INTRODUCCIÓN
⌅En las plantas, los indicadores de crecimiento, desarrollo y producción, se ven afectados por el déficit de determinados nutrientes como el fósforo, el potasio, el hierro y, fundamentalmente, del nitrógeno el que, aunque se encuentra abundante en estado gaseoso en la naturaleza (78 % de la atmósfera) (11. Fijación Biológica de Nitrógeno Atmosférico. El nitrógeno y su importancia. INTAGRI. 2018. Disponible en: https://www.intagri.com/articulos/nutricion-vegetal/fijacion-biologica-de-nitrogeno-atmosferico. (Consulta: 2 agosto 2022), 22. Fijación Biológica de Nitrógeno: Plantas y Bacterias. 2022. Disponible en: https://eos.com/es/blog/fijacion-biologica-de-nitrogeno/(Consulta: 2 agosto 2022)), no está siempre disponible para las plantas. Este último elemento es determinante para el desarrollo y crecimiento de las plantas, específicamente de las leguminosas, que son afectadas cuando es pobre el contenido de nitrógeno en los suelos. Por ello, se realizan aplicaciones de fertilizantes nitrogenados los que, a través del tiempo, ocasionaron problemas irremediables de contaminación, ya que muchos acaban en ríos, lagunas, océanos y hasta en agua potable (33. Cuadrado B, Rubio G, Santos W. Caracterización de cepas de Rhizobium y Bradyrhizobium (con habilidad de nodulación) seleccionados de los cultivos de fríjol caupi (Vigna unguiculata) como potenciales bioinóculos. Rev. Colomb. Cienc. Quím. Farm. 2009; 38 (1): 78-104., 44. Mikhailova N. El uso equilibrado de fertilizante gracias a las técnicas nucleares contribuye a aumentar la productividad y a proteger el medio ambiente. Boletín del OIEA. 2020. Disponible en: https://www.iaea.org/es/newscenter/news/el-uso-equilibrado-de-fertilizante-gracias-a-las-tecnicas-nucleares-contribuye-a-aumentar-la-productividad-y-a-proteger-el-medio-ambiente. (Consulta: 8 agosto 2022)).
Como resultado de las investigaciones para hallar nuevas alternativas que permitan disminuir los costos de las producciones agrícolas y las contaminaciones, se cuenta en la actualidad con bioproductos que pueden actuar como biofertilizantes que favorecen y estimulan el crecimiento de las plantas, así como sus respuestas de defensa (55. Nagananda GS, Das A, Bhattacharya S, Kalpana T. In vitro studies on the effects of biofertilizers (Azotobacter and Rhizobium) on seed germination and development of Trigonellafoenum-graecum L. using a novel glass marble containing liquid medium. Int J Botany. 2010; 6 (4): 394-403., 66. Boraste A, Vamsi K, Jhadav A, Khairnar Y, Gupta N, Trivedi S, et al. Biofertilizers: a novel tool for Agriculture. Int J Microbiol. 2009; 1 (2): 23-31.).
Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR), que nodulan en las raíces de las leguminosas y fijan nitrógeno (Rhizobium spp.), constituyen una opción natural de fertilización. Estas bacterias se producen a gran escala y se añaden como inoculantes a semillas de diversos cultivos agrícolas hace más de 100 años, con resultados alentadores (33. Cuadrado B, Rubio G, Santos W. Caracterización de cepas de Rhizobium y Bradyrhizobium (con habilidad de nodulación) seleccionados de los cultivos de fríjol caupi (Vigna unguiculata) como potenciales bioinóculos. Rev. Colomb. Cienc. Quím. Farm. 2009; 38 (1): 78-104.).
En el suelo, la asociación de microorganismos, aseguran un equilibrio ecológico estable. No obstante, Sadowsky (77. Sadowsky MJ. Competition for nodulation in the soybean / Bradyrhizobium symbiosis. En: Triplett EW. (Ed.). Prokaryotic nitrogen fixation. Horizon Scientific Press. Wymondham, UK. 2000; 279 pp.) demostró que Rhizobium compite por sitios, en las raíces de las leguminosas, para iniciar el proceso de nodulación, influenciado por una serie de factores, entre estos la competencia por espacio y/o nutrientes con otros microorganismos del suelo, como pudieran ser algunos hongos de los géneros Trichoderma y Pochonia.
