Efecto del biocarbón enriquecido con Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt &Nirenberg sobre el desarrollo de Solanum lycopersicum (L.) y parasitismo por Meloidogyne incognita (Kofoid y White) Chitwood

Efecto de diferentes biocarbones y T. asperellum cepa Ta.13 en el desarrollo de plántulas de tomate

En este ensayo, se evaluaron cinco biocarbones procedentes de diferentes biomasas, cuyo tratamiento fue diferente. (Tabla 1)

La cepa de T. asperellum Ta.13, proveniente del Laboratorio de Micología Vegetal (LMV) del CENSA, se sembró previamente en placas Petri de 9 cm de diámetro (Ø) contentivas de Agar Malta (AM) (BioCen) e incubadas a una temperatura de 28°C±2°C y régimen de oscuridad constante. Los sustratos, en los tratamientos donde se combinaron con el hongo control biológico, se mezclaron al momento de la siembra con una suspensión conidial de la cepa (previamente ajustada a una concentración de 10⁷ conidios.ml^-1) a razón de 5 ml por alveolo.

Para la siembra se utilizaron semillas de S. lycopersicum (cv. Elbita) donadas por el Instituto de Investigaciones Hortícolas Liliana Dimitrova, y con 100 % de viabilidad. Se realizaron cinco réplicas para cada tratamiento y los controles de cada biocarbón (sin inocular con Trichoderma y un control absoluto: suelo ferralítico). Los tratamientos se distribuyen al azar en las bandejas.

Transcurridos 30 días después de la germinación, se extrajeron cinco plantas al azar por cada tratamiento y se les midieron los siguientes indicadores: altura de la planta (cm), diámetro del tallo (cm), número de hojas, longitud de las raíces (cm), masa fresca foliar y radicular (g). Para medir longitudes, se utilizó una regla graduada en mm. Para el diámetro de los tallos, a nivel del cuello de la raíz, se usó como instrumento un pie de rey. Para determinar la masa fresca de plantas, hojas y raíces, se utilizó una balanza técnica, calibrada y certificada por calidad, marca KERN® (e=0,01g). Los resultados de la evaluación de los parámetros fisiológicos de las plantas, se compararon a través de un Análisis de Varianza, y las medias se compararon mediante la Prueba LSD Fisher (p≤0,05) usando el programa InfoStat versión 2017 (1212. Di Rienzo JA, Casanoves F, Balzarini MG, González L, Tablada M, Robledo CW. InfoStat [computer program]. Córdoba, Argentina: Universidad Nacional de Córdoba; 2017. Available from: http://www.infostat.com.ar.).

Efecto del biocarbón seleccionado y T. asperellum cepa Ta.13 sobre el desarrollo del tomate y el parasitismo de M. incognita

En este estudio, desarrollado también en condiciones semicontroladas, se prepararon macetas que contenían cinco kg de sustrato estéril (suelo: estiércol vacuno 1:1 p/p) previamente esterilizados, como se describió anteriormente. Las mismas, se inocularon previamente con una suspensión de 500 juveniles de segundo estadio (J₂) de una población pura de M. incognita, obtenida siguiendo la metodología de Hussey y Barker (1313. Hussey RS, Barker KB. A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp. including a new technique. Plant Dis Report. 1973;57:1025-1028.). Posteriormente, se les adicionó 50 ml de una suspensión conidial de la cepa Ta.13 previamente ajustada a 10⁷ conidos.ml^-1. Por último, se seleccionaron, al azar, cinco plántulas de 30 días, provenientes de la variante de biocarbón y Ta. 13, que dio mejores resultados en el ensayo anterior, y se trasplantaron a las macetas. Se incluyeron, además, los controles correspondientes a suelo ferralítico con materia orgánica, suelo ferralítico con carboncillo, y se añadió un suelo ferralítico con nematodo). Por cada tratamiento, se establecieron cinco macetas (réplicas) las cuales se distribuyeron de manera aleatoria.

