Caracterización de la variabilidad genética de cepas de Pseudomonas spp. patógenas en arroz

Análisis de la huella genética mediante PCR

Las cepas se analizaron mediante una PCR con los cebadores PfF3 (5´-AACGGGTGTACTTGGTCAGG-3´) y PfR3 (5´-CTCCGAGATTACCCACAAGC-3´) (1616. Onasanya A, Basso A, Somado E, Gasore ER, Nwilene FE, Ingelbrecht I, et al. Development of a combined molecular diagnostic and DNA fingerprinting technique for rice bacteria pathogens in Africa. Biotechnology. 2010; 9(2):89-105.).

La mezcla de PCR se realizó con 50 ng de ADN genómico de cada una de las cepas, 0,2 µM de cada cebador y 1X GoTaq G2 Green Master Mix (Promega, EUA): 1X Green GoTaq G2 Reaction Buffer (pH 8,5); 0,2 mM de dNTPs; 1,5 mM de MgCl2 y 1 U de Taq ADN polimerasa; en un volumen total de 25 µL. Como control negativo se utilizó agua desionizada estéril. La amplificación se realizó con el siguiente programa: desnaturalización inicial a 94°C durante 3 min, seguido por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C por 1 min, alineamiento a 55°C durante 1 min y extensión a 72°C, 2 min, con una extensión final a 72°C por 7 min, en un termociclador Eppendorf Mastercycler.

Los productos de amplificación se separaron en un gel de agarosa (1 %), mediante una corrida electroforética (tampón Tris-Ácido bórico-EDTA 0,5 X teñido con bromuro de etidio) a 100 V, durante 30 min (1717. Sambrook J, Fritsch ER, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.). 1989. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.). Los amplicones se visualizaron en un transiluminador de luz UV Syngene InGenius L (Syngene, EE. UU). Se utilizó el marcador de peso molecular de 1 Kb (Ladder, Promega).

Análisis de la huella genética mediante rep-PCR

Para el desarrollo de este ensayo se utilizaron los cebadores descritos por Ravi et al. (1414. Ravi A, Prathap V, Narayana P, Sokka S, Sivaramakrishnan S. Assessment of Genetic Diversity in Pseudomonas fluorescens using PCR-based Methods. Bioremediation, Biodiversity and Bioavailability. 2011; 5(1):10-16.) (Tabla 1).

La mezcla de reacción para la PCR (volumen final de 20 µL) consistió en 1X GoTaq G2 Green Master Mix (Promega, EUA): (1X Green GoTaq G2 Reaction Buffer (pH 8,5); 0,2 mM de dNTPs; 1,5 mM de MgCl2 y 1 U de Taq ADN polimerasa); 0,5 µM de cada cebador y 5-50 ng de ADN genómico bacteriano. Como control negativo se utilizó agua desionizada estéril en lugar de ADN. Las reacciones se desarrollaron en un termociclador programable Master Cycler (Eppendorf, Alemania), de acuerdo al programa descrito por Ravi et al. (1414. Ravi A, Prathap V, Narayana P, Sokka S, Sivaramakrishnan S. Assessment of Genetic Diversity in Pseudomonas fluorescens using PCR-based Methods. Bioremediation, Biodiversity and Bioavailability. 2011; 5(1):10-16.). El mismo consistió en una desnaturalización inicial a 94ºC por 3 min; 45 ciclos de desnaturalización a 94ºC por 25 s, alineamiento a 52ºC (para BOX y ERIC-PCR) o a 38^oC (para REP-PCR) durante 1 min, y extensión a 72^oC por 1 min; seguido de una extensión final a 72^oC durante 8 min.

Se realizaron tres réplicas de los ensayos de rep-PCR, con tres conjuntos de ADN genómico de las cepas bacterianas. La corrida electroforética se realizó según se refirió previamente, pero en un gel de agarosa (1,2 %), durante 2 h y 50 min.

Para cada cepa, se registraron los perfiles genéticos consistentes que se visualizaron en las repeticiones. Con estos datos se realizó una matriz binaria donde se asignó “1” a la presencia y “0” a la ausencia de cada una de las bandas y se analizó su similitud genética mediante el método UPGMA, distancia de Jaccard, contenido en el Programa NTSYSpc21 versión 2.11. Los dendrogramas obtenidos sirvieron como base para evaluar la variabilidad molecular de las cepas.