Estos hongos habitan comúnmente en la rizosfera de las plantas, colonizan diversos sustratos y sobreviven a condiciones adversas, a través de la producción de metabolitos y clamidosporas (88. Samuels GJ. Trichoderma: a review of biology and systematic of the genus. Mycol Res. 1996; 100 (8): 923-935., 99. Bader AN, Salerno GL, Covacevich F, Consolo VF. Bioformulation of Trichoderma harzianum in solid substrate and effects of its application on pepper plants. Rev. Fac. Agron. 2020; 119 (1): 1-9. https://doi.org/10.24215/16699513e037., 1010. Arévalo J, Hidalgo-Díaz L, Martins I, Souza JF, Castro JMC, Carneiro RMDG, et al. Cultural and morphological characterization of Pochonia chlamydosporia and Lecanicillium psalliotae isolated from Meloidogyne mayaguensis eggs in Brazil. Tropical Plant Pathology. 2009; 34 (3):158-163., 1111. Ceiro-Catasú WG, Hidalgo-Viltres M, Hidalgo-Díaz L, Arévalo-Ortega J, García-Bernal M, Mazón-Suástegui JM. Establecimiento in vitro del hongo nematófago Pochonia chlamydosporia var. catenulata en diferentes suelos. Terra Latinoamericana. 2021; 39: 1-7. e792. https://doi.org/10.28940/terra.v39i0.792.). Esos organimos tienen la capacidad de colonizar endofíticamente las raíces de diversos cultivos y poseen un efecto estimulante sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas, mediante la inducción de respuestas bioquímicas y estructurales de la planta o la biosíntesis de fitohormonas (1212. Larriba E, Jaime MDLA, Nislow C, Martín NJ, López LLV. Endophytic colonization of barley (Hordeum vulgare) roots by the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia reveals plant growth promotion and a general defense and stress transcriptomic response. Jour. of Plant Research. 2015; 128 (4): 665-678., 1313. Camargo-Cepeda D, Ávila E. Efectos del Trichoderma sp. sobre el crecimiento y desarrollo de la arveja (Pisum sativum L.). Ciencia y Agricultura. 2014; 11 (1): 91-100., 1414. Zhao L, Zhang Ya-qing. Effects of phosphate solubilization and phytohormone stress. Jour. of Integrative Agriculture. 2015; 14 (8): 1588-1597.). Esta promoción del crecimiento podría ayudar a la planta a “escapar”, desde fases tempranas, al ataque de agentes fitopatógenos causantes de enfermedades (1515. Hoyos-Carvajal L, Duque G, Orduz S. Antagonismo in vitro de Trichoderma spp. sobre aislamientos de Sclerotinia spp. y Rhizoctonia spp. Rev. Colombiana de Ciencias Horticolas. 2011; 2 (1): 76-86.) y nematodos fitoparásitos (1616. Lopez-Llorca LV, Gómez-Vidal S, Monfort E, Larriba E, Casado-Vela J, Elortza F, et al. Expression of serine proteases in egg-parasitic nematophagous fungi during barley root colonization. Fungal Genetics and Biology. 2010; 47: 342-351.). Por otra parte, la capacidad endofítica de estos agentes biológicos, puede conferirles a las plantas resistencia para enfrentar situaciones de estreses bióticos o abióticos presentes en su hábitat natural (1717. Kerry BR, Hirsch PR. Ecology of Pochonia chlamydosporia in the rhizosphere at the population, whole organism and molecular scales. En: Daviers K, Spiedel Y (Eds). Biological Control of Plant-Parasitic Nematodes. Springer Netherlands. 2011; 171-182., 1818. González-Marquetti I, Infante-Martínez D, Arias-Vargas Y, Gorrita-Ramírez S, Hernández-García T, de la Noval-Pons BM, et al. Efecto de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg sobre indicadores de crecimiento y desarrollo de Phaseolus vulgaris L. cultivar BAT-304. Rev. de Protección Veg. 2019; 34 (2): 1-10.).