Transcurridos 60 días, se extrajeron las plantas y se evaluaron los parámetros descritos en el primer ensayo, determinando, además, número de flores, frutos por planta e índice de agallamiento, usando la escala cuantitativa de Taylor y Sasser (1414. Taylor AL, Sasser JB. Biology, identification and control of root-knot nematodes (Meloidogyne species). International Nematology Project, Department of Plant Pathology N. C. State Univ, Raleigh, United States. 1978.111 p. Available from: https://pdf.usaid.gov/pdf_docs/pnaak809.pdf.). Los resultados de la evaluación de los parámetros fisiológicos de las plantas en cada tratamiento, se compararon a través de un Análisis de Varianza y las medias se compararon mediante la Prueba LSD Fisher (p≤0,05) usando el programa InfoStat, versión 2017 (1212. Di Rienzo JA, Casanoves F, Balzarini MG, González L, Tablada M, Robledo CW. InfoStat [computer program]. Córdoba, Argentina: Universidad Nacional de Córdoba; 2017. Available from: http://www.infostat.com.ar.).

Al finalizar cada experimento, se evaluó en suelo y raíces la colonización de la cepa Ta.13 de T. asperellum, mediante el método de dilución seriada y siembra en Papa Dextrosa Agar (PDA, BioCen).

Para determinar la presencia de Trichoderma en suelo, se tomaron muestras de 10 g de suelo de cada réplica por tratamiento, hasta una profundidad de 15 cm, que se homogeneizaron y tamizaron. Después, se pesó un g de suelo de cada muestra, usando una balanza técnica, marca Sartorius® (precisión de 0,1 mg) el cual se suspendió en 10 ml de agua destilada estéril. A partir de esta suspensión, se realizaron diluciones seriadas (hasta 10^-3) incluyendo los controles. De las dos últimas diluciones, se tomaron 10 µl que se depositaron en placas Petri de 90 mm de (Ø) con medio PDA (BioCen) (con antibiótico-cloranfenicol 0,1 g.L^-1) y se distribuyeron, de manera uniforme, por toda la superficie de la placa con ayuda de una espátula de Drigalsky, previamente flameada. Se realizaron tres réplicas por muestra e incubaron bajo oscuridad constante a 28°C±2°C, óptima para el crecimiento de Trichoderma. Las evaluaciones se realizaron a las 72 h, momento en el cual se cuantificaron las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) del hongo en el suelo y tomaron imágenes, como evidencia gráfica con una cámara digital marca Canon®. Los datos se transformaron por Log₁₀ (x+1).

Para evaluar la capacidad endofítica de Ta.13, las muestras de raíces (tratamientos y controles) se lavaron cuidadosamente con abundante agua potable y secaron con papel de filtro Whatman No. 4. A continuación, se desinfectaron con hipoclorito de sodio (1 %) y alcohol (70 %) durante 30 s, entre cada desinfección y al final; las muestras se lavaron con tres cambios de agua destilada estéril durante tres minutos cada una. Después, las raíces se secaron (papel adsorbente estéril) se cortaron en fragmentos de 1 cm y se homogeneizaron. Por último, se seleccionaron 10 segmentos al azar y sembraron en placas Petri (Ø = 90 mm) que contenían PDA (BioCen) (con antibiótico-cloranfenicol 0,1 g.L^-1) e incubaron en condiciones similares a las descritas anteriormente. Las determinaciones se realizaron por triplicado (tratamientos y controles). Las evaluaciones se realizaron cada 24 horas, hasta la aparición de las estructuras fúngicas del hongo. El endofitismo se determinó visualmente sobre la base de raíces con crecimiento del antagonista entre el total de fragmentos sembrados. Se tomó evidencia gráfica de la colonización endófita, con una cámara digital marca Canon®. Los datos en porcentaje se transformaron por arcosen $\sqrt{x}$ .

Los datos obtenidos en los ensayos de colonización de suelo y endofitismo en raíces de tomate, se procesaron a través de un Análisis de Varianza (ANOVA) y las medias transformadas se compararon por LSD Fisher con un nivel de significación p≤0,05, mediante el paquete estadístico InfoStat Profesional versión 2017 (1212. Di Rienzo JA, Casanoves F, Balzarini MG, González L, Tablada M, Robledo CW. InfoStat [computer program]. Córdoba, Argentina: Universidad Nacional de Córdoba; 2017. Available from: http://www.infostat.com.ar.).

