Determinación de la actividad antifúngica in vitro del EEPP

Para el estudio de la actividad antifúngica in vitro se utilizaron aislados puros monopóricos de P. psidii, G. psidii y Colletrotrichum spp. obtenidos de frutas de guayabas con síntomas de antracnosis, pudrición estilar y pudrición por Phyllosticta, y conservados en el laboratorio de microbiología del IIFT.

El EEPP a 100 y 500 ml. L^-1 se añadieron en erlenmeyers con 50 ml de medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) (BioCen, Cuba) previamente licuado y enfriado a temperatura ambiente. El medio PDA se extendió en placas Petri (100 x 20 mm) (cinco réplicas por tratamientos) y después de solidificado se inocularon, central e individualmente, con un disco micelial de 0,5 cm de Ø, tomado de la periferia de las colonias, a partir de cultivos puros con siete días de crecimiento sobre PDA. Se utilizó un control sin aplicación y otro con etanol (70 %).

Las placas se sellaron con parafilm e incubaron a 27°C ± 1°C durante siete días. La actividad inhibitoria del EEPP se determinó midiendo el diámetro de crecimiento de las colonias (cm) en forma diagonal, con ayuda de una regla graduada acrílica. Se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento (PIC) de las colonias según la fórmula de Rodríguez y Flores (1111. Rodríguez IC, Flores J. Capacidad antagónica in vitro de Trichoderma spp. frente a Rhizoctonia solani K. y Fusarium verticillioides N. Bioagro. 2018; 30(1):49-58.
):

Donde:

Determinación del efecto del EEPP para el control de las enfermedades y su impacto en la calidad de las frutas

Para el estudio se recolectaron frutas en grado de madurez fisiológica (el color verde se vuelve menos intenso, de manera general, en todo el exocarpio y la firmeza es mayor), según lo establecido en el instructivo técnico del cultivo (33. Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical (IIFT). Instructivo técnico para el cultivo de la guayaba. Editorial Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical. 2023. 105 pp.
), de una plantación de 4 años ubicada en la Empresa Cítricos Ceiba perteneciente a la provincia de Artemisa (22º55´ N y los 82º40´ O) y donde no se aplicaron tratamientos fungicidas para el control de enfermedades.

Las frutas se lavaron previamente con detergente Tropicleaner 0,1 % (Lauril Éter Sulfonato de Sodio), se enjuagaron y se sometieron a la inmersión por 5 min en EEPP a 100 y 500 ml. L^-1 y un control sin aplicación. Se secaron a temperatura ambiente y se conservaron a temperatura de 18°C ± 2°C, humedad relativa 85 - 90 % (HR) durante siete días en cámara refrigerada y, al final del almacenamiento, se realizaron las siguientes evaluaciones:

La incidencia de las enfermedades pudrición estilar, pudrición por Phyllosticta y antracnosis se determinó en porcentaje de frutas afectadas, a partir del total de frutas evaluadas (10 frutas con tres réplicas). Previamente se identificaron sus síntomas según Snowdon (1212. Snowdon AI. Post-harvest diseases and disorders of fruits and vegetables. General introduction and fruits. University of Cambridge. Wolf Scientific Lid. 1990; 1: 302 pp.
) y Mulkay (11. Mulkay T. Poscosecha. En: Editorial Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical. Cultivo y Comercialización de la Guayaba. La Habana, Cuba. 2023. 253 pp.
).

La severidad de los daños en el exocarpio por pudrición estilar, pudrición por Phyllosticta y antracnosis se estableció a través del porcentaje del tejido lesionado del total de exocarpio de las frutas afectadas, utilizando una escala arbitraria de cinco grados donde: Grado 0 (frutas sin daños), Grado 1 (frutas con 1 - 10 % con el exocarpio afectado), Grado 2 (frutas con 11 - 25 % con el exocarpio afectado), Grado 3 (frutas con 26 - 35 % el exocarpio afectado), Grado 4 (frutas con 36 - 50 % el exocarpio afectado). Se calculó la severidad en función del índice de infección descrito por McKinney (1313. McKinney HH, Davis RJ. Influence of soil temperature and moisture on infection of wheat seedlings by Helmintosporium sativum. J. Agric. Res. 1923; 31(9):827-840.
).

