Investigaciones para el desarrollo del hongo Pochonia chlamydosporia var. catenulata como principio activo del bionematicida Klamic^®

Breve historia de la investigación

El éxito de la investigación se debió, en gran parte, a la formación de diferentes grupos unidos por la colaboración internacional, y tomando como base la incorporación, en cada momento, de múltiples disciplinas y enfoques. El apoyo brindado por Rothamsted Research Institute, específicamente, Nematode Interactions Unit, Department of Plant Pathology and Microbiology, así como Harpenden Local Campaign Committee (Reino Unido de la Gran Bretaña), fue fundamental en los inicios de la investigación. Ambas instituciones brindaron su aporte financiero para que varios de los integrantes del equipo cubano de investigación (Leopoldo Hidalgo-Diaz, Nivian Montes de Oca y Belkis Peteira Delgado) llevaran a cabo las investigaciones.

Invaluable también, resultó en ese momento la elaboración y ejecución conjunta del proyecto de investigación con la Unión Europea, ICA4-CT-2002-10044, MiCoSPA - Microbial Pest Control for Sustainable Peri-Urban/Urban Agriculture in Latin America, en el cual participaron el Reino Unido, Cuba, México, Holanda y Portugal. Para las investigaciones relacionadas con Pochonia y dentro del proyecto antes mencionado, fue muy importante el apoyo del Dr. Brian Kerry, nematólogo de gran experiencia (Fig. 1 y 2) quien fungió como supervisor de muchos de los trabajos que se desarrollaron después.

Vale destacar, la significativa contribución en las investigaciones relacionadas con Pochonia de otros investigadores, profesores y estudiantes extranjeros, que desarrollaron sus estudios en el Instituto de Investigaciones de Rothamsted, como los doctores Rosa Manzanilla, Penny Hirsch, Naresh Nagan, Ivania Esteves y Simon Atkins, entre otros. Algunos de ellos, se desempeñaron como supervisores de las investigaciones y tesis doctorales, derivadas de ellas.

La colaboración internacional se extendió más tarde a la Universidad de Brasilia y Embrapa- Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasilia-DF, Brasil, a través de acciones que financió el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico CNPq y Embrapa. En estas investigaciones participaron, por la parte brasileña, los investigadores Myrian Tigano, Regina M. D. G. Carneiro, S. D. Silva, Marina D. G. Carneiro, Jananina Ferreira, Irene Martins, José Mauro Castro, entre otros.

Posteriormente, se elaboró y aprobó el proyecto internacional titulado Microbial Uptakes for Sustainable management of major bananA pests and diseases (MUSA) H2020-SFS-2016-2017, Número de propuesta 727624 (2017-2021) coordinado por el Dr. Aurelio Ciancio. En este proyecto participaron 13 instituciones de diferentes países (Italia, Reino Unido, Bélgica, España, Nigeria, Etiopía Kenya, Costa Rica y Cuba). Los líderes principales, en cada una de las partes, fueron los doctores Aurelio Ciancio, Luis V. Lopez-Llorca, Federico Lopez Moya, Laura Pietrantonio, Javier López-Cepero Jiménez, Jesús Mercado-Blanco, Carmen Gómez-Lama, Dan Bebber, Jasmine Zorrilla, George Mahuku, Denny Coyne, Solveig Haukeland, Henry Wainwright, Luis Ernesto Pocasangre, Belkis Peteira y Mayra G. Rodríguez (Fig. 3).

Por otra parte, las investigaciones sobre el tema, también recibieron apoyo financiero en Cuba, a través de diversos proyectos nacionales:

A continuación se exponen los resultados de estos proyectos.

Prospección e identificación

En un primer pesquizaje, realizado en el periodo comprendido de 1995-1996, Hidalgo-Díaz (22. Hidalgo-Díaz L. Potencialidades de cepas autóctonas de Verticillium chlamydosporium (Goddard) como agente de control biológico de Meloidogyne spp. [Tesis en Opción al Grado de Doctor en Ciencias Agrícolas]. Santa Clara, Las Villas: Universidad Central “Marta Abreu” de las Villas. Cuba; 2000; 100 págs.) realizó una prospección en suelos de las dos principales regiones cafetaleras del país: una más seca y cálida al este (Provincia Santiago de Cuba) y otra más húmeda y fría, al centro del país (Provincia Villa Clara). Las muestras fueron recolectadas en 12 sitios diferentes con antecedentes de infestación por Meloidogyne spp. (33. Rodríguez MG, Rodríguez I, Sánchez L. Especies del género Meloidogyne que parasitan el cafeto en Cuba: distribución geográfica y sintomatología. Rev. Protección Veg. 1995; 10: 123-128.). Adicionalmente, se obtuvieron muestras de suelo y raíces de tomate infestadas por Meloidogyne incognita, en la provincia Mayabeque (44. Hidalgo L, Sánchez L, Gómez L. Verticillium chlamydosporium Goddard, parásito de huevos de Meloidogyne incognita. Rev. Protección Veg. 1998; 13(1):29-30). Los aislamientos se identificaron y describieron con el uso de las claves de especies de hongos nematófagos. Después, se actualizaron según Zare y Gams (55. Zare R, Gams W. A revision of Verticillium sect. Prostrata. IV. The genera Lecanicillium and Stemplicillum gen. nov. Nova Hedwigia. 2001; 73(1-2):1-50. https://doi.org/10.1127/nova.hedwigia/73/2001/1) y Zare, Gams y Evans (66. Zare R, Gams W; Evans HC. A revision of Verticillium section Prostrata. V. The genus Pochonia, with notes on Rotiferophthora. Nova Hedwigia. 2001; 73:51-86. https://doi.org/10.1127/nova.hedwigia/71/2001/51) quienes reubicaron las especies de hongos nematófagos del género Verticillium Ness a los géneros Lecanicillium Gams y Zare, y Pochonia Batista y Fonseca.

Se obtuvieron 83 aislamientos asociados a un complejo de especies del género Meloidogyne, en el cual predominó M. incognita, en la región central; mientras que, en la región este, se encontraron en similares proporciones: M. incognita, Meloidogyne enterolobii Yang y Eisenback (syn. Meloidogyne mayaguensis Rammah y Hirschman) y Meloidogyne arenaria (Neal) Chitwood. De estos aislamientos se identificaron tres especies y dos variedades de hongos nematófagos parásitos facultativos de huevos de nematodos: Pochonia chlamydosporia var. chlamydosporia (Goddard) Gams y Zare; Pochonia chlamydosporia var. catenulata (Kamyschko ex Barron y Onions) Zare y Gams; Lecanicillium psalliotae (Treschow) Zare y Gams y Pochonia suchlasporium (Gams y Dackman) Zare y Gams. P. chlamydosporia resultó la especie más frecuente con el 90 % de los aislamientos realizados y, dentro de ella, la var. catenulata con el 62 % (77. Hidalgo-Diaz L, Bourne JM, Kerry BR, Rodríguez MG. Nematophagous Verticillium spp. in soils infested with Meloidogyne spp. in Cuba: isolation and screening. International Jour. of Pest Management, 2000; 46(4):277-284. https://doi.org/10.1080/09670870050206046). Los aislamientos P. chlamydosporia var. catenulata, a diferencia de los aislamientos examinados previamente por Gams (88. Gams W. A contribution to the knowledge of nematophagous species of Verticillium. Netherlands Jour. of Plant Pathology.1988; 94:123-148. https://doi.org/10.1007/BF01978003) presentaron gran producción de clamidosporas, con una mayor intensidad en la coloración de las colonias, predominando los colores ocráceos.

En años posteriores, se realizó un segundo pesquizaje en diferentes escenarios productivos de cinco provincias de Cuba: La Habana, Mayabeque, Matanzas, Granma y Guantánamo, y en la localidad de Petrolina, Pernambuco, Brasil, en una plantación de guayaba afectada por M. enterolobii (99. Ferreira de Souza J, Martins I, Carneiro RMDG, Hidalgo-Díaz L, Arévalo J, Tigano MS. Fungos isolados de Meloidogyne mayaguensis em raízes de goiabeiras infectadas. Circular Técnica 54. Brasilia, DF, 2007. 5 págs. ISSN 1516-4349). Este nuevo pesquisaje estaba encaminado a ampliar el conocimiento sobre la distribución de estos hongos en Cuba y otras regiones tropicales; así como disponer de un mayor número de aislamientos de P. chlamydosporia para completar los estudios de caracterización (1010. Arévalo J, Hidalgo-Díaz L, Martins I, Souza JF, Castro JMC, Carneiro RMDG, et al. Cultural and morphological characterization of Pochonia chlamydosporia and Lecanicillium psalliotae isolated from Meloidogyne mayaguensis eggs in Brazil. Tropical Plant Pathology. 2009; 34(3):158-163. https://doi.org/10.1590/S1982-56762009000300004, 1111. Arévalo J. Avances en la caracterización de la cepa IMI SD 187 de Pochonia chlamydosporia var. catenulata (Kamyschko ex Barron y Onions) Zare y Gams y mejoras productivas del bionematicida KlamiC®. Rev. Protección Veg. 2013; 28(1): 80.).

