INTRODUCCIÓN
⌅La enfermedad pata prieta es considerada como la primera problemática fitosanitaria del cultivo del tabaco (Nicotiana tabacum L.) debido a las grandes pérdidas económicas que provoca. La contaminación de los suelos con una alta densidad de inóculo de Phytophthora nicotianae, Breda de Haan, precisa de la obtención de cultivares cada vez más resistentes al patógeno (11. McCorkle KL, Drake KE, Lewis RS, Shew HD. Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region Wz, in flue-cured tobacco. Plant Dis. 2018;102(2):309-317. DOI: 10.1094/PDIS-03-17-0339-RE). En Cuba, los cultivares se logran a través de programas de mejoramiento genético y demoran entre 10 a 12 años, aspecto que dificulta poder introducir en cortos periodos de tiempo nuevos cultivares para mitigar la enfermedad pata prieta (22. Martínez J. Genes involucrados en la resistencia a la pata prieta y mejoramiento genético en Cuba. Cubatabaco. 2015;16(1):69-77.). El análisis del polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados de ADN (AFLP) en los cultivares de tabaco cubano, muestra una alta similitud genética (33. Domínguez Y S, Peréz MA Magallanes J A Chávez. Analysis of genetic polymorphism in wild Nicotiana species and Cuban cultivated tobacco (Solanaceae) through AFLP. Biotecnol Apl. 2018;35(2):2201-2205.). La posible consanguinidad presente en los cultivares, debido al uso recurrente y continuo de los mismos progenitores, provoca una baja variabilidad genética, a la cual al patógeno le resulta fácil adaptarse (44. Martínez J, Castro M, Toledo V, González A. El gen Php no es una fuente de resistencia en el tabaco cubano. Cultivos Tropicales. 2019;40(1):1-19.). Recientemente, se informó la adaptación de aislamientos de P. nicotianae a la resistencia parcial de cultivares cubanos. Estos aislamientos, más agresivos, son capaces de causar severos daños en cultivares informados como resistentes (55. Toledo V. González A. Agresividad de aislamientos de Phytophthora nicotianae Breda Haan adaptados a la resistencia parcial del cultivar cubano de tabaco 'Criollo 2010'. Rev. Protección Veg. 2022;37(1):e03. Cu-iD: https://cu-id.com/2247/v37n1e03).
En el mundo se informan cuatro diferentes fuentes genéticas de resistencia contra el patógeno P. nicotianae (66. Vanegas DM, Navarro RA, Alfanador L, Gutierrez JA, Morales JG, Gaviria BM. Characterization of Phytophthora nicotianae isolates from tobacco plants (Nicotiana tabacum) in Colombia. Rev. Ceres, Viçosa. 2022;69(1):078-091. DOI: 10.1590/0034-737x202269010011). Los cultivares de tabaco Negro ‘Florida 301’, ‘Beinhart-1000’ (B-1000) y ´Beinhart-1000-1´ (B-1000-1) poseen resistencia poligénica. No obstante, a pesar de ser efectiva frente a diferentes razas del patógeno, los cultivares que la presentan, expresan de bajos a altos niveles de resistencia (77. Xiao B, Drake K, Vontimitta V, Tong Z, Zhang X, Li M, et al. Location of Genomic Regions Contributing to Phytophthora nicotianae Resistance in Tobacco Cultivar Florida 301. Crop Sci. 2013;53(2):473-482. DOI: 10.2135/cropsci2012.06.0376). Los cultivares ‘B-1000’ y ‘B-1000-1’ son considerados, hasta el momento, como los de mayor resistencia frente a todas las razas de P. nicotianae (88. Zeng JM, Nifong J, Liu C, Huang J, Fang DH, Lewis RS. Evaluating diverse systems of tobacco genetic resistance to Phytophthora nicotianae in Yunnan, China. Plant Pathology. 2019;68(9):1616-1623. DOI: 10.1111/ppa.13091). Los fitomejoradores del cultivo del tabaco consideran que las bases genéticas para la resistencia a P. nicotianae en ambos cultivares ('B-1000' y 'B-1000-1') son las mismas, debido a su similar origen. El cultivar 'B-1000-1' se selecciononó a partir de 'B-1000', y en ensayos frente a P. nicotianae revelan iguales comportamientos de resistencia (99. Tong ZB, Xiao J, Fangchan F, Dunhuang J, Zeng X, et al. Large-scale development of SSR markers in tobacco and construction of a linkage map in flue-cured tobacco. Breeding Science 2016;66(3):381-390. DOI: 10.1270/jsbbs.15129).
