INTRODUCCIÓN
⌅La quinua (Chenopodium quinoa Willd.) es un pseudocereal tradicionalmente cultivado por las culturas andinas, cuya producción y consumo crece a nivel mundial (11. Basantes F, Aragón JP, Albuja M. Cultivos andinos de importancia agroproductiva y commercial en la zona 1 del Ecuador. Editorial Universidad Técnica del Norte, Ibarra-Ecuador. 2022; 192pp.). Se define como "uno de los granos del siglo XXI" por su resistencia a condiciones ambientales extremas y sus propiedades nutricionales y funcionales. Tiene un alto contenido en proteínas, lípidos, fibra, vitaminas, minerales y un excelente equilibrio de aminoácidos esenciales (22. Hernández-Ledesma B. Quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) as a source of nutrients and bioactive compounds: a review. Bioactive Compounds in Health and Disease. 2019; 2 (3): 2747.). La planta se cultiva, principalmente, en los países ubicados en la cordillera de los Andes: desde el sur de Colombia hasta Ecuador, Perú, Bolivia y la parte del norte de Chile (33. Chaudhary N, Walia S, Kumar R. Functional composition, physiological effect and agronomy of future food quinoa (Chenopodium quinoa Willd.): A review. Journal of Food Composition and Analysis. 2023; 118. https://doi.org/10.1016/j.jfca.2023.105192 ). Uno de los factores que limita la producción de quinua son las enfermedades ocasionadas por varios géneros de hongos fitopatógenos (44. Plata G, Gandarillas A. Enfermedades más importantes que afectan al cultivo de la quinua en Bolivia. Revista de Agricultura. 2014; 54:19-28.). Dentro de los métodos de control empleados para atenuar sus efectos negativos, se encuentra el uso de plaguicidas sintéticos; sin embargo, en la actualidad se buscan alternativas de plaguicidas de origen natural que aporten a la producción agrícola y disminuyan el impacto negativo de los plaguicidas convencionales (55. Casas MM, Cristancho JA. Determinación de la actividad plaguicida de las saponinas presentes en la cáscara de las semillas de la especie vegetal quinua (Chenopodium quinoa) para aplicación en cultivos de fresa (Fragaria albión). Tesis de Tecnología en Química Industrial. Bogotá, Colombia. 2022; 56 pp.). Una opción para enfrentar esta problemática es el uso de semillas de quinua, las cuales contienen diversos metabolitos secundarios (saponinas, fitoesteroles, fitocisteroides, compuestos fenólicos, polisacáridos y proteínas y péptidos bioactivos), con importantes actividades biológicas (66. El Hazzam K, Hafsa J, Sobeh M, Mhada M, Taourirte M, Kacimi KEL, et al. An insight into saponins from Quinoa (Chenopodium quinoa Willd): A review. Molecules. 2020; 25 (5): 1-22.). Dentro de ellos, las saponinas representan un potencial biofungicida sobre microorganismos que afectan diferentes cultivos de interés agrícola (77. Singh B, Kaur A: Control of insect pests in crop plants and stored food grains using plant saponins: a review. Food Science and Technology. 2018; 87: 93-101.).
En este sentido, los primeros estudios de la capacidad inhibitoria de las saponinas de quinoa se informaron sobre el crecimiento de Candida albicans (C.P. Robin); Berkhout (88. Villacrés E, Quelal M, Galarza S, Iza D, Silva E. Nutritional value and bioactive compounds of leaves and grains from quinoa (Chenopodium quinoa Willd). Plants. 2022; 11 (2): 1-11. ) y Botrytis cinerea Pers. (99. Stuardo M, San Martin R. Antifungal properties of quinoa (Chenopodium quinoa Willd) alkali treated saponins against Botrytis cinerea. Industrial Crops and Products. 2008; 27: 296-302., 1010. Apaza R, Smeltekop H, Flores Y, Almanza G, Salcedo L. Efecto de saponinas de Chenopodium quinoa Willd contra el fitopatógeno Cercospora beticola Sacc. Rev. Protección Veg 2016; 31(1): 63-69.). Este último autor, también declaró en sus estudios la inhibición en la germinación de los conidios de estos hongos.