Se procesaron, en total, 58 muestras de diferentes regiones edafo-climáticas de Cuba y Brasil. La concentración de las poblaciones nativas de P. chlamydosporia estuvo en el rango entre 3,75 x 10¹ y 2,50 x 10² UFC.g^-1 de suelo, inferior a las concentraciones informadas en suelos supresores de Heterodera avenae Wollenweber (5 x 10³ UFC.g^-1 de suelo) bajo monocultivos de cereales en el Reino Unido, por Kerry, Crump y Mullen (1212. Kerry BR, Crump DH, Mullen LA. Studies of the cereal cyst nematodes, Heterodera avenae, under continuous cereal, 1975-1978. II. Fungal parasitism of nematodes females and eggs. Annals Applied Biology. 1982; 100: 489-499. https://doi.org/10.1111/j.1744-7348.1982.tb01415.x). En cambio, estos resultados coinciden con datos anteriores de poblaciones de este hongo nematófago en suelos cafetaleros de las regiones central y este de Cuba, donde se detectaron concentraciones en el rango de 1,3 x 10¹ y 5,75 x 10² UFC.g^-1 de suelo (77. Hidalgo-Diaz L, Bourne JM, Kerry BR, Rodríguez MG. Nematophagous Verticillium spp. in soils infested with Meloidogyne spp. in Cuba: isolation and screening. International Jour. of Pest Management, 2000; 46(4):277-284. https://doi.org/10.1080/09670870050206046).

En todos los casos, los aislamientos, se identificaron de manera preliminar siguiendo la descripción realizada por Zare, Gams y Evans (66. Zare R, Gams W; Evans HC. A revision of Verticillium section Prostrata. V. The genus Pochonia, with notes on Rotiferophthora. Nova Hedwigia. 2001; 73:51-86. https://doi.org/10.1127/nova.hedwigia/71/2001/51) para P. chlamydosporia var. chlamydosporia. En Agar Extracto de Malta (AEM) a los 10 días a 20ºC, describieron aspectos, como diámetro de la colonia, textura y color. Se observaron de fiálides simples verticiladas, conidios dispuestos en falsas cabezas en el extremo de las fiálides, predominantemente redondos y elipsoidales, así como la presencia de clamidosporas (Fig. 4).

Siguiendo también los criterios descritos por Zare, Gams y Evans (66. Zare R, Gams W; Evans HC. A revision of Verticillium section Prostrata. V. The genus Pochonia, with notes on Rotiferophthora. Nova Hedwigia. 2001; 73:51-86. https://doi.org/10.1127/nova.hedwigia/71/2001/51), se realizó la identificación y descripción de P. chlamydosporia var. catenulata. Las colonias fueron similares a P. chlamydosporia var. chlamydosporia (88. Gams W. A contribution to the knowledge of nematophagous species of Verticillium. Netherlands Jour. of Plant Pathology.1988; 94:123-148. https://doi.org/10.1007/BF01978003). En AEM a los 10 días a 20ºC, se anotaron las características del diámetro de la colonia blanca algodonosa, con tonalidad amarilla clara en el centro y bordes regulares. Se observaron fiálides simples verticiladas, conidios dispuestos en cadenas en el extremo de las fiálides, de forma esférica, y la presencia de clamidosporas (Fig. 5).

Finalmente, los aislados cubanos que se identificaron morfológicamente, se seleccionaron teniendo en cuenta su origen, especie, variedad y biotipo, y se depositaron en las colecciones de hongos nematófagos del CENSA (CCC-HN, código Cvc) y del Profesor Brian Kerry, en la Estación Experimental de Rothamsted del Reino Unido (código RRes).

Selección:

Caracterización Morfológica y Cultural

Posteriormente, se procedió a realizar la caracterización morfológica de las colonias en diferentes medios de cultivo (Papa Dextrosa Agar, Agar Extracto de Malta, Agar Harina de Maíz, Medio semi selectivo y Medio AP - 50. (Fig. 6, 7, 8)

Los medios estudiados, hasta el momento, son los más utilizados para el cultivo e identificación de esta especie, aunque mediante la observación visual, son muy difíciles de diferenciar las variedades chlamydosporia y catenulata.

De forma general, en cultivos jóvenes, el hongo es de color blanco, aunque la cepa en todos los medios estudiados genera un pigmento difusible de color amarillo, el cual se observa en el reverso de la colonia. Su producción depende de las características del cultivo (medio, temperatura, iluminación, tiempo y agitación) y en la medida que envejece y dependiendo del medio de cultivo, puede obtenerse un color amarillo intenso, hasta llegar a las tonalidades ocre.

En la observación microscópica, se destacaron las fiálides delgadas, formadas a partir de hifas postradas, sencillas o en nudos de 2 ó 3. Conidios enlazados en cadena, subglobosos a lagrimosos. No se observan diferencias en las características morfológicas de la cepa en los diferentes medios de cultivos estudiados, coincidiendo sus características con las descritas por Hidalgo-Díaz (22. Hidalgo-Díaz L. Potencialidades de cepas autóctonas de Verticillium chlamydosporium (Goddard) como agente de control biológico de Meloidogyne spp. [Tesis en Opción al Grado de Doctor en Ciencias Agrícolas]. Santa Clara, Las Villas: Universidad Central “Marta Abreu” de las Villas. Cuba; 2000; 100 págs.) para esta variedad.

Caracterización Enzimática: Como parte de la caracterización, se condujeron diversos ensayos bioquímicos de dinámica para el estudio de la inducción de diferentes enzimas, en distintos medios de cultivo (1313. Esteves I, Peteira B, Atkins SD, Magan N, Kerry B. Production of extracellular enzymes by different isolates of Pochonia chlamydosporia. Mycological Research. 2009; 113(8): 867-876. https://doi.org/10.1016/j.mycres.2009.04.005).

Inducción de proteasas en medio sólido

La cepa se mantuvo durante toda la dinámica (3, 5 y 7 días) mostrando una respuesta más rápida (producción de proteasas) que el resto de las cepas analizadas, ante la inducción con gelatina. En todos los tiempos analizados, se alcanzaron altos valores de crecimiento de la colonia, que se compensaron con altos valores de producción de halo de degradación, de ahí que siempre mostró valores significativamente diferentes y mayores, hasta el séptimo día (1414. Peteira B, Esteves I, Hidalgo-Díaz L. Detección de proteasas producidas por Pochonia chlamydosporia en medio sólido. Rev. Protección Veg. 2006; 21(3): 186-190., 1515. Peteira B, Esteves I, Montes de Oca N, Hidalgo-Díaz L. Estabilidad de la cepa IMI SD 187 de Pochonia chlamydosporia var. catenulata en medio sólido. Rev. Protección Veg. 2007; 22 (2): 124-127).

Inducción de proteínas en medio líquido

Con relación a la inducción de proteínas totales en medio líquido basal, los niveles alcanzados por la cepa de catenulata, se mantuvieron en valores intermedios, mostrándose en el séptimo día valores significativamente diferentes e inferiores, en comparación con el resto de las cepas. También, mostró un comportamiento similar en el medio suplementado con gelatina. En medio suplementado con quitina, la cepa IMI SD 187 evidenció mayor síntesis de proteínas, agrupándose con las cepas 399 y 10, de las cuales no difirió significativamente. El medio con lípidos fue, igualmente, un buen inductor de proteínas totales, aunque la cepa IMI SD 187 produjo los valores más bajos, sin diferencias significativas respecto a los niveles mostrados por otras cepas. En todos los medios estudiados para la cepa IMI SD 187, se pudo observar un máximo de producción de proteínas totales los 5 días (1616. Peteira B, Estévez I, Atkins S, Hidalgo-Díaz L, Montes de Oca N, Kerry B. Estabilidad de la cepa IMI SD 187 de Pochonia chlamydosporia var. catenulata (Kamyscho ex Barron y Onions) Zare y W. Gams. Parte II. Indicadores bioquimicos. Rev. Protección Veg. 2005; 20(2): 102-109).