La antibiosis es uno de los mecanismos de acción antagónica más conocido entre microorganismos presentes en la rizosfera, al disputarse nutrientes o ubicación espacial (1919. Salina Ventura R, Boriano Bonilla B. Efecto de Trichoderma viride y Bradyrhizobium yuanmingense en el crecimiento de Capsicum annuum en condiciones de laboratorio. REBIOLEST. 2014; 2 (2): e32., 2020. Bécquer CJ, Ramos Y, Nápoles JA, Dolores AM. Efecto de la interacción Trichoderma-rizobio en Vigna luteola SC-123. Pastos y Forrajes. 2004; 27 (2): 139-145.). Actualmente, para favorecer los rendimientos agrícolas, y evitar costos de aplicación por plaguicidas se utilizan productos a base de mezclas de microorganismos, luego de realizar estudios previos, sobre los efectos de sus mecanismos frente a cada agente microbiano.
Por ello, la presente investigación tuvo como objetivo evaluar la compatibilidad in vitro entre Rhizobium (CIAT 899) y cepas de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg, y Pochonia chlamydosporia var. catenulata (Kamyschko ex Barron y Onions) Zare y Gams.
MATERIALES Y MÉTODOS
⌅El trabajo se realizó en el laboratorio de Micología Vegetal (LMV) del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) (Latitud 22,991867 y Longitud -82,153892), ubicado en el municipio San José de las Lajas, provincia Mayabeque, Cuba.
Para la evaluación de la antibiosis y la competencia por el espacio se desarrolló el método del Cultivo Dual (CD), descrito por Martínez y Solano (2121. Martínez B, Solano T. Antagonismo de Trichoderma spp. frente a Alternaria solani (Ellis & Martin) Jones y Grout. Rev. Protección Veg. 1995; 10 (3): 221-225.). Se probaron cuatro cepas de T. asperellum y una de P. chlamydosporia frente a Rhizobium.
Las condiciones de crecimiento de los hongos pertenecientes a la colección del LMV del CENSA, antes del CD fueron las siguientes: las cepas Ta.13, Ta.78, Ta.85 y Ta.90 de T. asperellum y de P. chlamydosporia (IMI SD 187) se sembraron en placas Petri (Ø = 90 mm) con medio Agar Malta (AM, BioCen) y Papa Dextrosa Agar (PDA, BioCen) y pH 5,6, e incubaron a temperatura de 28±2°C y 25±1°C, respectivamente, bajo régimen de oscuridad constante. Mientras que, la cepa de Rhizobium (CIAT 899), donada gentilmente por el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), se cultivó en Agar Nutriente (AN, BioCen) a temperatura de 28±2°C y oscuridad constante.
El montaje de la técnica (CD) (2121. Martínez B, Solano T. Antagonismo de Trichoderma spp. frente a Alternaria solani (Ellis & Martin) Jones y Grout. Rev. Protección Veg. 1995; 10 (3): 221-225.) se realizó en placas Petri (Ø = 90 mm) que contenían medio de cultivo PDA (BioCen) con pH 5,6. Para ello, se sembró, a cinco mm del borde de la periferia de la placa Petri, un disco (cinco mm de Ø) proveniente de la zona de crecimiento activo en la periferia de las colonias puras de T. asperellum, crecidas sobre AM durante tres días y de P. chlamydosporia de 15 días en PDA; y diametralmente opuesto, se sembró una azada en estrías a partir de un cultivo puro de la cepa bacteriana, crecida en AN. Se realizaron cinco réplicas por tratamiento (Trichoderma-Rhizobium y Pochonia-Rhizobium), y se incluyeron controles de cada cepa, sembradas independientemente y en igual posición que en el CD.