Una búsqueda intensa y rigurosa en el pedigree de los cultivares comerciales de tabaco cubano, exponen que probablemente sólo se introdujo en el país, genotipos con los genes de resistencia proveniente de ´Florida 301´ (44. Martínez J, Castro M, Toledo V, González A. El gen Php no es una fuente de resistencia en el tabaco cubano. Cultivos Tropicales. 2019;40(1):1-19.). Este aspecto pudiera justificar que los cultivares de tabaco expresen niveles de resistencia de moderadamente susceptibles a altamente resistentes a la raza 0 y susceptibles a la raza 1 de P. nicotianae. Además, que el patógeno puede adaptarse a estos genes en cortos periodos de tiempo (55. Toledo V. González A. Agresividad de aislamientos de Phytophthora nicotianae Breda Haan adaptados a la resistencia parcial del cultivar cubano de tabaco 'Criollo 2010'. Rev. Protección Veg. 2022;37(1):e03. Cu-iD: https://cu-id.com/2247/v37n1e03).
Los resultados de evaluación de todas las fuentes de resistencia reconocidas internacionalmente frente a aislamientos cubanos de P. nicotianae, demostraron una alta resistencia en B-1000´ y `B-1000-1´ frente al 90 % de los aislamientos, clasificándose como resistentes frente al 10 % de estos (1010. González A, Toledo V. Evaluación de fuentes de resistencia del género Nicotiana frente a aislamientos cubanos de Phytophthora nicotianae Breda de Haan. Rev. Protección Veg. 2019;34(1). Available from: https://censa.edicionescervantes.com/index.php/RPV/article/view/1018). Ambos cultivares pudieran constituir fuentes de resistencia poligénica potencial en los programas de mejoramiento del cultivo y también, una vía de solución para mitigar el impacto que produce esta enfermedad en las áreas tabacaleras del país (1010. González A, Toledo V. Evaluación de fuentes de resistencia del género Nicotiana frente a aislamientos cubanos de Phytophthora nicotianae Breda de Haan. Rev. Protección Veg. 2019;34(1). Available from: https://censa.edicionescervantes.com/index.php/RPV/article/view/1018).
El objetivo de la presente investigación es evaluar la resistencia frente a P. nicotianae de nuevos híbridos de tabaco, con incorporación de genes de resistencia provenientes del cultivar ‘Beinhart-1000-1’
MATERIALES Y MÉTODOS
⌅Para la obtención de los cinco híbridos, se seleccionaron cinco cultivares comerciales de tabaco negro cubano como progenitores femeninos, los cuales se polinizaron de manera independiente con el cultivar foráneo `B-1000-1´. Como premisa fundamental en la selección de los cultivares cubanos, además de la resistencia a las principales enfermedades (pata prieta y moho azul) se consideraron los resultados en rendimiento, calidad y propiedades organolépticas de las hojas. Los cruzamientos se efectuaron mediante el método de cruzamiento intervarietal con polinización controlada. Los cinco progenitores femeninos cubanos no pueden ser declarados por acuerdo confidencial y propiedad intelectual del Instituto de Investigaciones del Tabaco (Tabla 1). El comportamiento de resistencia frente a P. nicotianae de los cinco híbridos y sus parentales (femeninos y masculinos) se evaluó durante dos campañas tabacaleras, en los periodos comprendidos de diciembre a marzo de 2020-2021 y de 2021-2022, en condiciones de semillero y plantación, incluyéndose como testigo susceptible el cultivar ‘KY-14’.