Al inicio, a los cuatro y siete días de conservadas las guayabas, se tomaron muestras de frutas de manera individual y se evaluaron los siguientes parámetros físico- químicos.

Análisis estadísticos

Los datos obtenidos se sometieron a análisis de varianza y las medias se compararon por la Prueba de Tukey (p ≤ 0,05) del paquete estadístico STATISTICA, Versión 7.0.

Determinación actividad antifúngica in vitro del EEPP

El EEPP mostró actividad antifúngica diferenciada sobre los tres hongos (Fig. 1A). El crecimiento de P. psidii disminuyó significativamente a 500 ml.L^-1 en comparación con el EEPP a 100 ml. L^-1 y los controles. La colonia de G. psidii creció 2,12 cm y 1,93 cm a 100 y 500 ml.L^-1 respectivamente, sin diferencias estadísticas con los controles. El hongo Colletotrichum spp. presentó una reducción reveladora del crecimiento con el EEPP a 100 y 500 ml.L^-1. Se pudo constatar que el etanol no influyó en el crecimiento de los tres patógenos, por lo que la actividad antifúngica observada es atribuible al propóleo y no al extractante.

En término del porcentaje de inhibición del crecimiento (Fig. 1B), el EEPP a 100 y 500 ml.L^-1 resultó más revelador para el Colletotrichum spp. con más del 70 %. A la concentración de 500 ml.L^-1, P. psidii presentó un valor significativo (52 %) en comparación al observado a 100 ml.L^-1. El hongo G. psidii mostró los menores porcentajes, sin diferencias significativas entre las dos concentraciones. Diversas investigaciones indicaron la acción inhibitoria de los EP en el crecimiento de diferentes hongos fitopatógenos causantes de pudriciones en las frutas (77. Urrea I, Arismendi N, Sepúlveda X, Gerding M, Vero S, Vargas M. Antifungal activity of propolis extracts against postharvest pathogen Phlyctema vagabunda. Rev. Agronomy. 2023;104 (13): 2-14. http://doi.org/10.3390/agronomy13010104
, 1515. Dudoit A, Cardinault N, Mertz C, Chillet M, Brat P. Antifungal activities of propolis and its main components with an emphasis against phytopathogenic fungi. J. APIC. SCI. 2021; 65(1):5-24. http://doi.org/10.2478/JAS-2021-0013
). Cupull et al. (1616. Cupull R, Cortés R, Olazábal E, Hernández C. Actividad antifúngica de propóleos obtenidos en tres provincias de Cuba sobre hongos contaminantes en cultivo de tejidos vegetales. Universidad de Guanajato. Acta Universitaria. 2013; 23(6):3-9.
) demostraron la inhibición del crecimiento hasta 32 mm de Colletotrichum spp. con EEP (400 mg.L^-1) obtenidos de tres provincias de Cuba. Por otro lado, Pereira et al. (1717. Pereira L, Pereira de Menezes A C, Frederico de Souza C, Abadia M. Efeito fungicida agrícola do extrato de própolis de Tetragonisca angustula Latreille, 1811. Brazilian Journal of Science. 2023; 2(11):65-7. http://doi.org/10.14295/bjs.v2i11.411
) revelaron que concentraciones inferiores a 200 µl.ml^-1 no inhibieron el crecimiento de las colonias de Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. y Colletotrichum acutatum J.H. Simmonds, siendo la concentración de 500 µl.ml^-1 la más efectiva. En cuanto a los resultados obtenidos con P. psidii en presencia del EEPP, fueron similares a los alcanzados por Quiroga et al. (1818. Quiroga EN, Sampeiro DA, Soberón JR, Sgariglia MA, Vattuone MA. Propolis from the northwest of Argentina as a source of antifungal principles. Journal of Applied Microbiology. 2006; 101: 103-110. http://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2006.02904.x
) para Phomopsis spp., donde destacó la sensibilidad del hongo a 16 mg.ml^-1 de extracto de propóleo parcialmente purificado. Para G. psidii aislado de frutas de guayabas no existen otras evidencias que respalden la actividad inhibitoria del EP.