En la actualidad la búsqueda de alternativas amigables con el ambiente y la salud del hombre siguen estando en la atención de los investigadores a nivel global. De ahí, que el objetivo de este trabajo fue determinar la actividad antifúngica in vitro de Chenopodium quinoa Willd. frente a cinco hongos fitopatógenos de importancia agrícola.
MATERIALES Y MÉTODOS
⌅La investigación se desarrolló en el laboratorio de Agromikroben, ubicado vía al cantón Chambo, provincia de Chimborazo, Ecuador.
Obtención del extracto de saponinas
⌅Los extractos de saponinas se obtuvieron a partir de los residuos del proceso industrial de los granos de quinua, mediante el método de Soxhlet (1111. Dean J. Extraction Techniques in Analytical Sciences. [S.L.]: John Wiley & Sons, 2010; 167 pp. ). Para la preparación del extracto madre se utilizó una proporción de material vegetal: agua (3:1) y a partir de esta se prepararon las restantes concentraciones. La determinación de las concentraciones (Tabla 1) se realizó por el método espectrofotométrico UV-VIS, según la metodología descrita por Monje y Raffaillac (1212. Monje CY, Raffaillac JP. Determinación de saponina total en quinua (Chenopodium quinoa Willd) método Espectrofotométrico. Memoria IV Congreso Nacional de la Asociación Boliviana de Protección Vegetal. Oruro, 5 al 7 de abril de 2006. C.E.A.C. -Dpto.Fitotecnia-FCAPV UTO. ABPV. Oruro, Bolivia, 2006; pp. 217-218) y Gianna (1313. Gianna V. Extracción, cuantificación y purificación de saponinas de semillas de Chenopodium quinoa Willd provenientes del noroeste argentino. [Tesis Doctoral]. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, 2013; 116 pp. Argentina.).
| Concentración del extracto acuoso (%) | Absorbancia UV/VIS λ=528 nm | Absorbancia | Concentración de saponinas (mg ml-1) |
|---|---|---|---|
| 100 | 4,495 | 2,806 | 0,610 |
| 87,5 | 4,464 | 2,775 | 0,603 |
| 75 | 4,432 | 2,743 | 0,596 |
| 50 | 3,840 | 2,151 | 0,467 |
| 37,5 | 2,578 | 0,889 | 0,191 |
Los hongos fitopatógenos utilizados fueron CCECL- Fusarium sp. 01, CCECL- Pythium sp. 01, CCECL- Rhizoctonia sp. 01, CCECL- Alternaria sp. 01, CCECL- Botrytis sp. 01, pertenecientes a la colección de cultivos microbianos de la Escuela Superior Politécnica del Chimborazo (Espoch), Ecuador.
Actividad antifúngica de los extractos de las saponinas sobre los fitopatógenos
⌅La evaluación de la actividad antifúngica se desarrolló por el método de envenenamiento, descrito por Marcano et al. (1414. StatSoft, Inc. STATISTICA (data analysis software system), version 12. 2014, www.statsoft.com.). Se probaron 50 ml de extractos acuosos de saponinas a las concentraciones de 100; 87,5; 75; 50 y 37,5 %, frente a cinco cepas de hongos patógenos. Antes del ensayo, las condiciones de conservación de los hongos pertenecientes a la colección de cultivos microbianos de la Escuela Superior Politécnica del Chimborazo fueron las siguientes:
Los hongos fitopatógenos Fusarium sp., Pythium sp., Rhizoctonia sp., Alternaria sp. Botrytis sp., se cultivaron en placas Petri (90 mm = Ø) que contenían medio Papa-Dextrosa-Agar (PDA) (Difco) e incubados todos a una temperatura de 25±2°C, y bajo régimen de oscuridad constante por cinco días.
Para el desarrollo del experimento se tomaron discos de cinco mm de (Ø) de la periferia de las colonias de las cepas de los hongos.