Las enzimas con actividad proteolítica, no tuvieron un comportamiento significativo en medio basal para la cepa IMI SD 187. Sin embargo, en los medios suplementados con gelatina, quitina y lípidos, sí se manifestó de forma general un comportamiento similar a otras cepas con niveles elevados de síntesis de proteasas. Sobresalió el hecho, de que las exoquitinasas no se indujeron fácilmente en los medios analizados, de manera general, y tampoco para esta cepa. Las esterasas, por su parte, solo mostraron valores medibles en los medios basales y gelatina. En este último, la cepa IMI SD 187, se destacó con valores estadísticamente superiores de actividad y con una respuesta más sostenida en el tiempo (1616. Peteira B, Estévez I, Atkins S, Hidalgo-Díaz L, Montes de Oca N, Kerry B. Estabilidad de la cepa IMI SD 187 de Pochonia chlamydosporia var. catenulata (Kamyscho ex Barron y Onions) Zare y W. Gams. Parte II. Indicadores bioquimicos. Rev. Protección Veg. 2005; 20(2): 102-109).

Los niveles de producción de la enzima VCP1 (relacionada con la patogenicidad en cepas de la variedad chlamydosporia) resultaron inexplicablemente bajos para la cepa IMI SD 187 y en cualquiera de los medios utilizados para inducir su producción, aspecto que posteriormente se analizó a través de otras técnicas, tomando como diana el ADN.

Efecto del potencial matricial y osmótico sobre el crecimiento radial de Pochonia

El efecto de variar el potencial matricial y osmótico sobre el crecimiento radial de Pochonia chlamydosporia y la acumulación de polioles, se estudió en tres aislados de este hongo (uno de los aislados estudiados fue la cepa IMI SD 187). El crecimiento radial se midió en medio papa dextrosa agar modificado osmóticamente con KCl o glicerol; mientras, el PEG 8000, se utilizó para modificar el potencial matricial. Se analizaron cuatro polioles (glicerol, eritritol, arabitol y manitol) y un azúcar (glucosa). Los resultados mostraron que el crecimiento radial disminuyó con el incremento del estrés osmótico o matricial. Aunque, se detectaron diferencias significativas en el comportamiento frente al estrés matricial de los aislados analizados, no existieron diferencias frente al estrés osmótico. De igual forma, se encontraron diferencias entre los aislados, en cuanto a los niveles de polioles acumulados en respuesta al estrés matricial, no así, frente al osmótico; aunque en este caso los aislados acumularon diferentes combinaciones de los polioles, en dependencia del agente utilizado para crear el estrés. El arabitol y el glycerol fueron los principales polioles acumulados en medio de cultivo osmóticamente modificado; mientras que el eritritol lo fue en el medio modificado con PEG 8000. El arabitol y el glicerol fueron los principales polioles acumulados en un medio modificado osmóticamente (KCl o glicerol), mientras que el eritritol fue el principal poliol acumulado en medio modificado con PEG. Los autores plantearon que Pochonia chlamydosporia pudiera utilizar diferentes mecanismos de osmoregulación para evitar los estreses osmótico y matricial (1717. Esteves I, Peteira B, Powers S, Magan N, Kerry B. Effects of osmotic and matric potential on radial growth and accumulation of endogenous reserves in three isolates of Pochonia chlamydosporia. Biocontrol Science and Technology. 2009; 19(2):185-199. https://doi.org/10.1080/09583150802650175).

Estudio de los contenidos de proteínas de las esporas

Por otra parte, se determinó el contenido de proteínas totales de las esporas de un grupo de cepas. Se observó que las esporas con un contenido mayor de proteínas totales fueron las procedentes de la cepa 10, seguidas de las de la cepa IMI SD187. De este resultado se puede inferir que las esporas de ambas cepas (IMI SD 187 y 10) pudieran sobrevivir mejor en el suelo, donde las condiciones son más adversas y existe la competencia por un nicho común con otros microorganismos (datos no mostrados).

Detección de VCP1 en la cepa por RFLP y PCR con cebadores específicos para esta enzima

No se detectó el gen codificador para la enzima VCP 1 por la técnica de RFLP en la cepa IMI SD 187, aun cuando las condiciones de astringencia se redujeron al mínimo posible. De manera similar, también fueron negativos los resultados en todas las parejas de cebadores específicos empleadas para la amplificación de la VCP1 mediante PCR, para esta cepa. Ante estos resultados negativos, se indicó que la proteasa VCP1 en esta cepa era muy diferente a la encontrada en el resto de las cepas de P. chlamydosporia var. chlamydosporia, estudiados con anterioridad por otros autores (1818. Segers R, Butt TM, Kerry BR, Beckett A, Feberdy JF. The role of the proteinase VCP1 produced by the nematophagous Verticillium chlamydosporium in the infection process of nematode eggs. Mycologycal Research.1996; 100:421-428. https://doi.org/10.1016/S0953-7562(96)80138-9, 1919. Morton CO. Genetic variation in the nematophagous fungus Verticillium chlamydosporium from southern European soil sand molecular characterization of protease VCP1. [PhD Thesis]. University of Nottingham, U.K. 2002. 132 Págs., 2020. Morton OC, Hirsch PR, Peberdy JP, Kerry BR. Cloning of and genetic variation in protease VCP1 from the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia. Mycol. Res. 2003; 107(1): 38- 46. https://doi.org/10.1017/s0953756202007050) o, simplemente, no se producía (2121. Peteira B, Hidalgo-Díaz. VCP1 protease detection in Pochonia chlamydosporia var. catenulata strain IMI SD 187. Rev. Protección Veg. 2009; 24(3): 166-172).

Posteriormente, se realizaron otros ensayos que confirmaron los hallazgos antes mencionados. El análisis de las secuencias de ADN de P. chlamydosporia var. catenulata de la cepa IMI SD187, específicamente, la secuencia del gen que codifica para la VCP1 (EU266590) indicó que el sitio activo era similar al de otros aislados procedentes de nematodos formadores de agallas, en lugar de aislados de nematodos del quiste, con ácido glutámico en la posición 171 y glicina en la posición 208 en la proteína. Sin embargo, hubo 71 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y 19 diferencias de aminoácidos en comparación con P. chlamydosporia var. chlamydosporia aislado 10 (AJ427460) en contraste con los 15 SNP, y las diferencias de 4 aminoácidos observados, al compararse las secuencias de VCP1 de seis aislados de P. chlamydosporia var. clamidosporia. Las regiones ITS 1 y 2 de P. chlamydosporia var. catenulata 392 IMI SDF 187), EU266591, mostraron una identidad casi completa con otras secuencias ITS de P. chlamydosporia var. catenulata en la base de datos GenBank en NCBI (AJ292398; AJ392399) difiriendo solamente en una base en ITS 2. La secuencia del gen 5.8S (situado entre ITS 1 e ITS 2) resultó casi idéntica a la de P. chlamydosporia var. catenulata cepa CBS 504.66 (AJ292398) que a IMI 331575 (AJ292399) la única secuencia ITS de otra cepa de P. chlamydosporia var. catenulata en GenBank en el momento de escribirse el artículo referido en este trabajo. Además, hubo diferencias de 18 nucleótidos cuando las regiones ITS y 5.8S de P. chlamydosporia var. catenulata 392 se compararon con la región correspondiente de P. chlamydosporia var. clamidosporia aislado 10 (AJ291800) (2222. Atkins SD, Peteira B, Clark IM, Kerry BR, Hirsch PR. Use of real-time quantitative PCR to investigate root and gall colonization by co-inoculated isolates of the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia. Ann Appl Biol. 2009; 155:143-152. https://doi.org/10.1111/j.1744-7348.2009.00333.x).

Inducción de enzimas extracelulares con huevos de Meloidogyne incognita y de Globodera pallida como agentes inductores

La cepa IMI SD 187 sobresalió, respecto a las otras cepas, por poseer altos niveles de esterasas y proteínas totales, en el medio basal y suplementado con huevos de M. incognita. Al analizar la cepa en el medio inoculado con huevos de su hospedante originario, se observó una relación entre el comportamiento de las enzimas estudiadas y los pasos del mecanismo de infección de los huevos por el ACB (Fig. 9)(2323. Peteira B, Estévez I, Atkins S, Hidalgo-Díaz L, Kerry B. Inducción de enzimas extracelulares con huevos de Meloidogyne incognita y de Globodera pallida. Rev. Protección Veg. 2009; 24(2): 94-101).

Además, se mostró que la cepa autóctona de Cuba fue capaz de infectar huevos de G. pallida, por lo cual puede ser utilizada también en el control de este nematodo, teniendo como base una caracterización del comportamiento enzimático de esta cepa en presencia de los dos hospedantes estudiados (2323. Peteira B, Estévez I, Atkins S, Hidalgo-Díaz L, Kerry B. Inducción de enzimas extracelulares con huevos de Meloidogyne incognita y de Globodera pallida. Rev. Protección Veg. 2009; 24(2): 94-101).

