INTRODUCCIÓN
⌅Los hongos fitopatógenos ocasionan múltiples enfermedades a las plantas, provocando grandes afectaciones en la producción, los rendimientos y la calidad de los cultivos. Dentro de estos, se encuentran especies pertenecientes a los géneros Fusarium, Penicillium, Sclerotium, Rhizoctonia, que dañan los cultivos en campo y almacenamiento. Fusarium es uno de los fitopatógenos más generalizados a nivel mundial, con un impacto negativo en la obtención de productos agrícolas (11. Akpinar I, Unal M, Sar T. Potential antifungal effects of silver nanoparticles (AgNPs) of different sizes against phytopathogenic Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (FORL) strains. SN Applied Sciences. 2021;3:506. DOI: 10.1007/s42452-021-04524-5).
La papa (Solanum tuberosum L.) y el frijol común (Phaseolus vulgaris L.) son cultivos de gran importancia económica y resultan muy demandados por la población en todo el mundo. Las semillas suelen verse afectadas por diferentes especies de hongos fitopatógenos, llegando a comprometer la integridad fisiológica del cultivo: marchitez, amarillamiento, pudrición y muerte de las plantas (22. Martínez de la Parte E, Cantillo T, García D. Hongos asociados a semillas de Phaseolus vulgaris L. cultivadas en Cuba. Biot Veg. 2014;14(2):99–105.).
Para el control de estos agentes fitopatógenos en campo y almacenamiento, se aplican agroquímicos, pero su uso conlleva a la contaminación del medio ambiente, y también provoca daños a la salud humana y animal. Los avances en la nanotecnología, específicamente, en la síntesis de nanopartículas de plata (AgNPs) con propiedades antimicrobianas, proporcionan alternativas prometedoras que pudieran aplicarse en el control de microorganismos fitopatógenos (33. Esquivel-Figueredo RC, Mas-Diego SM. Síntesis biológica de nanopartículas de plata: revisión del uso potencial de la especie Trichoderma. Rev Cub Quím. 2021;33(2):23–45.).
La actividad antifúngica in vitro de AgNPs obtenidas por síntesis verde se notificó sobre Fusarium oxysporum Schlechtendahl emend. Snyder & Hansen. Esta se puede identificar por la inhibición del crecimiento del hongo fitopatógeno (44. Ahmad M, Ali A, Ullah Z, Sher H, Dai D-Q, Ali M, et al. Biosynthesized silver nanoparticles using Polygonatum geminiflorum efficiently controls fusarium wilt disease of tomato. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:988607. DOI: 10.3389/fbioe.2022.988607) y/o por la inhibición de la germinación de los conidios de agentes patógenos foliares y de suelo (55. Mishra S, Singh BR, Naqvi AH, Singh H. Potential of biosynthesized silver nanoparticles using Stenotrophomonas sp. BHU-S7 (MTCC 5978) for management of soil-borne and foliar phytopathogens. Sci Rep. 2017;7:45154. DOI: 10.1038/srep45154). En general, las AgNPs presentan una amplia actividad antimicrobiana; dañan la membrana celular, inhiben la síntesis de proteínas relacionadas con el ATP, generan estrés oxidativo y llegan a reducir la proliferación celular (66. Matras E, Gorczyca A, Wojciech S, Oćwieja M. Surface properties-dependent antifungal activity of silver nanoparticles. Sci Rep. 2022;12:18046. DOI: 10.1038/s41598-022-22659-2).
Recientemente, se informó la síntesis, caracterización y actividad antimicrobiana de AgNPs obtenidas de L. coccinea frente a la bacteria fitopatógena Xanthomonas phaseoli pv. phaseoli (Smith) Vauterin, con potencialidades como agente antimicrobiano para la protección de semillas (77. Travieso MC, Rubio OA, Alvarez PB, Corzo LM, Díaz PL, Acosta ME, et al. Biosynthesis of fluorescent silver nanoparticles from Leea coccinea leaves and their antibacterial potentialities against Xanthomonas phaseoli pv phaseoli. Bioresour Bioprocess. 2021;8(1):3. DOI: 10.1186/s40643-020-00354-2).
El presente trabajo tuvo como objetivo, determinar la actividad antifúngica de AgNPs obtenidas de L. coccinea L., sobre el crecimiento micelial de aislamientos de Fusarium spp. y Penicillium spp. asociados a semillas de frijol común (P. vulgaris L.) y papa (S. tuberosum L.), y la germinación de esporas de Fusarium spp.