Las placas se incubaron durante siete días a 28±2°C, para la interacción de Rhizobium con las cepas de T. asperellum y sus respectivos controles y 18 días a 25±1°C, con P. chlamydosporia y sus controles, bajo régimen de oscuridad constante. El crecimiento de los hongos se midió con una regla milimetrada. Las evaluaciones para Trichoderma se realizaron cada 24 h, después de la siembra; mientras que, el crecimiento radial de P. chlamydosporia se comenzó a evaluar a partir del tercer día y sucesivamente a los siete, diez y 18 días.
La antibiosis se evaluó al comparar el crecimiento de los hongos (Trichoderma o Pochonia) en el CD, con el de los respectivos controles, antes del momento de contacto con la bacteria a las 48 y 240 horas, respectivamente (2121. Martínez B, Solano T. Antagonismo de Trichoderma spp. frente a Alternaria solani (Ellis & Martin) Jones y Grout. Rev. Protección Veg. 1995; 10 (3): 221-225.).
La competencia de estos hongos sobre la bacteria se realizó en las mismas placas donde fue evaluada la antibiosis. El antagonismo de los hongos frente a la cepa bacteriana se determinó, según la escala de grados referida por Bell et al. (2222. Bell K, Wells D, Markham R. In vitro antagonismo of Trichoderma species against six fungal plant pathogers. Phytopathol. 1982; 72: 379-382.) y se determinó el Porcentaje de Inhibición del Crecimiento Radial (PICR) en cada momento de evaluación, con el empleo de la fórmula de Samaniego et al. (2323. Samaniego G, Ulloa S, Herrera S. Hongos del suelo antagonistas de Phymatotrichum omnivorum. Rev. Mex. Fitopatología.1989; 8: 86-95.): PICR= (R1-R2) / R1x100
Donde, R1 es el crecimiento radial del hongo en el tratamiento control y R2 es el crecimiento radial del hongo en el cultivo dual.
Transcurridas 168 horas, se extrajo un fragmento de la zona donde ocurrió la interacción entre Trichoderma y Rizobium, y se depositó en placas Petri con medio de cultivo PDA (BioCen) e incubó en iguales condiciones a las descritas anteriormente. El efecto de la bacteria sobre el crecimiento de Trichoderma o viceversa se evaluó por la obtención de colonias de ambos microorganismos, a partir de la muestra sembrada de la interacción.
Los datos obtenidos, a partir de los ensayos, se procesaron a través de un Análisis de Varianza simple (ANOVA) y las medias se compararon por LSD Fisher con un nivel de significación (p≤0,05), mediante el paquete informático estadístico InfoStat Profesional versión 2017 (2424. Di Rienzo JA, Casanoves F, Balzarini MG, González L, Tablada M, Robledo CW. InfoStat [programa de cómputo]. Córdoba, Argentina: Universidad Nacional de Córdoba. 2017. Disponible en: http://www.infostat.com.ar/.).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
⌅A las 24 horas, las cepas de T. asperellum mostraron un crecimiento más rápido en el CD respecto al control, excepto Ta.85 (Fig. 1), lo que pudiera ser por algún (nos) compuesto(s) excretado(s) por Rhizobium, que estimule(n) las cepas de Trichoderma. En sus estudios, Woo y Lorito (2525. Woo L, Lorito M. Exploiting the interactions between fungal antagonists, pathogens and the plant for control. En: Vurro M, Gressel J (Eds). Novel Biotechnologies for Control Agent Enhancement and Management. Amsterdam, The Netherlands: IOS, Springer Press. 2007; 107-130.) y Talibi et al. (2626. Talibi I, Boubaker H, Boudyach EH, Ait Ben, Aoumar A. Alternative methods for the control of postharvest citrus diseases. Jour. Applied Microbiol. 2014; 117 (1): 1-17.) declararon que las hifas de Trichoderma, en su crecimiento hacia el hospedante, se estimulan por moléculas procedentes del mismo, como aminoácidos y azucares. A las 48 horas, previo al contacto, las colonias del hongo presentaron valores estadísticamente inferiores, con respecto a las del control, excepto la cepa Ta.13. En este sentido, algunos autores demostraron que Rhizobium tiene el potencial necesario para producir compuestos extracelulares (como la trifolitoxina) con actividades antimicrobianas directas o moléculas de alto peso molecular llamadas rizobiocinas (o bacteriocinas medianas) las que, por sus propiedades biocidas, desempeñan una función muy importante en la competencia a nivel rizosférico (2727. Twelker S, Oresnik LJ, Hynes MF. Bacteriocins of Rhizobium leguminosarum. A molecular analysis. Highlights of nitrogen fixation research. En: Martínez E. &, Hernández G (Eds). Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York. 1999;20: 105). Esto pudiera ser la respuesta al resultado en la antibiosis, donde participa este tipo de compuesto que inhibe el crecimiento de hongos en su microambiente, como parte de su interacción por un nicho, lo que provocó inhibición en el crecimiento de las cepas de T. asperellum.