Caracterización Molecular

Se desarrollaron ensayos para la extracción de ADN a partir de muestras de suelo, con el objetivo de incrementar la eficacia de los métodos de diagnóstico basados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en inglés: Polymerase Chain Reaction), así como protocolos basados en la amplificación de los ITS y su corte con enzimas de restricción para la identificación y diferenciación rápida y certera de las dos variedades de P. chlamydosporia (2424. Atkins SD, Hidalgo-Diaz L, Kalisz H, Mauchline TH, Hirsch PR, Kerry BR. Development of a new management strategy for the control of root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) in organic vegetable production. Pest Manag Sci. 2003; 59(2):183-189. https://doi.org/10.1002/ps.603). Los cortes del fragmento amplificado con la enzima HinF1 generaron en la variedad chlamydosporia, bandas del tamaño de 270, 220, 90 y 50 pb (Línea 2) y en la var. catenulata de 270, 180, 90 y 50 pb (Líneas 4, 6 y 7). Las cepas de la var. catenulata biotipo A (Líneas 3 y 5) generaron bandas similares a las generadas por la var. chlamydosporia (Fig. 10)(2525. Atkins SD, Hidalgo-Diaz L, Clark IM, Morton CO, Montes de Oca N, Gray PA, et al. Approaches for monitoring the release of Pochonia chlamydosporia var. catenulata, a biocontrol agent of root-knot nematodes. Mycol. Res. 2003; 107 (2): 206-212. https://doi.org/10.1017/S095375620300724X).

El análisis de RFLP del producto PCR-ITS logró distinguir a los aislamientos de P. chlamydosporia var catenulata, de aislamientos del biotipo A de la misma variedad y de la var. chlamydosporia (2525. Atkins SD, Hidalgo-Diaz L, Clark IM, Morton CO, Montes de Oca N, Gray PA, et al. Approaches for monitoring the release of Pochonia chlamydosporia var. catenulata, a biocontrol agent of root-knot nematodes. Mycol. Res. 2003; 107 (2): 206-212. https://doi.org/10.1017/S095375620300724X).

Desarrollo de cebadores específicos para catenulata

La identificación inequívoca entre las dos variedades chlamydosporia y catenulata, se logró a través una pareja de cebadores específicos, generando un producto simple de PCR de aproximadamente 352 pb (22). El cebador desarrollado solo detectó los productos generados a partir del ADN extraído de los aislados de P. chlamydosporia var. catenulata, y no fue generada banda a partir de ningún otro hongo de las 21 muestras que se analizaron (Tabla 1).

A pesar de los avances alcanzados en la caracterización de la cepa seleccionada, aún no se lograba diferenciar entre el aislamiento seleccionado y aislamientos de la misma variedad, estrechamente relacionados por su origen. Por consiguiente, Arévalo (1111. Arévalo J. Avances en la caracterización de la cepa IMI SD 187 de Pochonia chlamydosporia var. catenulata (Kamyschko ex Barron y Onions) Zare y Gams y mejoras productivas del bionematicida KlamiC®. Rev. Protección Veg. 2013; 28(1): 80.) se propuso profundizar en la diversidad molecular de P. chlamydosporia con el uso de PCR-RAPD (del inglés Random Amplified Polymorphic DNA: Polimorfismo del ADN amplificado al azar) y 19 cebadores aleatorios. El estudio se realizó sobre 16 cepas de P. chlamydosporia, obtenidas de colecciones de referencia de diferentes regiones del mundo.

Se detectó un polimorfismo con niveles de variabilidad entre 0,7 y 14,2 % , entre las cepas de P. chlamydosporia evaluadas. A partir de una distancia de 0,65; se formaron seis agrupaciones, dos de ellas se distribuyeron en la mayoría de los aislados en estudio (Fig. 11). Las cepas más próximas a la seleccionada (IMI SD187) fueron, precisamente, las de la var. catenulata originarias de Cuba. La cepa Cvc127, originaria de la provincia de Guantánamo, fue la de mayor similitud con el 60 %, aproximadamente.

Cuatro de los cebadores RAPD evaluados (A04, M10, M20 y K01) permitieron la obtención de fragmentos específicos para la cepa IMISD 187. De ellos, el K01 evidenció una mayor separación de esta cepa entre otras, estrechamente relacionadas con un índice de similaridad de 0,45 respecto a la cepa más cercana (Cvc 127). En la Figura 12 se muestra, de manera esquemática, el tamaño de los fragmentos del perfil generado por la amplificación con este marcador para la cepa. Las bandas de 330 y 160 pb fueron específicas de la cepa IMI SD187. Por esta razón, se considera que estas podrían ser útiles para el diseño de marcadores de secuencia caracterizada (SCAR) (1111. Arévalo J. Avances en la caracterización de la cepa IMI SD 187 de Pochonia chlamydosporia var. catenulata (Kamyschko ex Barron y Onions) Zare y Gams y mejoras productivas del bionematicida KlamiC®. Rev. Protección Veg. 2013; 28(1): 80.).

De esta forma, se confirmó la singularidad de la cepa seleccionada en Cuba, y se justifica el desarrollo de una tecnología para su producción masiva y la obtención de un producto microbiano para el manejo de nematodos formadores de agallas del género Meloidogyne.

Estandarización de la PCR en Tiempo Real para el monitoreo de Pochonia chlamydosporia var. catenulata en muestras de suelo

En un experimento de parcelas, después de aplicada la cepa IMI SD 187, se constató que solo esta cepa se encontraba en las muestras de suelo analizadas. Se utilizaron los cebadores CATrtF y CATrtR, los cuales, por amplificación, generaron un producto PCR de 97 pb, a partir del ADN de todas las cepas de P. chlamydosporia var. catenulata. La curva estándar para P. chlamydosporia var. catenulata generada, tuvo un coeficiente de correlación lineal de r ² = 0.9979, demostrando la precisión de la cuantificación basada en la PCR. Aplicando este método, fue posible detectar concentraciones de ADN de P. chlamydosporia var. catenulata de hasta 100 fg (2626. Peteira B, Puertas A, Hidalgo-Díaz L, Hirsch P, Kerry B, Atkins S. Real-time PCR to monitor and assess the efficacy of two types of inoculum of the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia var. catenulata against root-knot nematode populations in the field. Biotecnología Aplicada. 2005; 22:261-266).

Los resultados de la siembra de las muestras de suelo en placas de medio semi - selectivo, así como los de la PCR en Tiempo Real, demostraron un incremento en abundancia del hongo, después de su aplicación como sustrato colonizado (Fig. 13 y 14). Este incremento fue significativo en las muestras tomadas, después de dos meses y en la primera cosecha (F.pr 0,03 ( 5,160 y 0,013 ( 2,152, respectivamente)) para el conteo de las UFC/g en medio semi - selectivo a partir de suelo tomado de los tratamientos con sustrato colonizado, en comparación con aquellos tratados con clamidosporas puras. Significativamente, más ADN del hongo, se detectó por la PCR en Tiempo Real en suelo tomado del tratamiento con clamidosporas puras, en comparación con el de sustrato colonizado en el momento de la inoculación (F.pr 0,012 ( 1,761) pero, después de dos meses, se detectó más ADN del hongo en el suelo tratado con sustrato colonizado (F.pr 0,001 ( 1,91) (2626. Peteira B, Puertas A, Hidalgo-Díaz L, Hirsch P, Kerry B, Atkins S. Real-time PCR to monitor and assess the efficacy of two types of inoculum of the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia var. catenulata against root-knot nematode populations in the field. Biotecnología Aplicada. 2005; 22:261-266).

Los datos de UFC/g indicaron que la cantidad de ADN del hongo aumentó después de la primera cosecha. Posteriormente, esta retornó a las cantidades de 2 a 4 pg, las cuales pudieran representar el nivel umbral de la densidad del hongo, que el suelo es capaz de mantener (2626. Peteira B, Puertas A, Hidalgo-Díaz L, Hirsch P, Kerry B, Atkins S. Real-time PCR to monitor and assess the efficacy of two types of inoculum of the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia var. catenulata against root-knot nematode populations in the field. Biotecnología Aplicada. 2005; 22:261-266).

Sistema de manejo y protección de los bancos de la cepa IMI SD 187

La cepa IMI SD 187 quedó depositada en la Colección de Recursos Genéticos del CABI con el código IMI SD 187, teniendo acceso autorizado solamente el depositor. También, se encuentra conservada y protegida en la colección de hongos nematófagos de Rothamsted (Reino Unido) y en la del CENSA. La autenticidad de la cepa se estableció durante todo el proceso de depósito, utilizando los tres niveles de identificación descritos anteriormente.