| Parentales femeninos | Parental masculino (Pm) | Combinación híbrida obtenida |
|---|---|---|
| P1 | ´B-1000-1´ (Pm) | H1 |
| P2 | H2 | |
| P3 | H3 | |
| P4 | H4 | |
| P5 | H5 |
Para el experimento en semillero, se utilizó la tecnología de canteros tecnificados a base de cachaza y cascarilla de arroz, como materia orgánica (3:1) infectada de manera natural con P. nicotianae, y determinando antes su concentración de inóculo por el método de cebo (3 propágulos /g de suelo) (1111. Fernández A, Toledo V, Rey X. Determinación de parámetros óptimos para la detección de Phytophthora nicotianae en suelo mediante un método de cebo. Fitosanidad. 1998;2(1-2):7-10.). El sustrato se homogenizó con instrumentos de labranza para asegurar igual concentración de inóculo de P. nicotianae en todas las parcelas experimentales. Los experimentos se realizaron bajo un Diseño de Bloques al Azar con tres réplicas, donde se consideraron como bloques cada cantero y como unidad experimental, cada parcela de 1 m2 con 200 plantas por genotipo. Se evaluó, cada tres días, el porcentaje de plantas afectadas por la enfermedad a partir de la aparición de los primeros síntomas, hasta que el testigo susceptible ‘KY-14’ alcanzó el 100 % del área afectada.
De forma paralela al experimento anterior y con la misma proporción de sustrato estéril para garantizar plántulas sanas, se desarrolló otro semillero libre de enfermedades y sin aplicaciones de fungicida, garantizando la cantidad de plantas suficientes para el experimento en plantación. Las plántulas de los diferentes genotipos, trascurridos 45 días de edad, se trasplantaron a parcelas experimentales donde cada uno ocupó cinco surcos, con un promedio de 20 plantas por surco. El experimento se realizó bajo un Diseño Completamente Aleatorizado con dos réplicas, y se consideró como unidad experimental cada surco con 20 plantas. El ensayo se realizó bajo condiciones de inoculación natural del patógeno, en suelos con informes de alta incidencia de la enfermedad, lo cual se comprobó, previamente, a través del método de cebo (4 propágulos/ g de suelo de P. nicotianae) (1111. Fernández A, Toledo V, Rey X. Determinación de parámetros óptimos para la detección de Phytophthora nicotianae en suelo mediante un método de cebo. Fitosanidad. 1998;2(1-2):7-10.).
Las evaluaciones del porcentaje de plantas enfermas con pata prieta, en todos los genotipos, comenzaron a los 20 días del trasplante, y se realizaron cada 15 días hasta los 80 días de establecido el cultivo en el campo.
En ambas etapas, a los valores del porcentaje de plantas enfermas, se les comprobaron las premisas de normalidad con el test de Shapiro Wilks y la homogeneidad de varianza con el test de Levene, ambos realizados de forma independiente en el programa InfoStat v. 2016 (1212. Di Rienzo JA, Casanoves F, Balzarini MG, González L, Tablada M, Robledo CW. Infostat versión 2016. Grupo infostat, FCA, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. Available from: https://www.infostart.com.ar). Luego, para el análisis de esta variable, se calculó el Área Bajo la Curva del Progreso de la Enfermedad (ABCPE) descrito por Madden et al. (1313. Madden LV, Hughes G, Van der Bosch F. The study of plant disease epidemics. APS Press. The American Phytopatological Society, St. Paul, Minnesota, U.S.A. 2007. 421 pp. ISBN 978-0-89054-354-2.) usando la fórmula del punto medio:
ti+1:
tiempo de evaluación i+1 (días después de la siembra)
ti:
tiempo de evaluación i (días después de la siembra)
yi:
porcentaje de plantas enfermas o área afectada con la enfermedad en la evaluación i
yi+1:
porcentaje de plantas enfermas o área afectada con la enfermedad en la evaluación i+1
n:
cantidad de evaluaciones realizadas
El ABCPE es una variable que estima la intensidad de la enfermedad a lo largo del experimento. Se calcula a través de los valores del porcentaje de plantas enfermas en cada evaluación o de área afectada por la enfermedad (es decir, la acumulación diaria del porcentaje de los valores de infección) y se interpreta de manera directa y sin transformación. Cuanto más alto es el ABCPE, más susceptible es el cultivar (1414. Forbes G, Pérez W, Andrade Piedra J. Procedimiento para Evaluación Estándar y Manejo de Datos de Clones Avanzados de Papa. En: Modulo 3: Evaluación de la Resistencia en genotipos de papa a Phytophthora infestans bajo condiciones de campo. Guía para Colaboradores Internacionales. Lima, Perú, Centro Internacional de la Papa (CIP). 2014. 50 pp).