MATERIALES Y MÉTODOS
⌅Los experimentos se llevaron a cabo en el laboratorio de Micología vegetal (LMV) del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), San José de las Lajas, provincia Mayabeque, Cuba. Se utilizaron para esta investigación cinco aislamientos de hongos fitopatógenos: Fusarium oxysporum, Penicillium spp. No. 1 y 2 de frijol y Fusarium spp. No. 1 y 2 de papa, provenientes del cepario del LMV.
Las AgNPs empleadas en el estudio fueron suministradas por el Laboratorio de Ecología Química (LEQ), las cuales se sintetizaron mediante la bio- reducción catiónica a partir de los extractos acuosos de hojas frescas de L. coccinea (tres lotes), como fuentes de compuestos reductores, y la solución de nitrato de plata (Merck), como la solución precursora del catión Ag+ (77. Travieso MC, Rubio OA, Alvarez PB, Corzo LM, Díaz PL, Acosta ME, et al. Biosynthesis of fluorescent silver nanoparticles from Leea coccinea leaves and their antibacterial potentialities against Xanthomonas phaseoli pv phaseoli. Bioresour Bioprocess. 2021;8(1):3. DOI: 10.1186/s40643-020-00354-2). Los estudios de caracterización se realizaron en el Centro de Estudios Avanzados de Cuba (CEA) mediante la Microscopía Electrónica de Barrido (siglas en inglés SEM), métodos espectroscópicos, como la espectrofotometría ultravioleta- visible y la espectroscopia Infrarrojo Transformada de Fourier (siglas en inglés FTIR), así como el método de Difusión de luz dinámica (siglas en ingles DLS) para la determinación del tamaño de partícula y el potencial Z. Las suspensiones coloidales en estudio contienen AgNPs de forma esférica y diámetros inferiores a 100 nm, con alto grado de aglomeración en el medio acuoso (aglomerados con tamaño de partícula menor de 200 nm y potencial Z menor de - 30 mV).
Actividad antifúngica de las AgNPs obtenidas de L. coccinea sobre el crecimiento micelial de aislamientos de Fusarium spp. y Penicillium spp.
⌅Para determinar la actividad antifúngica de las AgNPs de L. coccinea se utilizó el método de dilución en caldo para hongos filamentosos (M38-A), del Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (CLSI, en inglés) (88. Procop GW, Dufresne PJ, Berkow E, Cullen SK, Fuller J, Hanson KG, et al. CLSI. Performance Standards for Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi. 3rd ed. Clinical and Laboratory Standards Institute; 2022. (CLSI supplement M38M51S).). Se evaluaron tres lotes de concentraciones iniciales de 0,97 mg/ml, y se realizaron diluciones en el medio de cultivo Richard líquido para obtener siete concentraciones de AgNPs (0,485; 0,242; 0,121; 0,060; 0,030; 0,015 y 0,007 mg/ml). Para ello, se esterilizó el medio de cultivo Richard líquido [sacarosa (50g/l), KNO3 (10g/l), KH2PO4 (5g/l), MgSO4x7H2O (2,5g/l) y FeCl3 (0,02g/l) para 1L] a 121°C durante 15 min.
Se establecieron 12 tratamientos [1_ medio de cultivo, 2_ medio de cultivo + suspensión de hongos fitopatógenos independientemente, 3_ medio de cultivo + AgNPs (0,97 mg/ml), 4_ medio de cultivo + control de los tres lotes de AgNPs, 5_ AgNPs (0,97 mg/ml) + suspensión de hongos fitopatógenos, 6_ primera concentración (0,485 mg/ml) + suspensión de hongos fitopatógenos, 7_ segunda concentración (0,242 mg/ml) + suspensión de hongos fitopatógenos, 8_ tercera concentración (0,121 mg/ml) + suspensión de hongos fitopatógenos, 9_ cuarta concentración (0,060 mg/ml) + suspensión de hongos fitopatógenos, 10_ quinta concentración (0,030 mg/ml) + suspensión de hongos fitopatógenos, 11_ sexta concentración (0,015 mg/ml) + suspensión de hongos fitopatógenos y 12_ séptima concentración (0,007 mg/ml) + suspensión de hongos fitopatógenos]. A partir del sexto tratamiento se mezclaron las concentraciones de las AgNPs con las suspensiones de cada fitopatógeno separadamente, según el lote (No. 1, 2 y 3) de las AgNPs.
Los inóculos se prepararon, separadamente, a partir del cultivo de los aislamientos de Fusarium spp. y Penicillium spp. sembrados en tubos de ensayo con medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA, BIOCEN), y se incubaron a 28±1ºC y oscuridad constante, durante siete días. A los tubos de ensayo con los hongos desarrollados se les añadieron 15 ml de agua destilada estéril y se homogeneizaron en agitador Vortex. Las suspensiones obtenidas se ajustaron con la adición de agua destilada esterilizada hasta la concentración de 106 esporas ml-1, determinada en una cámara de Thomas para cada aislamiento.