Análisis de la huella genética mediante PCR

Se obtuvo amplificación de bandas con tres patrones diferentes: una banda común, de aproximadamente 700 pb (única en las cepas A9, A36, A63, PR1 y PR3), una banda adicional para A74 y A75 de más de 1000 pb, y un total de cuatro bandas para A90 y A91. Esto evidencia la presencia de, al menos, tres perfiles genéticos diferentes entre las cepas cubanas causantes de la pudrición de la vaina (Figura 1). Las cepas A74 y A75 mostraron iguales perfiles, lo cual sugiere que se trata de una misma especie.

Onasanya et al. (1616. Onasanya A, Basso A, Somado E, Gasore ER, Nwilene FE, Ingelbrecht I, et al. Development of a combined molecular diagnostic and DNA fingerprinting technique for rice bacteria pathogens in Africa. Biotechnology. 2010; 9(2):89-105.) también identificaron tres perfiles diferentes, aunque obtuvieron 23 fragmentos, en una PCR utilizando los cebadores PfF3 y PfR3. Estos autores indicaron la conveniencia de la aplicación de la PCR, con estos cebadores, para el análisis de numerosas muestras, lo que permite mayor eficiencia en el estudio de la virulencia y del movimiento de las poblaciones de patógenos bacterianos en el cultivo del arroz.

Análisis por rep-PCR

El número de bandas amplificadas, para cada cepa, varió desde 3 hasta 11 con los juegos de cebadores de rep-PCR. La talla de los fragmentos de ADN amplificados osciló entre 200 y 4000 pb. Para la población de cepas analizadas, se obtuvieron 60 bandas de ADN en los tres ensayos (ERIC, BOX y REP-PCR): 28, 13 y 19 por cada uno de estos, respectivamente.

Sobre la base del análisis por rep-PCR (Figura 2), se distinguieron fundamentalmente tres grupos. El primero comprendió las cepas A9, A36, A63, PR1 y PR3; el segundo, las cepas A74 y A75 y el tercero, A90 y A91. La similitud entre las cepas del primer grupo fue superior al 55 % y alcanzó el 100 % para las cepas A36 y A63 en los tres ensayos.

Las cepas A74 y A75 exhibieron una similitud de 80 % para ERIC-PCR y 100 % para REP y BOX-PCR; mientras que, entre las cepas A90 y A91, osciló entre el 75 y el 100 %; entre estos dos grupos de 0 (por REP-PCR) hasta 44 % (por BOX-PCR). Algunas de las cepas mostraron bandas únicas (como A9 y PR3 en el ensayo ERIC-PCR, A90 en BOX-PCR, y PR1 en REP-PCR), lo que indica la capacidad de esta técnica para diferenciar entre cepas.

Estos resultados corroboraron que existe variabilidad genética entre las cepas estudiadas, como se demostró en el ensayo previo de PCR. De igual forma, se informó alta variabilidad molecular entre cepas procedentes de Filipinas, al compararlas con cepas de referencia de Japón y de Burundi (1212. Cottyn B, Barrios H, George T, Vera-Cruz CM. Characterization of rice sheath rot from Siniloan, Philippines. Int Rice Res Notes. 2002;27(1):39-40.).

