. Exp. Bot. 2015; 66(12):3571-3579.).

El proceso evolutivo de las plantas les permitió desarrollar varios mecanismos para tolerar diferentes estreses bióticos y abióticos (2727. Sarma BK, Yadav SK, Singh S, Singh HB. Microbial consortium-mediated plant defense against phytopathogens: Readdressing for enhancing efficacy. Soil Biol. Biochem. 2015; 87:25-33. doi: 10.1016/j.soilbio.2015.04.001 ). Durante el proceso de colonización de las raíces de algunos microorganismos benéficos se produce la inducción de un estado fisiológico único llamado cebado (de “priming” en inglés), que activa un conjunto de respuestas defensivas de mayor magnitud y duración que las causadas por microorganismos patógenos (2828. Peteira Delgado-Oramas B. La resistencia inducida como alternativa para el manejo de plagas en las plantas de cultivo. Rev. Protección Veg. 2020; 35(1):e07. Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1010-27522020000100001&lng=es. ). Sarma et al. (2626. Boeckk T, Winters AL, Webb KJ, Kingston-Smith AH. Polyphenol oxidase in leaves: is there any significance to the chloroplastic localization? J. Exp. Bot. 2015; 66(12):3571-3579.) plantearon que la inducción de la resistencia puede multiplicarse varias veces cuando este cebado se lleva a cabo por un consorcio consistente en dos o más cepas de microorganismos benéficos compatibles.

Los elevados niveles de actividad enzimática que presentaron las plantas tratadas con la combinación de las cepas de T. asperellum y Azofert® constatan el planteamiento anterior. La aplicación de ambos microorganismos de manera simultánea (primer momento de siembra) propicia un mayor efecto sinérgico en la expresión de actividad enzimática; mientras que, en el caso de las inoculaciones desfasadas, esta sinergia fue menos marcada.

Varias publicaciones justifican los beneficios de las coinoculaciones de microorganismos para la obtención de efectos sinérgicos que potencian el crecimiento y la resistencia al estrés en los cultivos (2929. Tsimilli-Michael M, Eggenberg P, Biro B, Köves-Pechy K, Vörös I, Strasser RJ. Synergistic and antagonistic effects of arbuscular mycorrhizal fungi and Azospirillum and Rhizobium nitrogen-fixers on the photosynthetic activity of alfalfa, probed by the polyphasic chlorophyll a fluorescence transient O-J-I-P. Appl. Soil Ecol. 2000; 15(2):169-182. ISSN 0929-1393, https://doi.org/10.1016/S0929-1393(00)00093-7 , 3030. Moreira H, Pereira SIA, Vega A, Castro PML, Marques APGC. Synergistic effects of arbuscular mycorrhizal fungi and plant growth-promoting bacteria benefit maize growth under increasing soil salinity. J Environ Manage. 2020; 257:109982. ISSN 0301-4797, https://doi.org/10.1016/j.jenvman.2019.109982 , 3131. Kavadia A, Omirou M, Fasoula DA, Louka F, Ehaliotis C, Ioannides IM. Co-inoculations with rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi alters mycorrhizal composition and lead to synergistic growth effects in cowpea that are fungal combination-dependent. Appl. Soil Ecol. 2021; 167:104013. ISSN 0929-1393, https://doi.org/10.1016/j.apsoil.2021.104013 ). La mayoría de estos ejemplos se centran en las coinoculaciones con microorganismos promotores del crecimiento.

Aún son escasas las investigaciones donde se combinan los hongos con efecto antagonista, como es el caso de los hongos del género Trichoderma con otros promotores del crecimiento. En este sentido, Bécquer et al. hallaron efectos positivos en el crecimiento Triticum aestivum L. con la coinoculación de Bradyrhizobium sp. y Trichoderma harzianum en condiciones de estrés por sequía (3232. Bécquer-Granados CJ, Puentes-Pérez AB, Ávila-Cordoví U, Quintana-Sanz M, Galdo-Rodríguez Y, Medinilla-Nápoles F, et al. Efecto de la inoculación con Bradyrhizobium sp. y Trichoderma harzianum en triticale (X. Triticosecale Wittmack), en condiciones de estrés por sequía. Pastos y Forrajes. 2016; 39(1):19-26. Disponible en <http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S086403942016000100003&lng=es&nrm=iso>. ). Por su parte, Freitas et al. observaron que la aplicación combinada de rizobios y Trichoderma spp. incrementó la sobrevivencia y eficacia de V. unguiculata contra Rhizoctonia solani Kühn (1919. Freitas-Chagas Junior A, Gonçalves de Oliveira A, Rodrigues dos Santos G, Barbosa- Reis H, França-Borges Chagas L, Oliveira-Miller L. Combined inoculation of rhizobia and Trichoderma spp. on cowpea in the savanna, Gurupi-TO, Brazil. Revista Brasileira de Ciências Agrárias. 2015; 10(1):27-33.).