Estos resultados son similares a los informados por Becker et al. (2828. Bécquer CJ, Lazarovits G, Lalin I. Interacción in vitro entre Trichoderma harzianum y bacterias rizosféricas estimuladoras del crecimiento vegetal. Revista Cubana de Ciencia Agrícola. 2013; 47 (1): 97-102.), quienes encontraron inhibición del crecimiento de Trichoderma frente a Sinorhizobium respecto al control, a las 48 horas.
A las 96 horas, las cepas de T. asperellum se ubicaron en la clase 1 de la Escala de Bell et al. (2222. Bell K, Wells D, Markham R. In vitro antagonismo of Trichoderma species against six fungal plant pathogers. Phytopathol. 1982; 72: 379-382.) en el enfrentamiento con la cepa de Rhizobium; Trichoderma sobrecrece completamente la colonia bacteriana y cubre totalmente la superficie del medio de cultivo, dado a su velocidad de crecimiento y adaptación (2929. Castro-Toro M, Rivillas-Osorio A. Trichoderma spp. modos de acción, eficacia y usos en el cultivo de café. Boletín Ténico Cenicafé. 2012; 38: 31 pp.). Esto sugiere que, posiblemente, la excreción de metabolitos por parte de Rhizobium disminuyó o las cepas de Trichoderma se adaptaron a estos durante el enfrentamiento (88. Samuels GJ. Trichoderma: a review of biology and systematic of the genus. Mycol Res. 1996; 100 (8): 923-935.) (Fig. 2B).
En todos los casos evaluados, se evidenció un incremento del área colonizada por las cepas de T. asperellum con el aumento de la edad del cultivo, frente a la cepa bacteriana, hasta cubrir totalmente la superficie de la placa.
Algunos autores (3030. Lorito M, Woo SL, Harman GE, Monte E. Translational research on Trichoderma: from "omics" to the field. Annu Rev. Phytopathol. 2010; 48: 395-417., 3131. De la Cruz-Quiroz R, Roussos S, Rodríguez-Herrera R, Hernández-Castillo D, Aguilar CN. Growth inhibition of Colletotrichum gloesporioides and Phytophthora capsici by native Mexican Trichoderma strains. Karbala Int. J. of Modern Science. 2018; 4: 237-243., 3232. Hoyos-Carvajal L, Duque G, Orduz S. Antagonismo in vitro de Trichoderma spp. sobre aislamientos de Sclerotinia spp. y Rhizoctonia spp. Rev. Colombiana de Ciencias Horticolas. 2011; 2 (1): 76-86.) confirmaron que la velocidad de crecimiento de Trichoderma también es un atributo vital para su acción como biocontrolador de agentes fitopatógenos de diversos cultivos ya que, al colonizar con mayor rapidez la zona de la rizosfera y los espacios del suelo, en general, limita o detiene completamente su proliferación.
El análisis de los resultados del PICR ratificó los obtenidos con la aplicación de la escala de Bell et al. (2222. Bell K, Wells D, Markham R. In vitro antagonismo of Trichoderma species against six fungal plant pathogers. Phytopathol. 1982; 72: 379-382.) a las 96 horas, ya que las cepas de Trichoderma no mostraron inhibición en su crecimiento, en confrontación con Rhizobium, respecto al control. A pesar de que Trichoderma cubrió completamente la placa y en algunos casos hubo sobrecrecimiento sobre la colonia bacteriana (Fig.2 B), al realizar la siembra de varios puntos de la zona de interacción entre Trichoderma y Rhizobium, no se visualizaron efectos negativos sobre la fisiología de estos microorganismos; es decir, dicho efecto solo se debió a un fenómeno de competencia, mecanismos de acción de especies cuando están en interacción.