Obtención de los bancos de trabajo de la cepa

Sobre la base del sistema de control de la calidad establecido en el CENSA, y teniendo en cuenta las particularidades del proceso de conservación y producción de un agente de control biológico, se comenzó el trabajo referente a la calidad y sus indicadores en estos procesos (3535. Villoch A, Montes de Oca N, Hidalgo L, Alemán J. Sistema de gestión de la calidad. Su utilidad en la Industria de biocontrol. Rev. Protección Veg. 2003; 18(2): 85-91., 3636. Villoch A, Montes de Oca N, Hidalgo L. Elaboración de una guía de buenas prácticas para la producción de biocontroles. Rev. Protección Veg. 2003; 18 (2): 92-99.). Los Bancos obtenidos se lograron sin contaminantes ni antes ni después de la liofilización, cumpliendo con la exigencia de pureza para este material. La confirmación de la identidad, utilizando el cebador específico para la var. catenulata mostró una sola banda de 352 pb. Los mismos, se duplicaron, conservándolos en un refrigerador de la Unidad de Investigación Desarrollo de Controles Biológicos y bajo la salvaguarda de la colección de cepas del CENSA, como una garantía de que, ante cualquier desastre, se asegure la viabilidad de la misma.

El establecimiento del cepario de producción (banco primario de la cepa y banco de trabajo o de producción) permite que siempre se parta del mismo material, nivel de pase y condiciones de mantenimiento y conservación. Estos resultados se integran junto a la caracterización cultural y morfológica, como una herramienta para el control de la calidad de los bancos de la cepa IMI SD 187.

A partir de todos estos resultados, se demostró que la cepa IMI SD 187 de P. chlamydosporia var. catenulata cuenta con su sistema de identificación, conservación y manejo, los cuales forman parte de las especificaciones de calidad y el logro de la consistencia productiva, como primer elemento en la fabricación de un bioplaguicida microbiano (3737. Montes de Oca N, Arévalo J, Acosta N, Hidalgo L. Herramientas para el control de la calidad de la cepa IMI SD 187 de Pochonia chlamydosporia var. catenulata (Kamyscho ex Barron y Onions) Zare y W. Gams. Rev. Protección Veg. 2005; 20(2): 86-92. ).

Establecimiento de criterios básicos para la aplicación de Pochonia chlamydosporia var. catenulata como agente de control biológico de Meloidogyne incognita en cultivos hortícolas

Desde el año 2004, ya se conocía del potencial del aislado IMI SD 187 como agente de control biológico frente a esta plaga, en cultivos de hortalizas. El hongo redujo, de manera significativa, las infestaciones de nematodos cuando se aplicó en combinación con plantas pobres hospedantes del nematodo, en un sistema de rotación de cultivos (4343. Kerry B, Hidalgo-Diaz. Application of Pochonia chlamydosporia in the integrated control of root-knot nematodes on organically grown vegetable crops in Cuba. Multitrophic Interactions in the Integrated Control IOBC WPRS Bulletin 2004; 27(1): 123-126.). De ahí partieron una serie de investigaciones que condujeron al establecimiento de criterios básicos para su aplicación en campo.

Determinación de la concentración de inóculo mínima efectiva de la cepa IMI SD 187 de P. chlamydosporia var. catenulata para el control de M. incognita

Al evaluar diferentes concentraciones de inóculo de P. chlamydosporia var. catenulata, la curva de regresión lineal indicó que, con el aumento de las mismas, ocurre un incremento constante de las UFC del hongo en suelo y raíces del cultivo de tomate, lo que demostró su alto poder de colonización (4444. Puertas A, Arévalo J, Montes de Oca N, Miranda I, Hidalgo-Díaz L. Efecto de diferentes concentraciones de inóculo de la cepa IMI SD 187 de Pochonia chlamydosporia var. catenulata en el control de Meloidogyne incognita. Rev. Protección Veg. 2006; 21(2): 74-79.).

La actividad parasítica de P. chlamydosporia var. catenulata tuvo un incremento acelerado hasta que se alcanzaron niveles de colonización del hongo de 8 x 10⁴ UFC por g de suelo y 8 x 10³ UFC por g de raíz, correspondientes con una concentración de inóculo inicial de 5 000 clamidosporas. A partir de estos puntos, tiende a estabilizarse la colonización de masas de huevos y el parasitismo de huevos en rangos aproximados, de 90-100 % y de 85-95 %, respectivamente; lo que indica que concentraciones de inóculo más altas, aunque proporcionan una mayor colonización por el hongo, no favorecen un incremento notable sobre la actividad parasítica (4444. Puertas A, Arévalo J, Montes de Oca N, Miranda I, Hidalgo-Díaz L. Efecto de diferentes concentraciones de inóculo de la cepa IMI SD 187 de Pochonia chlamydosporia var. catenulata en el control de Meloidogyne incognita. Rev. Protección Veg. 2006; 21(2): 74-79.).

Entre los valores de colonización de sustrato y raíces correspondientes a concentraciones entre 1 000 y 5 000 clamidosporas por g de sustrato, ocurrió un incremento rápido de la colonización de masas de huevos y parasitismo de huevos de M. incognita por P. chlamydosporia var. catenulata. Con concentraciones de inóculo de 2 000 clamidosporas por g de sustrato, se lograron valores de parasitismo de huevos de alrededor de un 60 % con diferencias significativas, respecto al resto. Entre las concentraciones de 3 000 a 5 000 clamidosporas por g de sustrato, no se presentaron diferencias significativas en cuanto a la colonización de masas de huevos y parasitismo de huevos, en las que se alcanzaron valores superiores al 80 % y al 75 %, respectivamente (Tabla 3) (4444. Puertas A, Arévalo J, Montes de Oca N, Miranda I, Hidalgo-Díaz L. Efecto de diferentes concentraciones de inóculo de la cepa IMI SD 187 de Pochonia chlamydosporia var. catenulata en el control de Meloidogyne incognita. Rev. Protección Veg. 2006; 21(2): 74-79.).

Los resultados obtenidos demostraron que las concentraciones de inóculo mínimas efectivas para el control de M. incognita por la cepa IMI SD 187 de P. chlamydosporia var. catenulata, se encuentran entre 3 000 y 5 000 clamidosporas por g de sustrato. No obstante, se recomienda la aplicación del valor superior dentro de este rango, 5 000 clamidosporas por gramo de sustrato, en los posteriores ensayos, ya que en condiciones de campo existen múltiples factores que pueden influir de manera negativa sobre el hongo (4444. Puertas A, Arévalo J, Montes de Oca N, Miranda I, Hidalgo-Díaz L. Efecto de diferentes concentraciones de inóculo de la cepa IMI SD 187 de Pochonia chlamydosporia var. catenulata en el control de Meloidogyne incognita. Rev. Protección Veg. 2006; 21(2): 74-79.).

Efecto de dos momentos de aplicación de P. chlamydosporia var. catenulata sobre su eficacia en el control de M. incognita

La colonización del sustrato y raíces del cultivo del tomate, así como la capacidad parasítica de P. chlamydosporia var. catenulata sobre M. incognita fueron superiores con la aplicación del mismo incorporado al sustrato en el momento del transplante, con diferencias muy significativas, respecto a la incorporación en el sustrato del cepellón. No obstante, la aplicación al sustrato del cepellón permitió que los niveles de colonización de las raíces del cultivo del tomate alcanzada por P. chlamydosporia var. catenulata proporcionaran más de un 50 % de parasitismo de huevos, aspecto a tener en cuenta cuando se deseen realizar aplicaciones preventivas (4545. Puertas A, Hidalgo-Díaz L. Efecto del momento de aplicación de Pochonia chlamydosporia var. catenulata sobre su eficacia en el control de Meloidogyne incognita. Rev. Protección Veg. 2009; 24(3): 177-179.).

Efecto de diferentes fuentes de materia orgánica sobre el establecimiento de P. chlamydosporia var. catenulata en el suelo y la rizosfera de las plantas

La colonización del sustrato y la rizosfera del cultivo del tomate por la cepa IMI SD 187 de P. chlamydosporia var. catenulata, se estudió en sustratos de diferentes proporciones, compuestos por suelo, estiércol vacuno y humus de lombriz. Los niveles de colonización del sustrato y de las raíces del cultivo del tomate fueron altos en todos los tratamientos empleados, y existió la tendencia a que los mayores valores de colonización de raíces, se presentaran en aquellos abonos orgánicos y proporciones que permitieron una colonización media o menor del sustrato (4646. Puertas A, Hidalgo-Díaz L. Efecto de diferentes abonos orgánicos sobre el establecimiento de Pochonia chlamydosporia var. catenulata en el sustrato y la rizosfera de plantas de tomate. Rev. Protección Veg. 2009; 24 (3): 162-165.).