El montaje del ensayo se realizó en placas Petri (100 x 20 mm = Ø), que contenían medio de cultivo PDA (Difco) (Tabla 2). Una vez estéril el medio y verificado el pH a 5,5, se dejó enfriar hasta 50ºC y se le adicionaron los extractos a las concentraciones descritas anteriormente, y para homogenizar los medios se agitaron manualmente. Posteriormente, se sembraron discos (cinco mm de Ø) del borde de la periferia de las colonias de los fitopatógenos en las placas Petri, centralmente y de forma individual. Seguidamente, las placas se incubaron a 28±1°C y en régimen de oscuridad. Se prepararon por cada hongo cinco réplicas y se incluyó un control de cada agente fitopatógeno, sembrados e incubados en igual posición. El crecimiento de los hongos se midió con una regla graduada, a partir de las 24 h y hasta las 216 horas.
El Porcentaje de Inhibición del Crecimiento Radial del patógeno (PICR) se calculó, según la fórmula de Apaza et al. (1010. Apaza R, Smeltekop H, Flores Y, Almanza G, Salcedo L. Efecto de saponinas de Chenopodium quinoa Willd contra el fitopatógeno Cercospora beticola Sacc. Rev. Protección Veg 2016; 31(1): 63-69.):
D1: Crecimiento radial del hongo patógeno en el tratamiento control.
D 2: Crecimiento radial del hongo patógeno en el medio envenenado.
| Concentración (%) | Agua destilada (ml) | Extracto (ml) | Volumen total (ml) |
|---|---|---|---|
| 100 | 0 | 50 | 50 |
| 87,5 | 6,25 | 43,75 | 50 |
| 75 | 12,5 | 37,5 | 50 |
| 50 | 25 | 25 | 50 |
| 37,5 | 31,25 | 18,75 | 50 |
| Control | 50 | 0 | 50 |
Los experimentos se repitieron dos veces, y se montaron bajo un diseño completamente aleatorizado.
Los datos correspondientes al porcentaje de inhibición del crecimiento radial de los hongos producto del efecto de los extractos se sometieron a la prueba de Kruskal-Wallis y comparación múltiple de medias no paramétrica. Se utilizó el paquete estadístico STATISTICA versión 12.0 sobre Windows (1414. StatSoft, Inc. STATISTICA (data analysis software system), version 12. 2014, www.statsoft.com.).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
⌅Se produjo inhibición del crecimiento micelial de los hongos fitopatógenos a todas las concentraciones de saponinas ensayadas. Los extractos acuosos de saponinas a las concentraciones de 100 % (0,610 mg ml-1) y 87,5 % (0,603 mg ml-1) fueron las que produjeron las mayores inhibiciones del crecimiento micelial de los hongos patógenos Fusarium sp. y Alternaria sp., respectivamente, con diferencias significativas respecto a las demás concentraciones. En el caso de Botrytis sp., la mayor inhibición del crecimiento del hongo se alcanzó a la concentración de 50 % (0,467 mg ml-1), la cual mostró diferencias significativas en relación al resto de las concentraciones. Los hongos fitopatógenos Rhizoctonia sp. y Pythium sp. tuvieron los valores más altos de inhibición de su crecimiento al exponerlos a las concentraciones de saponinas extremas de 100 % (0,610 mg ml-1) y 37,5 % (0,191 mg ml-1), a diferencia de las demás concentraciones (Tabla 3 y Fig. 1).
| Concentración de saponina (%) | Inhibición del crecimiento micelial (%) | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Fusarium sp. | Rhizoctonia sp. | Pythium sp. | Alternaria sp. | Botrytis sp. | |
| 100 | 26,42 a | 8,14 b | 13,24 a | 89,5 a | 1,82 d |
| 87,5 | 19,37 b | 3,26 c | 3,68 c | 87,3 ab | 13,33 b |
| 75 | 17,61 b | 3,72 c | 6,86 b | 85,1 b | 3,64 c |
| 50 | 7,24 d | 8,60 b | 1,72 d | 78,2 c | 28,48 a |
| 37,5 | 12,72 c | 10,47 a | 12,01 a | 66,3 d | 3,64 c |
Medianas con letras distintas en el sentido de las columnas difieren significativamente según la prueba de Kruskal-Wallis H (7, N= 5) =30,96502 p =0,0001, y comparación múltiple de medias no paramétrica (p ( 0,008)
Los porcentajes de inhibición del crecimiento micelial de los agentes fitopatógenos obtenidos en este trabajo son similares a los informados por Apaza et al. (1010. Apaza R, Smeltekop H, Flores Y, Almanza G, Salcedo L. Efecto de saponinas de Chenopodium quinoa Willd contra el fitopatógeno Cercospora beticola Sacc. Rev. Protección Veg 2016; 31(1): 63-69.), quienes obtuvieron una inhibición del 75 % del crecimiento micelial de C. beticola; con extractos de saponinas quinua. Los autores antes mencionados atribuyen el efecto de las saponinas a su capacidad de formar complejos con esteroles, proteínas y fosfolípidos de membranas, como el principal mecanismo de actividad antifúngica.