Efecto de diferentes biocarbones y T. asperellum cepa Ta 13 en el desarrollo de plántulas de tomate

Al comparar las plantas que crecieron donde no se aplicó T. asperellum (biocarbones controles) con las desarrolladas en los sustratos que tenían biocarbón + T. asperellum, se observaron diferencias significativas en los indicadores relacionados con el desarrollo de las plántulas, excepto en el diámetro del tallo, donde los valores fueron semejantes. (Tabla 2)

Las plantas con mayor altura fueron las de la variante cuyo sustrato tenía carboncillo, marcándose diferencias significativas respecto al resto de los tratamientos. No obstante, los tratamientos de carboncillo de mango y Leucaena, así como el de arroz con Trichoderma, también, mostraron valores elevados para este parámetro, similares entre sí y diferentes, estadísticamente, del resto.

La longitud de la raíz se benefició en las variantes que tenían mango en sus sustratos, tanto solo, como mezclado con Trichoderma. Por su parte, el diámetro del tallo fue mayor en el control absoluto sin diferencias significativas con el sustrato que contenía mango solamente y también, mezclado con Trichoderma, así como en la variante de coco combinado con Trichoderma. El mayor número de hojas, se produjo en las plantas no tratadas (control absoluto) sin diferir, estadísticamente, con las crecidas en los sustratos de carboncillo de arroz mezclado con Trichoderma. Con relación a la masa fresca aérea y radicular, los mejores valores se obtuvieron en los tratamientos control absoluto y el biocarbon de arroz, combinado con T. asperellum, sin diferencias estadísticas entre ellos. (Tabla 2)

De forma general, el carboncillo obtenido de paja de arroz ofrece los mejores resultados para la obtención de posturas de tomate con mejor calidad. Rodríguez et al. (1515. Rodríguez MG, González E, Linares Jl, Quiñonez C, González JA, Hernández D, et al. Experiencias del uso de biocarbón enriquecido con abonos orgánicos en cooperativa urbana. Agroenergía y Economía circular/Convención AGROPAT. 2022; p. 1837-1843. Available from: https://www.researchgate.net/publication/366231267_Experiencias_del_uso_de_biocarbon_enriquecido_con_abonos_organicos_en_cooperativa_urbana/related ) encontraron que la aplicación de carboncillo de arroz favoreció el desarrollo de la lechuga (Lactuca sativa L.) en la fase de plántula y la producción de tomate en casa de cultivo. Xiang et al. (1616. Xiang Y, Deng Q, Duan H, Guo Y. Effects of biochar application on root traits: a meta-analysis. GCB Bioenergy. 2017;9:1563-1572. DOI: 10.1111/gcbb.12449 ) a través de un meta-análisis a partir de resultados de 136 artículos científicos, donde se evaluaron las respuestas de las características de la raíz, asociadas con 13 variables bajo condiciones de aplicación de biochar, constataron que la aplicación al suelo de biochar benefició el desarrollo morfológico de la raíz; lo cual reduce las deficiencias en la absorción de nutrientes y agua por parte de la planta. Otras investigaciones, demostraron la gran importancia del biochar enriquecido con fertilizantes, compost y productos biológicos, para lograr la productividad de los cultivos y activar el sistema defensivo de las plantas frente a las plagas (1717. González Marquetti I, Rodríguez MG, Peteira B, Schmidt HP. Biochar y su contribución a la nutrición, crecimiento y defensa de las plantas. Rev. Protección Veg. 2020;35(2):1-17.).