Bizos et al. (3333. Bizos G, Papatheodorou EM, Chatzistathis T, Ntalli N, Aschonitis VG, Monokrousos N. The role of microbial inoculants on plant protection, growth stimulation, and crop productivity of the olive tree (Olea europea L.). Plants (Basel). 2020; 9(6):743. doi:10.3390/plants9060743.) declararon, tomando como ejemplo la coinoculación de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal y hongos micorrícicos arbusculares, que probablemente esta sería más beneficiosa, debido a que la rizobacteria puede mejorar el establecimiento del hongo micorrícico mediante la producción de vitaminas y enzimas o aumentando la permeabilidad de la pared celular de la epidermis de la raíz estimulando el crecimiento de las hifas y, consecuentemente, el crecimiento de las plantas y la absorción de nutrientes. Por lo tanto, el éxito de las coinoculaciones podría basarse en la compatibilidad de los microorganismos coinoculados y en la especificidad microorganismo-planta, así como en la relación cooperativa que puede establecerse entre ellos para lograr la colonización y coexistencia en el nicho que ocupan.

Los resultados del presente trabajo también destacan la importancia del momento de inoculación de los microorganismos. Aportar ventaja a uno de los microorganismos benéficos, en este caso a Rhizobium, podría incrementar su competitividad frente a Trichoderma, así como generar cambios estructurales o fisiológicos en la planta que retarden su establecimiento y, por lo tanto, limiten sus beneficios para la planta. La interacción durante la coinoculación de dos microorganismos benéficos requiere de estudios que aclaren los mecanismos por los cuales dicha interacción se lleva a cabo.

La coinoculación de Trichoderma con Azofert® demostró un marcado efecto sinérgico en la estimulación de crecimiento y las respuestas defensivas de P. vulgaris, fundamentalmente la aplicación combinada de las cepas Ta. 13 y Ta. 78 con Rhizobium.

 
 
 
AGRADECIMIENTOS

El colectivo de autores de este artículo desea agradecer a los técnicos Dariana Castellón Miranda, Keylan Barbón Samón, Yudit Roque García, Noreydis Fernández Gálvez y Roberto Enrique Regalado su participación en las diferentes fases de montaje, muestreo y evaluaciones de resultados llevados a cabo en este estudio; a la MSc. Fraimarys de Moya Abich por su función clave en el mantenimiento de este experimento y en el muestreo.

Este estudio fue financiado por los proyectos “Caracterización Molecular y Mecanismos Indirectos en Cepas Promisorias de Trichoderma Relacionados con la Fitosanidad” del Programa Nacional de Salud Animal y Vegetal y “Re-cycling of biomass nutrients and carbon for advanced organic fertilization in an ecosmart and climate positive agriculture on Cuba (Bio-C)”, del Schweizerischer National Fonds y el Fondo Nacional de Ciencia (FONCI) de Cuba.

 

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Recibido: 27/09/2021

Aceptado: 31/10/2021

 
 

Declaración de conflicto de intereses: Los autores declaran que no existe conflicto de intereses.

Contribución de los autores: Ivonne González Marquetti participó en el diseño y montaje del experimento, en el muestreo, evaluaciones de los parámetros estudiados y llevó a cabo la elaboración de las bases de datos y el análisis estadístico de los resultados. Realizó la redacción y corrección del manuscrito. Danay Ynfante-Martínez participó en el diseño y montaje del experimento, llevó a cabo la elaboración de las suspensiones de hongos realizados en el estudio, participó en el muestreo y evaluaciones de los parámetros estudiados. Fue la principal responsable de la evaluación de la capacidad endofítica de T. asperellum en las raíces frijol común. Susana Gorrita-Ramírez participó montaje del experimento, en el muestreo y evaluaciones de los parámetros estudiados. Fue responsable de la determinación de las masas secas foliar y radicular. Belkis Morales-Mena proporcionó el Azofert® utilizado en el estudio, asesoró sobre su uso y aportó literatura relacionada con el uso de rizobacterias promotoras del crecimiento en frijol. María Caridad Nápoles participó en el análisis de los resultados relacionados con nodulación de Rhizobium, en la discusión e interpretación de los resultados e incidió en la redacción de la versión final del artículo. Belkis Peteira Delgado-Oramas participó en la concesión de la idea del experimento, en su diseño y orientó la realización de los muestreos. Participó en la discusión de los resultados, así como en la corrección del manuscrito. Benedicto Martínez-Coca fue el líder del proyecto que financió el estudio. Concibió el experimento, participó en su diseño, orientó la realización de los muestreos, participó en el montaje del mismo, en el muestreo y en las evaluaciones de los parámetros estudiados.

 

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