Trichoderma es un excelente competidor con otros microorganismos del suelo por sustratos y exudados radicales; por tanto, este mecanismo es un elemento a considerar en la interacción del antagonista y la rizobacteria, cuando se encuentren en un mismo nicho ecológico. Este aspecto presupone que, para un mejor establecimiento y función de ambos organismos en la rizosfera de las plantas, pudiera considerarse la inoculación de Rhizobium previa a la de T. asperellum, aunque entre ellos no existan efectos adversos.
Para corroborar los efectos de combinaciones de agentes biológicos, algunos investigadores, como Becker et al. (2020. Bécquer CJ, Ramos Y, Nápoles JA, Dolores AM. Efecto de la interacción Trichoderma-rizobio en Vigna luteola SC-123. Pastos y Forrajes. 2004; 27 (2): 139-145.), obtuvieron un aumento significativo del rendimiento de materia seca (MS) y la producción de biomasa (PB) total de la planta con las aplicaciones de Bradyrhizobium sp. y a los 15 días Trichoderma harzianum Rifai cepa A-34. Esto supone que no hubo competencia ni efecto inhibitorio sobre los nódulos por parte del hongo, ya que el periodo de formación de los nódulos en la leguminosa transcurrió sin la presencia de T. harzianum; resultados constatados, además, por Freitas et al. (3333. Freitas-Chagas Junior A, Gonçalves de Oliveira A, Rodrigues dos Santos G, Barbosa- Reis H, França-Borges Chagas L, Oliveira-Miller L. Combined inoculation of rhizobia and Trichoderma spp. on cowpea in the savanna, Gurupi-TO, Brazil. Revista Brasileira de Ciências Agrárias. 2015; 10 (1):27-33.). Hoyos-Carvajal et al. (3434. Hoyos-Carvajal L, Orduz S, Bissett J. Growth stimulation in bean (Phaseolus vulgaris L.) by Trichoderma. Biological Control. 2009; 51 (3): 409-416.) plantearon que T. asperellum, al solubilizar el fosfato a partir de Ca3PO4 y/o roca fosfórica, aumentó su disponibilidad para las plantas. Por lo tanto, el incremento en los valores fisiológicos pudo deberse a la efectividad de los nódulos en los tratamientos coinoculados, ya que podría ser consecuencia del aumento de fósforo, nutriente clave para el éxito de la nodulación (3535. Mweetwa AM, Chilombo G, Gondwe BM. Nodulation, nutrient uptake and yield of common bean inoculated with Rhizobia and Trichoderma in an acid soil. J. Agric. Sci. 2016; 8 (12):61-71.).
Por su parte, Becker et al. (3232. Hoyos-Carvajal L, Duque G, Orduz S. Antagonismo in vitro de Trichoderma spp. sobre aislamientos de Sclerotinia spp. y Rhizoctonia spp. Rev. Colombiana de Ciencias Horticolas. 2011; 2 (1): 76-86.), también en inoculaciones mixtas, evidenciaron resultados inferiores a los de la inoculación fraccionada con la cepa del hongo, pero superiores a la inoculación única con Bradyrhizobium y al control absoluto, lo cual indica que Trichoderma no presentó un carácter competitivo. Además, constaron que los niveles de proteína nodular detectados en los tratamientos donde se inoculó solamente T. harzianum cepa A-34 y donde se aplicó de forma fraccionada con Bradyrhizobium sp., fueron superiores al resto de los tratamientos, lo cual indicó que la actividad infectiva y de fijación de nitrógeno de los nódulos no se afectó al interactuar con la cepa A-34 de T. harzianum. En este sentido, Das et al. (3636. Tanusree Das, Sunita Mahapatra, Srikanta Das. In vitro Compatibility Study between the Rhizobium and Native Trichoderma Isolates from Lentil Rhizospheric Soil. Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci. 2017; 6 (8): 1757-1769.) encontraron incrementos en el rendimiento de la biomasa cuando se aplicaron Rhizobium y Trichoderma en combinación. Por su parte, González-Marquetti et al. (3737. González-Marquetti I, Ynfante-Martínez D, Gorrita S, Morales-Mena B, Nápoles MC, Peteira Delgado-Oramas B, et al. Efectos de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg y Azofert ® sobre el crecimiento y desarrollo de Phaseolus vulgaris L. Rev. de Protección Veg. 2021; 36 (3):1-9.) evidenciaron, con la aplicación combinada de dos cepas de T. asperellum con Azofert®, al momento de la siembra, un efecto sinérgico marcado sobre la estimulación del crecimiento y la expresión de enzimas específicas de defensa, fenilalanina amonio liasa (PAL), polifenoloxidasa (PPO) y peroxidasa (POD) de Phaseolus vulgaris L.