Las diferencias en la actividad antifúngica, por efecto de concentración, posiblemente estén asociadas a la presencia de un mayor contenido de los metabolitos bioactivos del tipo diterpénico, flavonoide y fenólico en el extracto de propóleo, los cuales se relacionan con el origen botánico y de la zona geográfica de obtención del producto (1717. Pereira L, Pereira de Menezes A C, Frederico de Souza C, Abadia M. Efeito fungicida agrícola do extrato de própolis de Tetragonisca angustula Latreille, 1811. Brazilian Journal of Science. 2023; 2(11):65-7. http://doi.org/10.14295/bjs.v2i11.411
, 1919. Manzo-Sánchez G, Pérez-Ocón P, Chan-Cupul W, Silva-Jiménez E, Sánchez-Rangel J C, Ayala-Zermeño M A, et al. Actividad antifúngica de extractos etanólicos de propóleos contra Mycosphaerella fijiensis: un estudio in vitro. Scientia Fungorum. 2018; 47: 13-24.
). La pinocembrina es un tipo de flavonoide identificado en los EP y su modo de acción es la inhibición de la respiración de las células de las hifas, lo que causa un déficit de energía y daños en la membrana celulares de los hongos (2020. Peng L, Yang S, Chen Y, Chen F. Antifungal activity and action mode of pinocembrin from propolis against Penicillium italicum. Food Science and Biotechnology. 2012; 21(6):133-1534. http://doi.org/10.1007/s10068-012-0204-0
).

De manera general, se observó variabilidad en cuanto a la actividad inhibitoria del EEPP sobre el crecimiento de los tres hongos, que puede constituir un punto de partida para conocer su posible potencial antimicrobiano sobre la versatilidad de patógenos fungosos que afectan a las guayabas durante la poscosecha.

Determinación del efecto del EEPP para el control de las enfermedades y su impacto en la calidad de las frutas

Las guayabas tratadas con EEPP a 500 ml.L^-1 mostraron una disminución significativa de la incidencia por antracnosis en relación al control (Fig. 2A). La pudrición estilar incidió en más de un 18 % y la pudrición por Phyllosticta superior a 35 % en las frutas con EEPP a 100 y 500 ml.L^-1, sin diferencias estadísticas con el control.

La severidad de los daños por la pudrición estilar y pudrición por Phyllosticta no difirió estadísticamente entre las frutas con EEPP a 100 y 500 ml.L^-1, y el control (Fig. 2B). El índice de infección de la pudrición estilar no superó el 10 % de la superficie del exocarpio y para la pudrición por Phyllosticta fue mayor al 20 %, lo cual indica su grado de afectación en la superficie del exocarpio de las guayabas. En cambio, el índice de infección por antracnosis presentó valores significativamente inferiores al 10 % a 100 y 500 ml.L^-1. Estos resultados son similares a los obtenidos por El-Gawad (2121. El-Gawad M. Influence of propolis extract and oxalic acid on preserving quality of guava fruits during postharvest cold storage. Plant Archives. 2021; 21, Supplement 1: 127-138. http://doi.org/10.51470/PLANTAARCHIVE.2021.v21.S1.024
) en frutas de guayabas ʻMaamouraʼ tratadas con EEP (2 %) y EEP (4 %) y conservadas a temperatura de 7°C ±1°C y 90 % ± 5 % de HR.

Otros resultados demostraron la acción de los extractos de propóleo en la incidencia y severidad de las pudriciones en las frutas. En manzanas (Malus dosmestica Borkh) cv. ‘Cripps Pink’ causó una disminución de la incidencia y severidad de 57,1 % y 63,1 %, respectivamente, por Phlyctema vagabunda (77. Urrea I, Arismendi N, Sepúlveda X, Gerding M, Vero S, Vargas M. Antifungal activity of propolis extracts against postharvest pathogen Phlyctema vagabunda. Rev. Agronomy. 2023;104 (13): 2-14. http://doi.org/10.3390/agronomy13010104
) y en peras (Pyrus communis L.) disminuyó en un 25 % la incidencia de la enfermedad por Stemphylium vesicarium (Wallr.) Simmons (2222. Loebler M, Sánchez C, Muchagato E, Diogo E, Santos M, Vasilenko P, et.al. Potential application of propolis extracts to control the growth of Stemphylium vesicarium in “Rocha” pear. Appl. Sci. 2020; 10: 1990. http://doi.org/10.3390/app10061990
).