En los dos tipos de ensayos evaluados, las cepas A9, A36, A63, A74, A75, A90, A91, PR1 y PR3 mostraron variabilidad molecular, lo que evidencia la presencia de tres grupos de Pseudomonas que circulan en el país. Uno de ellos estuvo conformado por A74 y A75. El segundo grupo incluyó las cepas A90 y A91, que compartieron un polimorfismo similar en los análisis genómicos realizados. Algunos autores analizaron poblaciones de Pseudomonas infectando arroz, con diversidad metabólica, plasticidad del genoma y adaptación funcional, lo que les posibilita, incluso, estar presentes en diferentes nichos ecológicos (1818. Quibod IL, Grande G, Oreiro EG, Borja FN, Dossa GS, Mauleon R, et al. Rice-Infecting Pseudomonas Genomes Are Highly Accessorized and Harbor Multiple Putative Virulence Mechanisms to Cause Sheath Brown Rot. PloS ONE. 2015; 10(9):e0139256.). Las cepas A9, A36, A63, PR1 y PR3, ubicadas en el último grupo, muestran patrones polimórficos muy similares entre ellas y se pueden clasificar como Pseudomonas sp. o P. fluorescens, aunque son patógenas al cultivo del arroz. En este sentido, existen informes de cepas de P. fluorescens que pueden ser patógenas ocasionales de numerosos cultivos, entre ellos: arroz, trigo, maíz, sorgo, papa, ajo, pepino, algodón, tomate, tabaco, frijol y cítricos (1919. CABI. Crop Protection Compendium [CD-Rom]. 2006. Wallingford, Londres: CABI., 2020. Viteri A, Regalado H, Toaza A. Identificación de Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas marginalis, causantes del síndrome del peridermo “Pink Eye” en papa. Revista Científica Ecuatoriana. 2020; 7(2):49-59., 2121. Beiki F, Busquets A, Gomila M, Rahimian H, Lalucat J, García E. New Pseudomonas spp. Are Pathogenic to Citrus. PLoS ONE. 2016; 11(2):e0148796.).

No obstante, se requiere profundizar en los estudios de variabilidad y diagnóstico de la enfermedad de la Pudrición parda de la vaina en el país, con un enfoque polifásico, y donde se aborden estudios taxonómicos o de caracterización mediante técnicas moleculares, como la PCR con cebadores específicos o la detección múltiple de las principales especies relacionadas con esta enfermedad (33. Pedraza LA, Bautista J, Uribe-Vélez D. Seed-borne Burkholderia glumae infects rice seedling and maintains bacterial population during vegetative and reproductive growth stage. Plant Pathol. J. 2018; 34(5):393-402., 2222. Aflaha I, Chairul J, Baharuddin A, Kuswinanti T. Molecular identification of bacteria causing grain rot disease on rice. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. 2020;486:012165. doi:10.1088/1755-1315/486/1/012165 , 2323. Bangratz M, Wonni I, Kini K, Sondo M, Brugidou C, Béna G, et al. Design of a new multiplex PCR assay for rice pathogenic bacteria detection and its application to infer disease incidence and detect co-infection in rice fields in Burkina Faso. PLoS ONE. 2020; 15 (4): e0232115. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0232115 ) y la secuenciación de genes conservados independientes o concatenados: ARNr 16S, rpoB, rpoD-gyrB, atpD-carA-recA-ARNr 16S (1818. Quibod IL, Grande G, Oreiro EG, Borja FN, Dossa GS, Mauleon R, et al. Rice-Infecting Pseudomonas Genomes Are Highly Accessorized and Harbor Multiple Putative Virulence Mechanisms to Cause Sheath Brown Rot. PloS ONE. 2015; 10(9):e0139256., 2424. Ogier JC, Pages S, Galan M, Barret M, Gaudriault S. rpoB, a promising marker for analizing the diversity of bacterial communities by amplicon sequencing. BMC Microbiology. 2019; 19(171):16 p.), entre otras (88. Peix A, Ramírez ME, Velázquez BE. The current status of Pseudomonas revisited: An update. Infection, Genetics and Evolution. 2018; 57:106-116., 2525. Musonerimana S, Venturi V. The rice sheath rot pathogen Pseudomonas fuscovaginae; microbiome and cell-cell signaling studies. [PhD Thesis in Molecular Biology]. 2020; 156 p. [En línea]. [Consultado: 16 de febrero de 2022]. Disponible en: https://iris.sissa.it/retrieve/handle/20.500.11767/112329/124405/Samson_Thesis_2020.pdf ). En tal sentido, Quibod et al. (1818. Quibod IL, Grande G, Oreiro EG, Borja FN, Dossa GS, Mauleon R, et al. Rice-Infecting Pseudomonas Genomes Are Highly Accessorized and Harbor Multiple Putative Virulence Mechanisms to Cause Sheath Brown Rot. PloS ONE. 2015; 10(9):e0139256.) detectaron eventos de inserción-deleción en el genoma de cepas de Pseudomonas que permiten una alta frecuencia de intercambio genético, e influyen en la variación genética intrínseca, lo que hace que las cepas, con alta similitud entre ellas, representen grupos filogenéticos diferentes, evidenciando que el estatus filogenético de estas cepas necesita ser analizado en el contexto de metapoblaciones.