Entre los agentes de control biológico más estudiados y evaluados con efectos antagónicos de amplio espectro, se encuentra Trichoderma spp. Estos son conocidos por su elevada capacidad reproductiva, plasticidad ecológica (sobrevive en diferentes pH y temperaturas) y por actuar a través de mecanismos directos e indirectos, que proporcionan a la planta mejor adaptabilidad en el medio y resistencia a diferentes patógenos (1818. González-Marquetti I, Ynfante-Martínez D, Arias-Vargas Y, Gorrita-Ramírez S, Hernández-García T, de la Noval-Pons BM, et al. Efecto de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg sobre indicadores de crecimiento y desarrollo de Phaseolus vulgaris L. cultivar BAT-304. Rev. Protección Veg. 2019;34(2):1-10.). La aplicación de Trichoderma, en etapas tempranas del crecimiento del cultivo, permite maximizar sus beneficios en términos de desarrollo de la raíz y la absorción de nutrientes. Hermosa et al. (1919. Hermosa R, Rubio MB, Cardoza RE, Nicolás C, Monte E, Gutiérrez S. The contribution of Trichoderma to balancing the costs of plant growth and defense. Int. Microbiol. 2013;16(2):69-80. DOI: 10.2436/20.1501.01.181.) declararon que la proteína QID74 de la pared celular de Trichoderma harzianum Rifai, rica en cisteína, se involucró en la modificación de la arquitectura de la raíz, al aumentar la superficie de absorción total, facilitar la absorción y la translocación de nutrientes en los brotes, lo que resulta en un incremento de la biomasa de las plantas a través de un uso eficiente de nitrógeno, fósforo, potasio y micronutrientes.

Existe escasa información relacionada con el uso de biochar combinado con agentes de control biológico microbianos. Sin embargo, Muter et al. (2020. Muter O, Grantina-Levina L, Makarenkova G, Vecstaudza D, Strikauska S, Selga T, et al. Effect of biochar and Trichoderma application on fungal diversity and growth of Zea mays in a sandy loam soil. Environmental and Experimental Biology. 2017;15:289-296. DOI: 10.22364/eeb.15.30 ) encontraron un incremento significatico en la germinacion de las semillas y el crecimiento del maiz (Zea mays L.).

En todos los tratamientos, 30 días posteriores a la germinación, se evidenció la colonización del sustrato por parte de T. asperellum cepa Ta.13, indicativo de que los biocarbones no interfirieron en el establecimiento del hongo en el sustrato. (Fig. 1). Trichoderma es un hongo metabólicamente versátil, capaz de utilizar una amplia gama de sustratos (como fuentes de carbono y nitrógeno) debido a la gran producción de enzimas extracelulares que degradan polímeros como celulosa, quitina, laminarina, pectina, almidón y xilano (2121. Villegas MA. Trichoderma Pers. Características Generales y su potencial biológico en La Agricultura Sostenible. 2005. Available from: http://www.oriusbiotecnologia.com. Accessed: 5/06/23.) características que pudieran permitirle una colonización rápida y, en ocasiones, agresiva de diferentes sustratos e incluso, de otros hongos. El 100 % de los fragmentos de raíces sembrados, pertenecientes a los diferentes tratamientos, también mostró crecimiento del hongo.

Efecto del carboncillo y T. asperellum cepa Ta.13 sobre el desarrollo del tomate y el parasitismo de M. incognita

Las plantas transplantadas de los cepellones donde se aplicó carboncillo de arroz + T. asperellum cepa-13, y crecidas en las macetas inoculadas previamente con T. asperellum cepa T.a13 y nematodos, mostraron los mejores valores en todos los parámetros evaluados, con diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos, excepto, en las variables longitud de raíces y número de frutos, las cuales no difieren con los valores mostrados en las plantas crecidas solo con carboncillo de arroz. (Tabla 3)