En general, se evidenciaron diferencias en cuanto a la actividad de control del EEPP sobre las enfermedades de las guayabas, lo cual significa un espacio para realizar posteriores estudios en el tipo de aplicación y concentración del extracto, que permita el desarrollo de un biofungicida de uso agrícola con un amplio espectro para la disminución de la incidencia y severidad de las enfermedades poscosecha.

La pérdida de masa fresca aumentó con el tiempo de conservación y, de manera normal, como consecuencia a los procesos metabólicos activos de la respiración y la transpiración de las frutas (Fig. 3A). En las guayabas con EEPP a 500 ml.L^-1 esta variable fue menor, difirió estadísticamente del control a los 4 días de almacenadas las frutas; está diferencia se mantuvo hasta los 7 días, al igual que, para las frutas tratadas con el EEPP a 100 ml.L^-1. Estos resultados concuerdan con los hallazgos de El-Gawad (2121. El-Gawad M. Influence of propolis extract and oxalic acid on preserving quality of guava fruits during postharvest cold storage. Plant Archives. 2021; 21, Supplement 1: 127-138. http://doi.org/10.51470/PLANTAARCHIVE.2021.v21.S1.024
) para guayabas cv. ʻMaamouraʼ tratadas con EEP al 2 % y 4 % y conservadas a temperatura de 7°C ±1°C y 90 % ± 5% de HR. En otras frutas como el aguacate, el estudio de Daiuto et al. (2323. Daiuto E, Minarelli P, Vieites R, Orsi R. Própolis e cera vegetal na conservação de abacate Hass. Semina: Ciências Agrárias. 2012; 33 (4):1463-1474. http://doi.org/10.5433/1679-0359.2012v33n4p1463
) evidenció que el empleo de EEP (2 %) produjo pérdidas de masa fresca significativamente menores (~ 9 %) en comparación con el control (~ 14 %). Los EP conducen a la acumulación de biopelículas que crean un nicho herméticamente sellado que mejora las barreras de permeabilidad a los gases y actúa como defensa física reduciendo la permeabilidad al oxígeno, dióxido de carbono y vapor de agua, retardando las reacciones metabólicas asociadas con la maduración fisiológica e inhibiendo la interacción enzimática, preservando su textura y sabor (2424. Montes A, Oropeza R, Padrón C. Películas biodegradable con propiedades activas. Revista Venezolana de Ciencia y Tecnología. 2017; 8(1): 58-89. Disponible en: https://sites.google.com/site/1rvcta Acceso: 2024- 10- 4.
, 2525. Aguilar J, García I, Quiróz J. Alargamiento de la vida anaquel de las frutas por el uso de biopelículas. Revista Boliviana de Química. 2020; 31(1): 40-45. http://doi.org/10.34098/2078-3949.37.1.6
).

El EEPP a 100 y 500 ml.L^-1 no afectó el color del exocarpio de las guayabas (Fig 3B), el IC* evolucionó a números positivos a los 7 días y sus valores fueron de 1,08; 1,53 y 1,38 a 100 ml.L^-1, 500 ml.L^-1 y control, respectivamente. De acuerdo con Machado-Molina et al. (1414. Machado-Molina M, García-Pereira A, Machado- García N. Propuesta de rangos de índice de color según estados de maduración en frutas. Revista Ciencias Técnicas Agropecuarias. 2019; 28(4):19-27. Disponible en: http://opn.to/a/RYhSJ. Acceso: 2024- 10- 4.
), el IC* de una fruta entera puede variar a lo largo de toda su superficie debido a la aparición de vetas propias del proceso de maduración, de ahí que sea conveniente establecer rangos de IC* según los estados de madurez informados por la norma que se utilice como referencia. Por lo que, el día 0 y a los 4 días de conservación, las guayabas con EEPP y control clasificaron en el rango de IC* de -7 < IC* ≤ -1 y estado de maduración de pintona o mediamente madura (color verde a amarillo del exocarpio) y para el día 7 se catalogaron en el rango de -1 < IC* ≤ 1,9 y estado de maduración de madura (amarilla con incipiente color verde en el exocarpio).