Seguidamente, se distribuyó en cada tubo de ensayo 1 ml del medio de cultivo Richard líquido, con 1 ml de la suspensión de AgNPs de cada lote, separadamente, y la suspensión de esporas (106 esporas ml-1) de cada aislamiento, de manera independiente, según el tratamiento. Se homogeneizaron en un agitador Vortex durante 1 min, y se incubaron a 28±1ºC en una zaranda (130 rpm), durante 72 horas.
Transcurrido este tiempo, se determinó la Concentración Mínima Fungicida (CMF), se sembraron 20 μl de cada tratamiento en placas Petri con medio de cultivo PDA, y se incubaron a 28±1ºC y oscuridad constante, durante 72 horas. La CMF se determinó como el crecimiento o no de cada aislado sobre el medio de cultivo PDA.
Efecto de tres lotes de AgNPs (L. coccinea) sobre la germinación de esporas de aislamientos de Fusarium spp.
⌅Para evaluar la eficacia de los tres lotes de las AgNPs sobre la germinación de esporas de los aislamientos de F. oxysporum y Fusarium spp. No.1, se evaluaron cuatro concentraciones (0,485; 0,242; 0,121 y 0,060 mg/ml). Se esterilizó medio de cultivo Agar agua (20 g/l) a 121°C durante 15 min, y se vertió en placas Petri de 9 cm de diámetro. La suspensión de esporas de cada aislamiento se preparó a partir de tubos de ensayo contentivos con medio de cultivo PDA con los hongos desarrollados, incubados a 28±1ºC y oscuridad. A los tubos de ensayo se les añadieron 15 ml de agua destilada esterilizada, se homogeneizaron, y la suspensión se filtró en condiciones estériles. Seguidamente, a los tubos de ensayo de cada tratamiento, de forma independiente, se les añadió 0,5 ml de cada suspensión de AgNPs de L. coccinea y de la suspensión de esporas fúngicas (106 esporas ml-1), y se mezclaron en un agitador Vortex; se incubaron durante 24 h y oscuridad. En el tratamiento control, se mezcló la suspensión de esporas con agua destilada estéril. Transcurrido este tiempo, se sembraron 20 μl de cada tratamiento en placas Petri con medio de cultivo Agar agua, y se distribuyó con una espátula de Drigalsky. Se realizaron tres réplicas por cada tratamiento. Todos los tratamientos se incubaron a 28±1ºC y oscuridad constante, durante 24 h. Posteriormente, se realizó el conteo de las esporas germinadas (100) en un microscopio óptico Zeiss (400/630x).
Análisis estadístico
⌅Los datos obtenidos se procesaron mediante un análisis de varianza simple y las medias se compararon, según la Dócima de Rangos Múltiples de Duncan (p≤0,05), utilizando el paquete estadístico Infostat Profesional (99. Di Rienzo J, Balzarini M, González L, Tablada M, Guzmán W, Robledo C, et al. InfoStat Profesional versión 2.1. Argentina: Universidad Nacional de Córdoba; 2016.).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
⌅Actividad antifúngica de las AgNPs obtenidas de L. coccinea sobre el crecimiento micelial de aislamientos de Fusarium spp. y Penicillium spp.
⌅Las CMF ocasionadas por las suspensiones de los tres lotes de AgNPs de L. coccinea, presentaron diferencias entre los lotes y los aislados. Las suspensiones de las AgNPs inhibieron el crecimiento de los aislados de Fusarium spp. (Fig. 2), incluido el de F. oxysporum (Fig. 1), y el de los aislados de Penicillium spp. (Fig. 3) con las concentraciones 0,485- 0,242 mg/ml.
Los valores de CMF de los lotes No. 2 y 3 para el aislado de F. oxysporum coincidieron en 0,485 mg/ml; mientras que, en el lote No. 1 la CMF fue inferior a esta, con valor de 0,242 mg/ml (Fig. 1). El efecto inhibitorio de las AgNPs sobre el crecimiento micelial de los fitopatógenos se incrementó con las concentraciones.
De manera similar, Álvarez-Carvajal et al. (1010. Alvarez-Carvajal F, Gonzalez-Soto T, Armenta-Calderón AD, Méndez Ibarra R, Esquer-Miranda E, Juarez J, et al. Silver nanoparticles coated with chitosan against Fusarium oxysporum causing the tomato wilt. Biotecnia. 2020;XXII(3):73–80. DOI: 10.18633/biotecnia.v22i3.952) informaron el incremento del efecto antifúngico in vitro de las AgNPs sobre F. oxysporum, a medida que la concentración fue mayor de 1,5-2 mg/ml con un 70-74 % de inhibición del crecimiento del fitopatógeno, respectivamente.