A los datos del ABCPE se les realizó un Análisis de Varianza de Clasificación Simple, Modelo de Efectos Fijos, en tanto, para la comparación de las medias se utilizó la prueba a posteriori de la Mínima Diferencia Significativa (LSD). Todos los análisis estadísticos requeridos en cada experimento, se realizaron en el programa InfoStat v. 2016 (1212. Di Rienzo JA, Casanoves F, Balzarini MG, González L, Tablada M, Robledo CW. Infostat versión 2016. Grupo infostat, FCA, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. Available from: https://www.infostart.com.ar)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
⌅La determinación del ABCPE durante la fase de semillero demostró, que los híbridos presentaron un comportamiento similar en ambas campañas tabacaleras. El parental masculino B-1000-1´ presentó el menor valor del ABCPE en las dos campañas, mostrando la mayor resistencia a P. nicotianae (Fig. 1). Todos los híbridos manifestaron valores del ABCPE intermedios entre el parental masculino ´B-1000 -1´ y sus parentales femeninos correspondientes. Los híbridos que presentaron los valores más bajos de ABCPE fueron H3 y H4, en ambos momentos de evaluación; mientras, el resto de los híbridos presentaron valores superiores y sin diferencias significativas entre ellos. Los progenitores femeninos alcanzaron valores variables del ABCPE y se diferenciaron de sus descendientes F1. Entre los progenitores se destacaron el P3 y P4 con los valores de ABCPE más bajos, diferenciándose del resto de los progenitores femeninos. Todos los genotipos evaluados se diferenciaron por mostrar niveles de resistencia superiores al testigo susceptible `KY-14´ frente a P. nicotianae. (Fig. 1A.).
En ambas campañas tabacaleras y en la fase de plantación, los resultados de la evaluación de la resistencia ante P. nicotianae muestran que el cultivar `B-1000-1´ y el híbrido H3 presentaron los menores valores del ABCPE (Fig. 2). En el primer año de evaluación, se agruparon con el parental masculino el híbrido H4 y H3; sin embargo, en el segundo año, el valor del H4 lo reunió con los híbridos H1 y H2 (Fig. 2 A y B). El resto de los híbridos exhibieron valores de ABCPE intermedios y con diferencias significativas entre el parental masculino ´B-1000-1´ y los parentales femeninos. En ambas campañas, el híbrido H5 presentó los mayores valores de ABCPE, diferenciándose del resto de los híbridos y clasificándose como el de más baja resistencia entre ellos. Además, este híbrido, se agrupó con los parentales femeninos P3 y P4; mientras que, P5 obtuvo el mayor valor del ABCPE, siendo el de resistencia más baja entre los progenitores femeninos cubanos. El testigo susceptible `KY-14´ presentó el mayor valor de ABCPE, diferenciándose de todos los genotipos evaluados. Ligeras diferencias e incremento de temperatura, según registros meteorológicos consultados, pudieron influir en la campaña 2021-2022 (entre los meses de enero a marzo del 2022 con respecto a igual periodo de 2021) propiciaron un leve incremento del desarrollo de la enfermedad en la etapa de plantación. La enfermedad pata prieta se favorece en climas cálidos, alta humedad y períodos lluviosos (88. Zeng JM, Nifong J, Liu C, Huang J, Fang DH, Lewis RS. Evaluating diverse systems of tobacco genetic resistance to Phytophthora nicotianae in Yunnan, China. Plant Pathology. 2019;68(9):1616-1623. DOI: 10.1111/ppa.13091).