La firmeza del mesocarpio disminuyó durante el tiempo de almacenamiento (Fig. 3C), este indicador evolucionó de manera típica en relación al proceso de maduración. Criterio que coincide con Mulkay et al. (2626. Mulkay T, Suárez M, Paumier A. Indicadores de calidad de la guayaba ‘Enana Roja Cubana E.E.A 18-40’ durante la conservación poscosecha. Centro Agrícola. 2020; 47(4):73-80.
) para guayabas de este cultivar. El EEPP a 100 y 500 ml.L^-1 no influyó en la retención de esta variable durante el período de conservación de las guayabas. Resultado que no coincide con los obtenidos por Botia y Koop (2727. Botia L, Koop E. Comparación de las propiedades colorimétricas en guayaba con aplicación de recubrimientos. Revista UPTCV. 2018;12-27. Disponible en: https://rdigitales.uptc.edu.co/memorias/index.php/8_enc_cien/8_fac_cien/paper/view/2095. Acceso: 2024- 10- 4.
) con la aplicación de un recubrimiento, a base de propóleo, en guayabas almacenadas durante 8 días y por El-Gawad (2121. El-Gawad M. Influence of propolis extract and oxalic acid on preserving quality of guava fruits during postharvest cold storage. Plant Archives. 2021; 21, Supplement 1: 127-138. http://doi.org/10.51470/PLANTAARCHIVE.2021.v21.S1.024
) para guayabas cv. ʻMaamouraʼ tratadas con EEP al 2 % y 4 %, y conservadas a temperaturas de 7°C ± 1°C y 90 % ± 5 % de HR. Estas diferencias pueden estar asociadas a la temperatura de conservación a que fueron sometidas las frutas y al tipo de EP.

Los SST aumentaron en las frutas con EEPP y control (Fig. 4A), tendencia de evolución normal con el avance del proceso de maduración, debido a la hidrólisis de diversos polisacáridos estructurales tales como almidón, pectinas de la pared celular, hasta sus componentes manométricos básicos, por lo cual se acumulan azúcares, principalmente glucosa, fructosa y sacarosa que son los constituyentes principales de los sólidos solubles (2828. Arrieta A, Baquero U, Barrera J. Caracterización fisicoquímica del proceso de maduración del plátano “Papocho” (Musa ABB Simmonds). Revista Agronomía Colombiana. 2006; 24(1): 48-53. http://revista.unal.edu.co/index.php/agrocol/
). El-Gawad (2121. El-Gawad M. Influence of propolis extract and oxalic acid on preserving quality of guava fruits during postharvest cold storage. Plant Archives. 2021; 21, Supplement 1: 127-138. http://doi.org/10.51470/PLANTAARCHIVE.2021.v21.S1.024
) obtuvo resultados similares en frutas de guayabas cv. ʻMaamouraʼ tratadas con EEP a 2 % y conservadas 7°C ± 1°C y 90 % ± 5% de HR.

La acidez titulable de mesocarpio de las frutas disminuyó a medidas que pasaron los días de almacenamiento (Fig. 4B) debido al incremento de los SST según refirieron Gutiérrez et al. (2929. Gutiérrez N, Dussan S, Castro J. Fisiología y atributos de la calidad de la guayaba ʻPeraʼ (Psidium guajava L.) en poscosecha. Rev. Ing. 2012; (37):6-12. Disponible en http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=121026469008 Acceso: 2024- 09- 13.
), cambio característico de frutas climatéricas como la guayaba. EL EEPP a 100 y 500 ml.L^-1 no influyó sobre este indicador con relación al control. El-Gawad (2121. El-Gawad M. Influence of propolis extract and oxalic acid on preserving quality of guava fruits during postharvest cold storage. Plant Archives. 2021; 21, Supplement 1: 127-138. http://doi.org/10.51470/PLANTAARCHIVE.2021.v21.S1.024
) encontró que, para guayabas cv. ʻMaamouraʼ tratadas con EEP (2 %) conservadas a temperatura de 7˚C ±1˚C y 90 % ± 5% de HR, la acidez titulable no se diferenció del control.