Las fuentes de materia orgánica estudiadas, se encuentran entre las más frecuentemente usadas en los sistemas intensivos de producción de hortalizas de la agricultura urbana en Cuba, donde se emplean en la conformación de canteros en cantidades superiores a 10 kg x m^2-1. Los resultados demuestran que dichas fuentes de materia orgánica pueden ser utilizadas como soporte para la aplicación de P. chlamydosporia var. catenulata, en las cantidades establecidas, por el Grupo Nacional de Agricultura Urbana con preferencia para el estiércol vacuno y el humus, dada su alta disponibilidad para los productores locales y el riesgo de fitotoxicidad de la gallinaza (4646. Puertas A, Hidalgo-Díaz L. Efecto de diferentes abonos orgánicos sobre el establecimiento de Pochonia chlamydosporia var. catenulata en el sustrato y la rizosfera de plantas de tomate. Rev. Protección Veg. 2009; 24 (3): 162-165.).

Otro experimento similar, se desarrolló con dos cepas seleccionadas de Pochonia chlamydosporia var. catenulata (IMI SD 187 y CG1006) de Cuba y Brasil, respectivamente, frente a M. enterolobii, realizado en Embrapa-Cenargen, Brasilia-DF (Brasil). En este caso, los resultados indicaron que la presencia de abono orgánico no influyó de manera significativa en la actividad de la cepa nativa, pero sí de la cepa foránea (IMI SD 187) sobre todo, en el suelo natural (4747. Arévalo J, Silva SD, Carneiro MDG, Lopes RB, Carneiro RMDG, Tigano MS, et al. Efecto de la presencia de abono orgánico sobre la actividad de Pochonia chlamydosporia var. catenulata (Kamyschko ex Barron y Onions) Zare y Gams frente a Meloidogyne enterolobii Yang y Eisenback. Rev. Protección Veg. Vol. 2012; 27(3): 167-173).

Estos resultados se corroboraron cuando se evaluó, posteriormente, el efecto de diferentes dosis de fertilización mineral, fertilización orgánica con humus de lombriz y hongos micorrízicos arbusculares (Glomus hoi-like) aplicados de manera separada o en combinación, sobre el establecimiento de la cepa IMI SD 187 de Pochonia chlamydosporia var. catenulata. El experimento se realizó en sistema de cultivo protegido, y se utilizó tomate híbrido HA-3108. El análisis mostró una relación directa entre la utilización de micorriza y humus con el número de colonias de P. chlamydosporia, en el suelo y la raíz. La fertilización mineral tuvo una relación directa con el número de colonias en la raíz e inversa con la colonización de este hongo en el suelo. Estos resultados indicaron que los tratamientos nutricionales probados favorecieron el crecimiento P. chlamydosporia (IMI SD 187) y que el efecto combinado de micorriza y humus resultó ser el más significativo (4848. Charles NJI, Arévalo J, Hernández A, Alonso NJ, Hidalgo-Díaz L. Effects of mineral, organic, and biological fertilization on the establishment of Pochonia chlamydosporia var. catenulata (Kamyschko ex. Barron and Onions) Zare & Gams in a protected crop. Rev. Protección Veg. 2015; 30(3):239-244.).

Efectividad de la aplicación de dos tipos de inóculo de Pochonia chlamydosporia var. catenulata dentro de una secuencia de cultivo para el manejo de poblaciones de Meloidogyne incognita

Interacción entre cepas de Pochonia chlamydosporia var. chlamydosporia y P. chlamydosporia var. catenulata

La PCR en tiempo real fue un método sensible y reproducible, y demostró que las raíces y agallas de los nematodos no fueron uniformemente colonizadas por el hongo. Los resultados indicaron que el aislamiento de P. chalmydosporia var. catenulata fue más abundante en raíces y huevos que el aislado de P. chlamydosporia var. chlamydosporia, pero ambos aislados infectaron, en igual proporción, los huevos del nematodo. La abundancia de cada aislado fungoso se redujo en las variantes de coinoculación, en comparación con las inoculaciones simples, pero el número de segmentos de raíces y agallas colonizadas no fue diferente, significativamente (5858. Atkins SD, Peteira B, Clark IM, Kerry BR, Hirsch PR. Use of real-time quantitative PCR to investigate root and gall colonisation by co-inoculated isolates of the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia. Ann Appl Biol. 2009; 155: 143-152. https://doi.org/10.1111/j.1744-7348.2009.00333.x).

De forma general, se demostró que es posible aplicar mezclas de cepas. Las mezclas de las cepas de las dos variedades dieron mejores resultados que aplicarlas por separado, con valores superiores en los porcentajes de infección de huevos y un alto porcentaje de agallas co - infectadas (95 %). Parece haber un efecto de sinergismo pues, aunque la cantidad de ADN recuperada en las masas de huevos es menor, el porcentaje de huevos infectados fue mayor (5757. Peteira B. Caracterización del hongo nematófago Pochonia chlamydosporia var. catenulata (Kamyscho ex Barron and Onions) Zare y Gams IMI SD 187. [Tesis en Opción al Grado Científico de Doctor en Ciencias Agrícolas]. Universidad Agraria de la Habana, Mayabeque, Cuba. 2005. 118 págs).

Modelación de la actividad parasítica de Pochonia chlamydosporia var catenulata sobre Meloidogyne incognita

El modelo muestra que P. chlamydosporia var. catenulata podría reducir las densidades del nematodo a valores tan bajos, que inducirían una extinción local de M. incognita (Fig. 21 y 22)(5959. Hidalgo-Díaz L. Investigación, desarrollo e innovación de Pochonia chlamydosporia var. catenulata: Agente de control microbiano de nematodos formadores de agallas. [Tesis en Opción al Grado Científico de Doctor en Ciencias]. Universidad Agraria de la Habana, Mayabeque, Cuba. 2013. 56 págs).

Se estableció una relación denso-dependiente entre ambos organismos, en la cual el parasitismo es una función de la densidad del hospedante y la densidad del hospedante es una función del parasitismo. El modelo es una simplificación de lo que ocurre en el suelo, y prueba que el hongo puede producir un control eficaz del nematodo.

Se propuso un modelo de estructura de fases, que representa el ciclo real del nematodo, en el cual no solo se atribuyen las pérdidas en las poblaciones del nematodo a su interacción con el hongo, sino que se atribuye la mortalidad a otras causas, y además, se tiene en cuenta la interacción con el cultivo hospedante. Este modelo mostró una tendencia a la estabilidad en una escala temporal expresada en horas. Se definieron seis generaciones en un periodo de cinco meses, con picos y fluctuaciones de densidades para cada fase del nematodo. El número total de hembras adultas apareció en más bajas densidades que los restantes estadios. Los huevos y juveniles parten de un punto inicial cero y se incrementan rápidamente, tal como ocurre en las condiciones naturales. Su densidad va luego decreciendo de manera cíclica en el tiempo, hasta alcanzar la estabilidad (5959. Hidalgo-Díaz L. Investigación, desarrollo e innovación de Pochonia chlamydosporia var. catenulata: Agente de control microbiano de nematodos formadores de agallas. [Tesis en Opción al Grado Científico de Doctor en Ciencias]. Universidad Agraria de la Habana, Mayabeque, Cuba. 2013. 56 págs).

La biomasa del hongo sufre un descenso inicial, seguido por un rápido incremento. Posteriormente, las densidades disminuyen con fluctuaciones que alcanzan la estabilidad en el tiempo, lo que demuestra la capacidad del hongo para establecerse en el suelo después de su aplicación. Se mostró una relación cíclica, representada por una curva cerrada dentro del plano que atrae a las trayectorias, acercándose cada vez más en el tiempo hacia un ciclo límite o región de equilibrio (Fig. 23). Este ciclo límite, se considera estable; el hongo ejerce control sin que se produzca el exterminio de alguna de las especies, ya que se establece el equilibrio.

Este es un método útil para el estudio de P. chlamydosporia var. catenulata, y su relación con M. incognita ya que a través del mismo se puede describir la relación entre ambos organismos, quedando demostrada su efectividad en la predicción del comportamiento de la interacción (5959. Hidalgo-Díaz L. Investigación, desarrollo e innovación de Pochonia chlamydosporia var. catenulata: Agente de control microbiano de nematodos formadores de agallas. [Tesis en Opción al Grado Científico de Doctor en Ciencias]. Universidad Agraria de la Habana, Mayabeque, Cuba. 2013. 56 págs)

Validación en áreas del Organopónico de Alamar

El primer ensayo de validación de esta estrategia, se realizó en el organopónico de Alamar, La Habana, Referencia Nacional del Movimiento de Agricultura. Se utilizaron canteros altamente infestados con M. incognita (3 J₂.g^-1 de suelo) donde, previamente, se plantó remolacha. Posterior a la aplicación del hongo (10 g. m² de sustrato colonizado) se plantaron dos cultivos pobres hospedantes de nematodos (frijol y acelga) y finalmente, un cultivo altamente susceptible (tomate) (5959. Hidalgo-Díaz L. Investigación, desarrollo e innovación de Pochonia chlamydosporia var. catenulata: Agente de control microbiano de nematodos formadores de agallas. [Tesis en Opción al Grado Científico de Doctor en Ciencias]. Universidad Agraria de la Habana, Mayabeque, Cuba. 2013. 56 págs).