Los híbridos y parentales mostraron el mismo comportamiento en cuanto a la resistencia ante el patógeno, tanto en la etapa de semillero como en la de plantación. Los genotipos más resistentes en semillero (parental masculino e híbridos) coincidieron en la etapa de plantación, mostrando los menores valores ABCPE (Fig. 1 y 2).
Se observó que en la etapa de semillero se muestran valores más altos del ABCPE, respecto a los valores obtenidos en la etapa de plantación. La mayor susceptibilidad en etapas tempranas del desarrollo de los cultivos, se ha evidenciado en diferentes interacciones planta-patógeno. Bajo el término general "resistencia relacionada con la edad", se exponen resultados que demuestran una ganancia de resistencia a la enfermedad contra un determinado patógeno cuando las plantas son adultas (1515. Ruifang S, Yujiao T, Waqar G, Zhengxiong Z. Unraveling the expression of differentially expressed proteins and enzymatic activity in response to Phytophthora nicotianae across different flue‑cured tobacco cultivars. BMC Microbiology. 2022;22(1):112. DOI: 10.1186/s12866-022-02531-z) Estudios han correlacionado un incremento de la resistencia frente a los patógenos al transitar la planta del estado juvenil al estado adulto. El desarrollo morfológico de la planta es una adaptación clave a las fluctuaciones de la población de patógenos en la naturaleza. La presencia de genes que controlan la morfología y el desarrollo fenotípico de las plantas tienen un efecto pleiotrópico sobre la resistencia a las enfermedades (1616. Hu L, Yang L. Time to finght: Molecular mechanisms of age related resistance, Phytopathology. 2019;109(9):1500-1508. DOI: 10.1094/PHYTO-11-18-0443-RVW).
Estos resultados coinciden con lo informado para los híbridos F1, obtenidos a partir del cruce entre 'B-1000-1' y 16 parentales con diferentes niveles de resistencia a P. nicotianae. Los híbridos resultantes expresaron valores intermedios de resistencia entre ambos parentales, y mayores niveles de resistencia respecto a híbridos obtenidos de los cultivares resistentes 'Rg' y 'N.C. 5346', derivados de ´Florida 301´ (1717. Silber G, Heggestad H. Comparative black shank resistance of Beinhart 1000 (Quin Diaz), N.C. 5346 and Rg in F1 generation involving various tobacco types. Tob. Sci. 1963;7:144-147.). Investigaciones con las líneas derivadas de 'B-1000-1' demostraron ser más resistentes que las líneas que procedían de 'Beltsville', con resistencia derivada de N. plumbaginifolia (1818. Heggestad H, Lautz W. Some results of studies on resistance to tobacco black shank. Phytopathology. 1957;47:452-452).
La presente investigación pudiera servir de referencia a nuevos programas de mejoramiento genético, que permitan combinar, en un mismo genotipo, los genes de resistencia provenientes de dos fuentes de resistencia poligénicas (del cultivar ´B-1000-1´ y ´Florida 301´). Esta combinación contribuiría a frenar el progreso de la enfermedad pata prieta, puesto que en los híbridos se manifiestan niveles de resistencia superiores a los cultivares cubanos.
CONCLUSIONES
⌅Los cinco híbridos de tabaco obtenidos mostraron altos niveles de resistencia frente a P. nicotianae, superando la resistencia de los parentales femeninos, pero no la del progenitor masculino `B-1000-1´.