El pH del mesocarpio en las guayabas con EEPP y control aumentó a los siete días de conservación (Fig. 4C). El incremento de este indicador, durante el proceso de maduración, se debe a que los ácidos orgánicos disminuyen, porque son utilizados como sustrato durante la respiración de la fruta. También a la reducción de la actividad metabólica, que es provocada por la menor difusión del oxígeno, asimismo ocurre con el incremento en la síntesis del contenido de aminoácidos (3030. Miranda A, Alvis A. Arrazola G. Efectos de dos recubrimientos sobre la calidad de la papaya (Carica papaya) variedad Tainung. Temas Agrarios. 2014;19(1):7- 18.
). Similares valores de pH informaron Mulkay et al. (2626. Mulkay T, Suárez M, Paumier A. Indicadores de calidad de la guayaba ‘Enana Roja Cubana E.E.A 18-40’ durante la conservación poscosecha. Centro Agrícola. 2020; 47(4):73-80.
) en frutas del cv. ʻEnana Roja Cubanaʼ a los ocho días de almacenadas a temperatura de 16ºC ± 1ºC, HR de 75 - 80 %. En algunos estudios se evidenció que el efecto del EEP no modifica cuantiosamente el valor normal del pH en frutas de aguacate (Persea americana Mill.) y bananas (Musa spp. L.) (3131. Aquino A A de, Rodríguez R da S, Donato I A, Brandão M R S, Moreira E de S, Costa M L X, et.al. Revestimento à base de amido extraído da semente de Manga Palmer com adição de extrato de própolis na conservação de Abacate Geada. Brazilian Journal of Development. 2020; 6 (9):71116-71135. http://doi.org/10.34117/bjdv6n9-526
, 3232. Awad M, Al-qurashi A. Quality and biochemical changes of ‛Sukkari’ Bananas during shelf life as affected by postharvest dipping in Ethanolic Extract of Propolis. Philippine Agricultural Scientist. 2019; 102(2): 132-140. Disponible en http://pas.cafs.uplb.edu.ph/download/quality-and-biochemical-changes-of-sukkari-bananas-during-shelf-life-as-affected-by-posharvest-dipping-in-ethanolic-extract-of-propolis/ Acceso: 2024- 02- 11.
).

El índice de madurez mostró valores superiores a medida que avanzaron los días de almacenamiento para las frutas con EEPP a 100 y 500 ml.L^-1 y control (Fig. 4D). Esta variable expresa la relación entre los azúcares principales y la acidez, e indica la mejor calidad comestible a los 7 días de conservación. En este estudio, los IM fueron superiores al notificado (2727. Botia L, Koop E. Comparación de las propiedades colorimétricas en guayaba con aplicación de recubrimientos. Revista UPTCV. 2018;12-27. Disponible en: https://rdigitales.uptc.edu.co/memorias/index.php/8_enc_cien/8_fac_cien/paper/view/2095. Acceso: 2024- 10- 4.
, 2828. Arrieta A, Baquero U, Barrera J. Caracterización fisicoquímica del proceso de maduración del plátano “Papocho” (Musa ABB Simmonds). Revista Agronomía Colombiana. 2006; 24(1): 48-53. http://revista.unal.edu.co/index.php/agrocol/
) para frutas de este cultivar almacenadas a la temperatura de 16ºC ± 1ºC durante ocho días (2626. Mulkay T, Suárez M, Paumier A. Indicadores de calidad de la guayaba ‘Enana Roja Cubana E.E.A 18-40’ durante la conservación poscosecha. Centro Agrícola. 2020; 47(4):73-80.
), aunque para el consumo en fresco no necesariamente se requiere que la fruta alcance los más altos IM. Estos resultados evidenciaron que el EEPP no tuvo un efecto negativo en la calidad comestible y el sabor de las frutas, por lo que se pueden considerar frutas aceptables para el consumo fresco. Similar resultado, en cuanto a este indicador, refirió El-Gawad (2121. El-Gawad M. Influence of propolis extract and oxalic acid on preserving quality of guava fruits during postharvest cold storage. Plant Archives. 2021; 21, Supplement 1: 127-138. http://doi.org/10.51470/PLANTAARCHIVE.2021.v21.S1.024
) para guayabas cv. ʻMaamouraʼ tratadas con EEP (4 %).