Zaki y Ghaffar (3838. Zaki MJ, Ghaffar A. Combined effects of microbial antagonists and nursery fertilizers on infection of mung bean by Macrophomina phaseolina (Tassi) Gord. Pakistan Phytopatology. 1995; 1: 17.) indicaron que Rhizobium sp. y T. harzianum, conjuntamente con otros microorganismos biocontroladores pueden coexistir, si evitan la competencia directa mediante el uso de diferentes fuentes de nutrientes en diferentes tiempos, así como ejercer acción antagonista sobre fitopatógenos de la rizosfera. Por su parte, Freitas et al. (3333. Freitas-Chagas Junior A, Gonçalves de Oliveira A, Rodrigues dos Santos G, Barbosa- Reis H, França-Borges Chagas L, Oliveira-Miller L. Combined inoculation of rhizobia and Trichoderma spp. on cowpea in the savanna, Gurupi-TO, Brazil. Revista Brasileira de Ciências Agrárias. 2015; 10 (1):27-33.) evidenciaron mayor sobrevivencia y tolerancia de Vigna unguiculata (L.) Walp., frente a Rhizoctonia solani Kühn, al aplicar Rhizobium y Trichoderma spp., de manera combinada.
Varias publicaciones justifican los beneficios de las coinoculaciones de microorganismos para la obtención de efectos sinérgicos que potencian el crecimiento y la resistencia al estrés en los cultivos de interés agrícola (3939. Tsimilli-Michael M, Eggenberg P, Biro B, Köves- Pechy K, Vörös I, Strasser RJ. Synergistic and antagonistic effects of arbuscular mycorrhizal fungi and Azospirillum and Rhizobium nitrogen-fixers on the photosynthetic activity of alfalfa, probed by the polyphasic chlorophyll a fluorescence transient O- J-I-P. Appl. Soil Ecol. 2000; 15 (2):169-182. ISSN 0929-1393, https://doi.org/10.1016/S0929-1393(00)00093-730 , 4040. Moreira H, Pereira SIA, Vega A, Castro PML, Marques APGC. Synergistic effects of arbuscular mycorrhizal fungi and plant growth-promoting bacteria benefit maize growth under increasing soil salinity. J. Environ Manage. 2020; DOI: 10.1016/j.jenvman.2019.109982., 4141. Kavadia A, Omirou M, Fasoula DA, Louka F, Ehaliotis C, Ioannides IM. Co-inoculations with rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi alters mycorrhizal composition and lead to synergistic growth effects in cowpea that are fungal combination-dependent. Appl. Soil Ecol. 2021; 167: 104013.). Sin embargo, investigaciones donde se combinen hongos antagonistas, como es el caso de especies del género Trichoderma, con otros promotores del crecimiento, aún son escasas.
A las 240 horas, antes del contacto de P. chlamydosporia con la cepa de Rhizobium, se observó una disminución del crecimiento del hongo en el CD, respecto al control; sin embargo, las diferencias no fueron significativas (Fig. 3). Esto pudiera estar relacionado con la excreción de metabolitos al medio por la bacteria, similar a lo observado con Trichoderma (2626. Talibi I, Boubaker H, Boudyach EH, Ait Ben, Aoumar A. Alternative methods for the control of postharvest citrus diseases. Jour. Applied Microbiol. 2014; 117 (1): 1-17.).