Elamawi y Al-Harbi (1111. Elamawi RM, Al-Harbi RE. Effect of biosynthesized silver nanoparticles on Fusarium oxysporum fungus the cause of seed rot disease of faba bean, tomato and barley. J Plant Prot Path Mansoura Univ. 2014;1(12):991–1007. DOI: 10.21608/jppp.2014.87901), comunicaron que las nanopartículas de plata reducen la formación de la colonia de F. oxysporum, agente causal de la pudrición de las semillas del frijol faba (Vicia faba L.), tomate (S. lycopersicum) y cebada (Hordeum vulgare L.). Por su parte, Win et al. (1212. Win T, Khan S, Fu P. Fungus- (Alternaria sp.) Mediated Silver Nanoparticles Synthesis, Characterization, and Screening of Antifungal Activity against Some Phytopathogens. J Nanotechnol. 2020;2020:1–9. DOI: 10.1155/2020/8828878), informaron el fuerte efecto antifúngico de una suspensión de AgNPs frente a aislamientos de F. oxysporum, Fusarium moniliforme (Sacc.) Nirenberg, Fusarium tricinctum (Corda) Sacc. y Alternaria sp.
En los aislados de Fusarium spp. No. 1 y 2 provenientes de muestras de papa, los valores de las CMF para los lotes No. 1 y 3 coincidieron en 0,242 mg/ml. Esta CMF para el lote No.1 coincidió con la obtenida sobre F. oxysporum. En el lote No. 2, el valor de la CMF para el aislado de Fusarium spp. No. 1 fue superior (0,485 mg/ml) a la obtenida con el aislado de Fusarium spp. No. 2 con 0,242 mg/ml. (Fig. 2)
Resultados similares presentaron Elamawi et al. (1313. Elamawi RM, Al-Harbi RE, Hendi AA. Biosynthesis and characterization of silver nanoparticles using Trichoderma longibrachiatum and their effect on phytopathogenic fungi. Egypt J Biol Pest Control. 2018;28(1):28. DOI: 10.1186/s41938-018-0028-1), quienes notificaron la actividad antifúngica de las AgNPs frente a Fusarium verticillioides (Sacc.) Nirenberg y Fusarium moniliforme (Sacc.) Nirenberg. En este estudio, las nanopartículas se aplicaron a diferentes temperaturas (25, 28 y 33°C), y en tiempos de incubación (0-120 h), observándose la mayor inhibición a 28°C, durante 72 h.
En los aislados de Penicillium spp ., las AgNPs de los lotes No. 2 y 3 inhibieron el crecimiento con el valor de CMF de 0,242 mg/ml (Fig. 3). En el lote No.1, la CMF fue superior 0,485 mg/ml para los dos aislados de este género.
Los resultados en esta investigación tienen similitud con los notificados por Al-Zubaidi et al. (1414. Al-Zubaidi S, Al-Ayafi A, Abdelkader H. Biosynthesis, Characterization and Antifungal Activity of Silver Nanoparticles by Aspergillus niger Isolate. J Nanotechnol Res. 2019;1(1):023–36. DOI: 10.26502/jnr.2688-8521002), quienes informaron que al enfrentar AgNPs con aislamientos de F. oxysporum y Penicillium digitatum (Pers.) Sacc., se observó que las AgNPs inhibieron el crecimiento de los fitopatógenos.
Por su parte, Abdelmalek y Salaheldin (1515. Abdelmalek GAM, Salaheldin AT. Silver Nanoparticles as a Potent Fungicide for Citrus Phytopathogenic Fungi. J Nanomed Res. 2016;3(5):1–8. DOI: 10.15406/jnmr.2016.03.00065), notificaron la acción de tres concentraciones (0,05; 0,1 y 0,150 mg/ml) de las nanopartículas de plata (AgNPs) frente a tres aislamientos [Alternaria alternata (Fr.) Keissl., Alternaria citri Ellis & N. Pierce y Penicillium digitatum (Pers) Sacc.] de muestras de cítricos. El estudio reveló que la concentración 0,150 mg/ml de AgNPs mostró una fuerte actividad antifúngica sobre los fitopatógenos. Por su parte, Mansoor et al. (1616. Mansoor S, Zahoor I, Baba TR, Padder SA, Bhat ZA, Koul AM, et al. Fabrication of Silver Nanoparticles Against Fungal Pathogens. Nanotechnol. 2021;3:679358. DOI: 10.3389/fnano.2021.679358), anunciaron el efecto antifúngico de las AgNPs sobre el crecimiento de patógenos como: Aspergillus fumigatus Fresenius, Aspergillus niger P.E.L van Teghem, Aspergillus flavus Link, Trichophyton rubrum Malmsten, Candida albicans (C. P. Robin) Berkhout y Penicillium sp.