Muchos estudios realizados con Trichoderma spp. se enfocan específicamente, en su potencial biológico sobre fitopatógenos del suelo y foliares, no obstante, algunas investigaciones señalan que estas también son capaces de producir metabolitos que favorecen el crecimiento vegetal, aspectos que justifican los resultados mostrados durante el ensayo. Zhao et al. (2222. Zhao L, Zhang Y-q. Effects of phosphate solubilization and phytohormone production of Trichoderma asperellum Q1 on promoting cucumber growth under salt stress. J. of Integrative Agriculture. 2015;14(8):1588-1597. DOI: 10.1016/S2095-3119(14)60966-7 ) sugieren que Trichoderma puede estimular la producción de hormonas que incrementan el crecimiento vegetal y desarrollo de las plantas, en especial de su sistema radicular, debido a la liberación de fitohormonas (ácido indol acético, etileno, citoquininas y giberelinas) producción de metabolitos y la activación de la enzima H+-ATPasa de la membrana plasmática (PM) ambas involucradas en el desarrollo del crecimiento celular, el alargamiento de la planta y el desarrollo radicular, y con ello, la solubilización y asimilación de nutrientes (2323. López-Coria M, Hernández-Mendoza J, Sánchez-Nieto S. Trichoderma asperellum induces maize seedling growth by activating the plasma membrane H+-ATPase. Molecular Plant-Microbe Interactions. 2016;29(10):797-806. DOI: 10.1094/MPMI-07-16-0138-R ).

La asociación de Trichoderma con las raíces confiere, a través de varios mecanismos, efectos beneficiosos a la planta. El establecimiento de un hábitat endofítico es un importante mediador de las actividades en el control biológico, debido a la elicitación de mecanismos de defensa de la planta hospedante. Se piensa, que cuando el hongo entra en las capas epidérmicas de las raíces, confiere mejor salud al cultivo, mayor crecimiento vegetal (síntesis de auxinas) y favorece la absorción de nutrientes, lo cual se revierte en un aumento de la productividad de las plantas (1818. González-Marquetti I, Ynfante-Martínez D, Arias-Vargas Y, Gorrita-Ramírez S, Hernández-García T, de la Noval-Pons BM, et al. Efecto de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg sobre indicadores de crecimiento y desarrollo de Phaseolus vulgaris L. cultivar BAT-304. Rev. Protección Veg. 2019;34(2):1-10.). Los resultados de este estudio se corresponden con los expuestos por Chowdappa et al. (2424. Chowdappa P, Kumar SM, Lakshmi MJ, Upreti K. Growth stimulation and induction of systemic resistance in tomato against early and late blight by Bacillus subtilis OTPB1 or Trichoderma harzianum OTPB3. Biological Control. 2013;65(1):109-117. DOI: 10.1016/j.biocontrol.2012.11.009 ) y Ruiz-Sánchez et al. (2525. Ruiz-Sánchez M, Echeverría-Hernández A, Muñoz-Hernández Y, Martínez-Robaina AY, Cruz-Triana A. Aplicación de dos cepas de Trichoderma asperellum S. como estimulante de crecimiento en el cultivo del arroz. Cultivos Tropicales. 2022;43(1):e10.) quienes observaron que la cepa OTPB3 de T. harzianum Rifai y T. asperellum (Ta.13 y Ta.78) estimularon el crecimiento de S. lycopersicum (L.) y de arroz (Oryza sativa L.).

Con respecto a la colonización de Trichoderma en suelo y raíces, los resultados mostraron que Ta.13 es capaz de colonizar el sustrato y las raíces, en un 100 % (96666.67 y 48166.67) UFC/gramos, respectivamente. Martínez et al. (2626. Martínez B, Infante D, Reyes Y. Trichoderma spp. y su función en el control de plagas en los cultivos. Rev. Protección Veg. 2013;28(1):1-9.) refieren que, Trichoderma, es capaz de ejercer un control más efectivo sobre agentes habitantes del suelo, cuando se mezcla con materia orgánica (estiércol, casting y biotierra), o cachaza y turba (Biocarbón) entre otras enmiendas utilizadas como biofertilizantes. Sobre estos últimos soportes, declaran que el hongo puede permanecer viable por más de 30 días en condiciones ambientales, sin que se altere la concentración inicial del producto aplicado. La presencia de Trichoderma en suelo, en el ensayo de cepellón, se corrobora con los resultados obtenidos por estos autores. En este sentido, Sharma (2727. Sharma AK, Sharma P, editors. Trichoderma: Host Pathogen Interactions and Applications. Rhizosphere Biology. 2020. ISBN 978-981-15-3321-1 (eBook). DOI: 10.1007/978-981-15-3321-1 ) declara que las especies del género producen mayor cantidad de metabolitos secundarios en sustratos con alta proporción de carbono a nitrógeno (C:N), de ahí la importancia de aplicarlos con sustratos orgánicos.