El antagonismo de P. chlamydosporia (cepa IMI SD 187) mostró grado 2 a los 18 días, según la escala de grado referida por Bell et al. (2222. Bell K, Wells D, Markham R. In vitro antagonismo of Trichoderma species against six fungal plant pathogers. Phytopathol. 1982; 72: 379-382.) en el enfrentamiento a Rhizobium. El hongo creció aproximadamente sobre las dos terceras partes de la superficie del medio de cultivo, posiblemente dado a su baja velocidad de crecimiento (4242. Zare R, Gams W, Evans HC. A revision of Verticillium section Prostrata. V. The genus Pochonia, with notes on Rotiferophthora. Nova Hedwigia. 2001; 73: 51-86.), sin descartar un posible efecto metabólico por parte de Rhizobium.
En los tratamientos, el crecimiento de la bacteria se detuvo a partir de los 12 días; mientras que, el hongo continuó creciendo hasta ponerse en contacto con la misma a los 18 días, sin evidencias de sobrecrecimieto sobre esta (Fig. 4B).
El PICR del hongo frente a la bacteria fue mayor en los primeros tres días de crecimiento con valor de 18,3 %; mientras que, en los diferentes momentos de evaluación, la inhibición que ejerció la bacteria sobre la cepa IMI SD 187 disminuyó con valores entre 2,5 y 4,1 %, en comparación al control.
Los resultados indican que Rhizobium sp. y P. chlamydosporia, pueden coexistir en el mismo tiempo y nicho.
Estos resultados se corresponden con los referidos por Puertas et al. (4343. Puertas A, de la Noval BM, Martínez B, Miranda I, Fernández F, Hidalgo-Díaz L. Interacción Pochonia chlamydosporia var. catenulata con Rhizobium sp., Trichoderma harzianum y Glomus clarum en el control de Meloidogyne incognita. Rev. Protección Veg. 2006; 21 (2): 80-89.), quienes encontraron compatibilidad de la cepa IMI SD 187 de P. chlamydosporia var. catenulata y Rhizobium sp., ya que al combinarse no se afectó su efectividad sobre nematodos y como biofertilizante, respectivamente, aspecto importante para un manejo integrado. Se relacionan, además, con los de Siddiqui (4444. Siddiqui IA, Shaukat SS. Combination of Pseudomonas aeruginosa and Pochonia chlamydosporia for Control of Root-Infecting Fungi in Tomato. J. Phytopathology. 2003; 151: 215-222.) quien no evidenció efecto inhibitorio de Rhizobium sp. sobre P. chlamydosporia var. catenulata y viceversa. Por otra parte, se corresponden con los informados por Monteiro (4545. Monteiro Avelar TS. Ação combinada de Pochonia chlamydosporia e outros microrganismos no controle do nematoide de galhas e no desenvolvimento vegetal. [Tese doctor scientiae]. Universidadde Federal de Viçosa, Brasil. 2017. 100 pp.) quien constató que la coaplicación del hongo nematófago y Rhizobium no afecta su acción biorreguladora sobre los nematodos agalleros ni la fijación de N2 en el cultivo de soja (Glycine max (L.) Merr). Además, se obtuvieron mayor producción de nódulos bacterianos en las raíces y aumento del contenido de hierro (Fe) en la parte aérea de las plantas.
Los resultados sugieren que P. chlamydosporia es capaz de interactuar con diferentes organismos sin perder su acción sobre los nematodos de agallas y de promover el crecimiento de las plantas.
CONCLUSIONES
⌅Los datos aportados en ambos experimentos tienen efecto positivo para aplicaciones futuras en las que se combinen estos microorganismos, ya que podría producir un efecto sinérgico en las plantas, lo cual favorecería el crecimiento vegetal, así como la inducción de respuestas de defensa para el manejo de plagas en cultivares de interés económico y, además, la reducción de costos por aplicación de estos agentes microbianos.