Los ciclos sucesivos de frijol y acelga tuvieron un significativo efecto en la reducción de la infestación de nematodos en el suelo (Fig. 24). La aplicación del hongo tuvo un efecto adicional pequeño en estos dos primeros ciclos de cultivos pobres hospedantes de nematodo, pero previno un significativo incremento de la población de nematodos en el suelo, en el siguiente cultivo susceptible a nematodos. En los suelos no tratados, las poblaciones de nematodos se incrementaron significativamente a los niveles iniciales, después de cosechada la remolacha. El hongo se recobró en más del 70 % de las masas de huevos y huevos en las raíces de tomate a los 96 días después del tratamiento (ddt) (Fig. 25).

Estrategia de Biomanejo en Cultivos Protegidos

Se elaboró un proyecto del Programa Nacional de Ciencia y Técnica de Biotecnología Agropecuaria para el periodo 2008-2010, en el cual se evaluó la efectividad del hongo (KlamiC) en seis escenarios productivos de cuatro provincias del país.

En ensayos realizados en el Módulo Ecuador de la Empresa de Cítricos de Jagüey Grande, inicialmente se evaluó la estabilidad del hongo en las condiciones de manejo de la empresa. Posteriormente, se evaluó KlamiC en aplicaciones combinadas con Hebernem® (6060. Mena J, Pimental E, Veloz L, Hernández AT, León L, Ramírez Y, et al. Aislamiento y determinación de cepas bacterianas con actividad nematicida. Mecanismo de acción de C. paurometabolum C-924 sobre nematodos. Biotecnología Aplicada. 2003; 20(4):248-252.) durante dos ciclos de cultivo consecutivo (pepino cv. 'HA-436' y tomate cv. 'HA-3047').

En el primer ensayo, dentro de las parcelas tratadas, las poblaciones del hongo se mantuvieron estables en un rango de 2,4-2,7 x 10⁴ UFC.g^-1 de suelo hasta los 60 ddt. A partir de este momento, se observó una tendencia a disminuir las poblaciones del hongo hasta el final del cultivo (132 ddt) con 1,5 x 10⁴ UFC.g^-1 de suelo; aunque se observó un incremento de la concentración de hongo en las raíces, hasta niveles superiores a las 2,5 x 10³ UFC.g^-1 de raíz. Al extraer masas de huevos de las plantas infestadas con Meloidogyne spp., se evidenció que más del 44 % estaban colonizadas por el hongo y que el 62 % de los huevos, dentro de estas, fueron parasitados Este resultado evidenció que el hongo pasa de una actividad saprofítica en el suelo a parasítica en la raíz, en la medida que se incrementó la población de los nematodos en las raíces.

En el segundo ensayo, los resultados obtenidos demostraron que la aplicación combinada de Pochonia chlamydosporia var. catenulata (KlamiC) con HeberNem®, logró reducir los niveles de infestación de la plaga y obtener similares rendimientos, comparado con los tratamientos de Agrocelhone, a partir del segundo ciclo de cultivo.

Otras investigaciones se realizaron en el módulo de cultivos protegidos de Veguita, municipio Yara, provincia Granma, en el periodo comprendido de mayo 2009 a octubre 2011. Durante este tiempo, se establecieron seis secuencias de cultivos (pepino, tomate o pimiento) en dos unidades experimentales (casas de 540 m²) ubicadas sobre suelo aluvial. Las secuencias de cultivos fueron las siguientes: Ciclo 1, pepino 'HA 454' de Mayo 2009 a Julio 2009; Ciclo 2, tomate 'Andromeda' de Septiembre 2009 a Diciembre 2009; Ciclo 3, tomate 'FA 516' de Enero 2010 a Abril 2010; Ciclo 4, pimiento 'FAR' del 3 de Junio 2010 a Septiembre 2010; Ciclo 5, tomate 'FA 180' de Noviembre 2010 a Marzo 2011 y Ciclo 6, pepino 'INIVIT P-2007' de Agosto 2011 a Octubre 2011. En cada una de las unidades experimentales, se realizaron de forma independiente los dos tratamientos: KlamiC y HeberNem®. Se aplicó HeberNem® a razón de 1 ml.m² siete días antes del trasplante, y 14 y 35 ddt (6161. Mena J. Manual de aplicación del bionematicida HeberNem-L. Camagüey, Cuba: CIGB; 2007.). Mientras que, KlamiC, se utilizó a razón de 10 g.m² en suspensión, en el momento del trasplante.

Se constató que el índice de agallamiento en el último ciclo de cultivo fue menor donde se aplicó KlamiC, respecto a HeberNem®. KlamiC, logró índice de agallamiento proyectado de cero en solo 37 meses; mientras que, el de HeberNem® fue de 53 meses. La intensidad y distribución de M. incognita, en ambos tratamientos, tuvo una tendencia a decrecer en el transcurso del tiempo, pero en la última evaluación, KlamiC, tuvo una respuesta más favorable.

Otros estudios realizados encaminados a la aplicación de Klamic como bioproducto en diferentes condiciones y para otros usos diferentes de su capacidad como hongo nematofago

Una serie de experimentos se encaminaron a la posibilidad de la aplicación de Klamic en suelo con elevado grado de salinidad. Los ensayos in vitro para el análisis de la tolerancia de la cepa IMI SD 187 frente a diferentes concentraciones salinas (2dS.m^-1, 4dS.m^-1, 6dS.m^-1, 8dS.m^-1, 10dS.m^-1, 12dS.m^-1, 14dS.m^-1 y 16dS.m^-1 de NaCl) demostraron, que las clamidosporas fueron más tolerantes que los conidios, con inhibición de 50 % de la germinación a 13dS.m^-1 y 12dS.m^-1, respectivamente (6262. Ceiro WG, Arévalo J, Puertas A, Hidalgo-Díaz L. Tolerancia de Pochonia chlamydosporia var. catenulata (Kamyschko ex Barron y Onions) Zare y W. Gams a diferentes niveles de cloruro de sodio. Rev. Protección Veg. 2013; 28(3): 70-73.).

En los siguientes ensayos se analizó el efecto de diferentes concentraciones de NaCl (40, 80, 120 y 160 mmol.L-1) in vitro (medio PDA) y en suelo, sobre el crecimiento micelial y la esporulación. In vitro, la menor inhibición se obtuvo a la concentración de 40 mmol.L-1 de NaCl (6,55 % del área de la colonia y 21,57 % en la esporulación). El tratamiento de 160 mmol.L-1 causó las mayores afectaciones, con valores de 51,35 % y 85,17 %, respectivamente. En el ensayo en suelo, la menor inhibición del área de la colonia 11,59 % se alcanzó con la concentración de 40 mmol.L-1 y la mayor 33,50 % se constató a 160 mmol.L-1 (6363. Ceiro WG, Arévalo J, Puertas A, Hidalgo-Díaz L. Efecto de concentraciones de NaCl sobre el crecimiento micelial y la esporulación de Pochonia chlamydosporia (Goddard) Zare y Gams en medio PDA y suelo. Rev. Protección Veg. 2014; 29(2): 122-127.). Estos resultados sirvieron de base para el análisis del efecto de la salinidad en la interacción del hongo sobre M. incognita, en el cultivo del tomate como hospedante. Los resultados obtenidos demostraron que la cepa IMI SD 187 colonizó la raíz en un rango de 1,9-4,2 x 103 UFC, registró una población en el suelo de 1,5-3,3 x 104 UFC, parasitó 63 % de huevos y colonizó 80 % de masas de huevos de M. incognita, en presencia de la concentración de NaCl utilizada (6464. Hidalgo-Díaz L, Ceiro WG. Interacción entre Pochonia chlamydosporia var. catenulata (Kamyschko ex Barron y Onions) Zare y Gams y Meloidogyne incognita (Kofoid y White) Chitwood en tomate en presencia de NaCl. Rev. Protección Veg. 2017; 32(1): 76-81.).