Efecto de tres lotes de AgNPs a partir de L. coccinea sobre la germinación de esporas de aislamientos de Fusarium spp.
⌅Las suspensiones de AgNPs de los tres lotes inhibieron la germinación de las esporas de los aislados de Fusarium spp. a las concentraciones 0,485 y 0,242 mg/ml. La formación de conidios del aislado de F. oxysporum se inhibió con la suspensión de AgNPs (C1-0,485 mg/ml) de los lotes No. 2 y 3, y la suspensión de AgNPs L1 (0,97 mg/ml), con diferencias significativas con el resto de las concentraciones, en comparación con el control (Fig. 4).
La suspensión de AgNPs perteneciente al lote No.1 ejerció un fuerte efecto antifúngico en la germinación de las esporas de F. oxysporum con las dos primeras concentraciones (C1-0,485 mg/ml y C2-0,242 mg/ml) y la suspensión de AgNPs L1 (0,97 mg/ml), con diferencias con las restantes concentraciones, en comparación con el control (Fig. 4).
Mishra et al. (55. Mishra S, Singh BR, Naqvi AH, Singh H. Potential of biosynthesized silver nanoparticles using Stenotrophomonas sp. BHU-S7 (MTCC 5978) for management of soil-borne and foliar phytopathogens. Sci Rep. 2017;7:45154. DOI: 10.1038/srep45154), notificaron la actividad antifúngica de diferentes concentraciones (2, 4, 10 μg/ml) de AgNPs frente a patógenos foliares y del suelo. El estudio reveló el efecto inhibidor de las AgNPs sobre la germinación de los conidios en condiciones in vitro.
La germinación de esporas del aislado de Fusarium spp. No. 1, se inhibió con la suspensión de AgNPs L1 y L3 (0,97 mg/ml) y las dos primeras concentraciones (C1-0,485 y C2-0,242 mg/ml) de las soluciones de los lotes No. 1 y 3, con diferencias con las restantes, en comparación con el control (Fig. 5). En las suspensiones pertenecientes al lote No. 2, la primera concentración (C1-0,485 mg/ml) y la suspensión de AgNPs L2 (0,97 mg/ml) impidieron la germinación del fitopatógeno, con diferencias con el resto de las concentraciones. (Fig. 5)
Numerosos estudios correlacionan las propiedades físicas y químicas (tamaño de partícula, forma, estructura, pH, carga superficial, entre otras), con la actividad antimicrobiana de las AgNPs (1717. Ali MA, Ahmed T, Wu W, Hossain A, Hafeez R, Masum MI, et al. Advancements in Plant and Microbe-Based Synthesis of Metallic Nanoparticles and Their Antimicrobial Activity against Plant Pathogens. Nanomater. 2020;10:1146. DOI: 10.3390/nano10061146), demostrándose la influencia de estas propiedades en el efecto sobre las células microbianas.
Las nanopartículas de plata pueden ocasionar modificaciones en la estructura de las hifas, deformaciones de la pared celular, desintegración de la membrana, alteraciones significativas en la forma y germinación de las esporas y ruptura del equilibrio osmótico (1818. Kumari M, Giri VP, Pandey S, Kumar M, Katiyar R, Nautiyal CS, et al. An insight into the mechanism of antifungal activity of biogenic nanoparticles than their chemical counterparts. Pestic Biochem Physiol. 2019;157:45–52. DOI: 10.1016/j.pestbp.2019.03.005).
La CMF (0,242 mg/ml) de la suspensión de AgNPs sintetizadas a partir del extracto acuoso de hojas frescas de L. coccinea provocó la inhibición antifúngica de los hongos fitopatógenos en un 66,7 %. Las concentraciones 0,485 y 0,242 mg/ml afectaron la germinación de esporas de los aislamientos de F. oxysporum (frijol común) y Fusarium spp. No. 1 (papa). Se confirmó que a mayor concentración de las AgNPs de L. coccinea, mayor fue el efecto antifúngico sobre el crecimiento micelial y germinación de las esporas de los fitopatógenos estudiados, lo que denota la potencia de este producto como alternativa en el enfrentamiento contra hongos fitopatógenos.