En el presente ensayo, se pudo corroborar con la co-aplicación del biocarbón y la cepa Ta.13 de T. asperellum, una disminución del índice de agallamiento (IA) (grado 2); no siendo así, en el tratamiento sin T. asperellum, en el cual se evidenció un incremento notable del IA de grado 5 de infestación. Estos resultados convergen con los expuestos por Baños et al. (2828. Baños Y, del Busto A, Cruz R, Aguiar I, Palomino L. Efecto de enmiendas orgánicas y Trichoderma spp. en el manejo de Meloidogyne spp. Rev. Brasileña de Agroecologia. 2010;5(2):224-233. Available from: http://www.aba-agroecologia.org.br/ojs2/index.php/rbagroecologia/article/view/9863 ) quienes obtuvieron disminución del IA provocado por Meloidogyne spp. con la aplicación de Trichoderma viride Pers (cepa C-66) y T. harzianum (cepa A-34). También, con los de Sharon et al. (2929. Sharon E, Chet I, Spiege Y. Trichoderma as biological control Agent. In: Davies K, Spiegel Y, editors. Biological Control of Plant-Parasitic Nematodes: Progress in Biological Control, vol 11. Dordrecht: Springer. DOI: 10.1007/978-1-4020-9648-8_8 ) quienes notificaron parasitismo por T. asperellum (cepa 203) en diferentes estadios del ciclo de vida de Meloidogyne spp.

Mesa-Vanegas et al. (3030. Mesa-Vanegas AM, Marín A, Colle-Osorno J. Metabolitos secundarios en Trichoderma y sus aplicaciones biotecnológicas agrícolas. Actual. Biol. 2019;41(111):32-44. DOI: 10.17533/udea.acbi.v41n111a02 ) estudiaron los compuestos orgánicos volátiles de la cepa YMF 1.00416 de Trichoderma sp., y encontraron tres metabolitos: un nuevo compuesto, 1β-vinilciclopentano-1α, 3α-diol y dos metabolitos conocidos, 6-pentil-2H-piran-2-ona y 4-(2-hidroxietil) fenol; todos con una elevada capacidad nematicida superior al >85 %. Hernández-Ochandia et al. (3131. Hernández-Ochandía D, Rodríguez MG, Peteira B, Miranda I, Arias Y, Martínez B. Efecto de cepas de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt y Nirenberg sobre el desarrollo del tomate y Meloidogyne incognita (Kofoid Y White) Chitwood. Rev. Protección Veg. 2015;30(2):139-147.) comprobaron el potencial nematicida de T. asperellum, por su demostrada capacidad metabólica y plasticidad ecológica. También, Abdelnabby et al. (3232. Abdelnabby H, Hu Z, Huihui W, Zang X. Furfural Biochar based formulations show synergistic and potentiating effects against Meloidogyne incognita in tomato. J. Pest Sci. 2018;91:203-218. DOI: 10.1007/s10340-017-0872-x ) lograron disminuir las poblaciones M. incognita, con aplicaciones de biocarbón combinado con microorganismos y abono orgánico.

Los resultados sugieren que la combinación de carboncillo y T. asperellum (cepa Ta.13) una vez evaluada en condiciones de campo, podría constituirse en una táctica para mejorar el estado del suelo y minimizar daños por nematodos en el cultivo. El hecho de que ambos elementos (carboncillo y Trichoderma spp.) se sugieran a los agricultores que abordan la producción protegida de hortalizas en la fase de obtención de plántulas (1313. Hussey RS, Barker KB. A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp. including a new technique. Plant Dis Report. 1973;57:1025-1028.) abre posibilidades para la aplicación práctica de este resultado.