El tipo de suelo también fue objeto de estudio, especialmente por las características propias de los mismos y en particular, por el pH y su posible efecto sobre el establecimiento del hongo. De esta forma, se evaluaron in vitro tres tipos de suelos agrícolas cubanos de los tipos Ferralítico, Fluvisol y Pardo, utilizando la técnica suelo-membrana. Se demostró que, P. chlamydosporia var. catenulata creció y produjo clamidosporas en todas las condiciones edáficas evaluadas, no obstante, el mayor crecimiento se registró en los suelos Fluvisol y Ferralítico, comparado con el Pardo. Este resultado sugirió, que las mayores poblaciones microbianas nativas y el pH ácido presente en el suelo pardo, pudieron afectar el crecimiento de este hongo. Se confirmó que la especie fúngica nematófaga P. chlamydosporia var. catenulata posee capacidad de adaptación, persistencia y multiplicación en diferentes suelos, y se sugiere su utilización en los suelos fluvisol, ferralítico y pardo, siempre que no presenten un pH ácido ≤ 4,17 (6565. Ceiro-Catasú WG, Hidalgo-Viltres M, Hidalgo-Díaz L, Arévalo-Ortega J, García-Bernal M, Mazón-Suástegui JM. Establecimiento in vitro del hongo nematófago Pochonia chlamydosporia var. catenulata en diferentes suelos. Terra Latinoamericana 39:1-7. e792. https://doi.org/10.28940/terra.v39i0.792 2021).

Otro aspecto importante, es el efecto que pueden tener sobre Pochonia chlamydosporia diferentes plaguicidas y bioestimulantes, por lo cual pueden ser utilizados dentro de las estrategias de manejo diseñadas para plagas en las que se utiliza también este agente de control biológico. Por estas razones, se evaluaron el crecimiento micelial y la producción de clamidosporas, frente a un grupo de estos químicos y bioactivos. La germinación de clamidosporas fue superior al 50 % con los tratamientos control, FitoMas E, Biobras-16 y Amidor. El crecimiento fúngico se potenció con Biobras-16 al 106,23 %, lo promovieron entre un 50-100 % el control, FitoMas E y Cuproflow. La producción de clamidosporas se estimuló con Cipermetrina, Benomilo, Zineb, Mitigan, Karate, FitoMasE y Amidor. Fueron compatibles con P. chlamydosporia: Cipermetrina, Karate, Amidor, Benomilo, Zineb, Mitigan y FitoMas E (6666. Ceiro WG, Arévalo J, Hidalgo-Díaz L. Efectos de plaguicidas y bioestimulantes vegetales sobre la germinación de clamidosporas y el desarrollo in vitro del hongo nematófago Pochonia chlamydosporia. Rev Iberoam Micol. 2015; 32(4):277-280. https://doi.org/10.1016/j.riam.2014.07.008).

El efecto de P. chlamydosporia (IMI SD 187) sobre semillas de tomate del cultivar 'Vyta', fue similar al comportamiento observado en el control sin inocular. No obstante, con relación a la variable altura de las plántulas, a los 20 y 25 días, se encontraron diferencias significativas (p≤0,05) correspondiendo el menor crecimiento donde fue inoculado el hongo, lo que pudiera estar relacionado con la respuesta de las plántulas, frente a la presencia del hongo en su sistema radical (6767. Ceiro W, Puertas A, Arévalo J, Hidalgo-Díaz L. Efectos de la aplicación de Pochonia chlamydosporia var. catenulata Kamyscho ex Barron y Onions (Zare y Gams) sobre el desarrollo de plántulas de tomate (Solanum lycopersicum L.). Rev. Protección Veg. 2011; 26(2): 118-121).

El recubrimiento de las semillas de frijol del cultivar 'Cuba Cueto 25-9' N con esporas de P. chlamydosporia (IMI SD 187) con una concentración de 1,5 x 107 clamidosporas.g-1 y 10 % de arcilla, tuvo un efecto positivo sobre la velocidad de germinación, longitud de la radícula y el hipocotilo, diámetro del hipocotilo y la masa fresca de la plántula, así como el número de raíces secundarias. Cuando las semillas se recubrieron y se realizó una aplicación de P. chlamydosporia cinco días después de la siembra, a los siete días se observó 100 % de germinación de las semillas, dos días antes que los tratamientos T1 (control sin Pochonia), T2 (Pochonia en recubrimiento a las semillas) y T3 (Pochonia en suspensión). Se observó una tendencia al incremento en los parámetros: número de hojas trifoliadas, longitud del tallo, masa fresca y seca aérea, y masa fresca de raíz, en diferentes tratamientos con el hongo, respecto al control (6868. Arévalo J, Hernández MÁ, Lamz A, Montes de Oca N, Hidalgo-Díaz L. Efecto de Pochonia chlamydosporia var. catenulata (Goddard) Zare y Gams como endófito facultativo en frijol (Phaseolus vulgaris L.). Rev. Protección Veg. 2019; 34(2): 1-10).

Otra investigación estuvo dirigida a determinar la actividad endofítica de Pochonia chlamydosporia var. catenulata cepa IMI SD 187 (KlamiC®) y su efecto en la promoción del crecimiento de vitroplantas de plátanos y bananos. Se utilizaron los cultivares ‘CEMSA –’ (AAB), ‘Pisang Ceilan’ (AAB), ‘FHIA-01’ (AAAB) y ‘FHIA-18’ (AAAB). Las vitroplántulas se trasplantaron a bandejas de polipropileno y bolsas de polietileno negro, con sustrato de estiércol vacuno, y posteriormente se distribuyeron, de manera aleatoria, en el área de aclimatización. Se efectuaron dos aplicaciones de KlamiC® (5,6 x 10⁵ clamidosporas.vitroplanta^-1). Los autores observaron un incremento significativo del crecimiento de las vitroplantas tratadas con KlamiC®, en comparación con los controles. El hongo colonizó el sustrato y la rizosfera de las vitroplantas, con menor porcentaje en el cultivar ‘FHIA-18’ (AAAB) con 4,15 % (6969. Hernández MA, Arévalo J, Marrero D, Hidalgo-Díaz L. Efecto de KlamiC® en la estimulación del crecimiento de vitroplantas de plátanos y bananos. Cultivos Tropicales. 2016; 37(4): 168-172).

Posteriormente, se evaluó la combinación in vitro y ex vitro de P. chlamydosporia (IMI SD 187) y Trichoderma asperellum (Ta. 13) en la aclimatización de vitroplantas del banano de cocción del tipo Bluggoe (AABB) ‘FHIA-03’. La compatibilidad in vitro se determinó mediante la competencia por espacio (crecimiento radial) y el porcentaje de inhibición del crecimiento a las 24, 48 y 120 h en Cultivo Dual. Posteriormente, se evaluó la aplicación de estos hongos de manera independiente o en combinación, durante la fase de adaptación ex vitro de vitroplantas, y un control sin aplicación; en total 12 tratamientos. Las vitroplantas se plantaron en bandejas de polipropileno de 70 alvéolos con sustrato: suelo ferralítico rojo lixiviado y cachaza (1:3 v/v). P. chlamydosporia cepa IMI SD 187 (Bionematicida KlamiC®) se aplicó con T. asperellum cepa Ta.13 (Biofungicida SevetriC) mediante inmersión de raíces, previo al trasplante o por aspersión, a los 3 y 20 días posteriores al trasplante. In vitro, T. asperellum creció más rápido que P. chlamydosporia, pero no hubo contacto hifal directo entre ambos hongos. A los 30 días P. chlamydosporia colonizó el sistema radical y la rizosfera de las vitroplantas, cuando se aplicó de forma independiente y en combinación con T. asperellum y ambos hongos, promovieron el crecimiento vegetal. Los resultados indicaron que P. chlamydosporia y T. asperellum son buenos candidatos para estrategias de biomanejo en banano (7070. Arévalo Ortega J, Martínez Cocai B, Hernández Socorro MA, Alfonso de la Cruz R, Ynfante Martínez D, Hidalgo-Díaz L. Efecto de la aplicación conjunta de Pochonia chlamydosporia (Goddard) Zare y Gams y Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt y Nirenberg en vitroplantas de banano (Musa sp.). Rev. Protección Veg. 2021; 36(1): 1-10).

En el marco del proyecto MUSA, también se obtuvieron avances en el tema de las preformulaciones del ACB, y se realizaron estudios sobre el uso de aceites esenciales, sustancias tenso activas y soportes sólidos (resultados no mostrados) todo lo cual contribuye a un producto de mayor calidad y mayor tiempo de vida en anaquel.

Muchos de estos resultados se incluyeron en algunos libros que tratan sobre el tema de Pochonia chlamydosporia, como agente de control biológico de nematodos fitoparásitos

También, como parte de las investigaciones se originaron un número importantes de Tesis Doctorales:

El camino transitado por el equipo de investigación /desarrollo de KlamiC®, trazó pautas en estudios de otros ACB en en Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria y su divulgación, a través de este artículo, podrá contribuir a otros estudios en el país y la región.