Esa teoría se corresponde con lo planteado por Woldemichael y Wink (88. Villacrés E, Quelal M, Galarza S, Iza D, Silva E. Nutritional value and bioactive compounds of leaves and grains from quinoa (Chenopodium quinoa Willd). Plants. 2022; 11 (2): 1-11. ), quienes mostraron inhibición del crecimiento de C. albicans, aplicando un extracto crudo de saponina de C. quinoa a la concentración de 50 µg ml-1. Estos autores evaluaron la actividad biológica sobre la bacteria y atribuyeron su efecto a las interacciones sinérgicas, que se producen entre los múltiples componentes del extracto.
McCartney et al. (1515. McCartney NB, Ahumada MI, Muñoz MP, Rosales IM, Fierro AM y Chorbadjian RA. Effects of saponin-rich quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) bran and bran extract in diets of adapted and non-adapted quinoa pests in laboratory bioassays. Ciencia e Investigación Agraria 2019; 46 (2): 125-136.) obtuvieron también actividad biológica del extracto de salvado (mojuelo) de la quinua, con lo cual evidenciaron una inhibición del crecimiento de un
50 %, aproximadamente, de los hongos Alternaria arborescens E.G. Simmons, B. cinerea, Phytophthora cinnamomi Rands. Mientras, el crecimiento de Fusarium oxysporum f. sp. cepae (Hanzawa) W.C. Snyder & H.N. Hansen, Pestalotiopsis clavispora (G.F. Atk.) Steyaert, Penicillium digitatum (Pers.) Sacc., Geotrichum sp, y el patógeno de la quinoa Phoma sp., tuvo una menor afectación.
Por su parte, San Martin et al. (1616. San Martin R, Ndjoko K, Hostettmann K. Novel molluscicide against Pomacea caniculata based on quinoa (Chenopodium quinoa) saponins. Crop Protection. 2008; 27: 310-317.) evaluaron la eficacia del molusquicida de las saponinas contra Pomacea caniculata Perry en condiciones de campo, en el cultivo del arroz, en España. Estos autores descubrieron que, a la concentración de 20 mg ml-1 , se obtienen los mejores resultados con un porcentaje del 96,7 % de caracoles muertos; sin embargo, en un segundo ensayo realizado a las concentraciones de 7 y 10 mg ml-1, obtuvieron el 100 % de caracoles muertos después de 72 horas. Los resultados mostraron la actividad antifúngica de los extractos acuosos de saponinas provenientes de C. quinoa sobre los hongos fitopatógenos Fusarium sp., Rhizoctonia sp., Pythium sp., Alternaria sp. y Botrytis sp. La elevada actividad antifúngica de los extractos acuosos podría deberse a compuestos químicos presentes. En este sentido, en nuestro trabajo no se identificaron pero, en estudios previos Stuardo (99. Stuardo M, San Martin R. Antifungal properties of quinoa (Chenopodium quinoa Willd) alkali treated saponins against Botrytis cinerea. Industrial Crops and Products. 2008; 27: 296-302.) declara la existencia de dos tipos de saponinas de quinua: las saponinas monodesmosídicas y las bidesmosídicas. Normalmente, tienen mayor actividad fungicida las monodesmosídicas, por lo que también sería recomendable realizar pruebas a partir de extractos con mayor proporción de saponinas monodesmosídicas.
El presente trabajo demuestra la actividad antifúngica in vitro que ejercieron los extractos acuosos de saponinas provenientes de quinua sobre el crecimiento micelial de cinco géneros de hongos fitopatógenos, causantes de enfermedades de importancia económica en la agricultura.