ARTÍCULO ORIGINAL

Efectos de extractos de hojas de Citrus latifolia (Tanaka ex Yu. Tanaka) Tanaka y Citrus aurantiifolia (Christm.) Swingle sobre la membrana y la respiración celular de Alternaria solani Sor.

Effects of leaf extracts of Citrus latifolia (Tanaka ex Yu. Tanaka) Tanaka and Citrus aurantiifolia (Christm.) Swingle on cellular membrane and respiration of Alternaria solani Sor.

Katia Ojito-Ramos, Daykenis González-Hernández, Dianella Iglesias, Orelvis Portal*

Departamento de Biología. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Central "Marta Abreu" de Las Villas, Cuba.

RESUMEN

El tizón temprano constituye uno de los principales problemas fitosanitarios que afectan el cultivo del tomate (Solanum lycopersicum L.) y la papa (Solanum tuberosum L.). Esta enfermedad es provocada por Alternaria solani Sor., cuyo control es, básicamente, mediante el uso de fungicidas sintéticos. En este sentido, las plantas constituyen una alternativa en la búsqueda de nuevas fuentes de compuestos antifúngicos menos agresivos para el ambiente. Los extractos de hojas de Citrus latifolia en etanol 70 % y Citrus aurantiifolia en metanol 70 % han mostrado actividad antifúngica frente a A. solani. El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de estos extractos sobre la membrana y la respiración celular de A. solani. Los extractos se obtuvieron mediante extracción asistida por ultrasonido y se cuantificó el contenido de fenoles totales. El efecto de los extractos sobre la membrana y la respiración celular se evaluó mediante la determinación de las concentraciones de fósforo y potasio en el medio extracelular y la actividad de la enzima succinato deshidrogenasa, respectivamente. Las elevadas concentraciones de fósforo y potasio encontradas en el medio extracelular sugieren daños en la permeabilidad de la membrana celular de A. solani. De igual forma, la inactividad de la enzima succinato deshidrogenasa indicó inhibición de la respiración celular por parte de los extractos de cítricos evaluados. Los resultados alcanzados confirman las propiedades antifúngicas de extractos de hojas de C. latifolia y C. aurantiifolia y sugieren su posible uso en el manejo agroecológico del agente causal del tizón temprano del tomate y de la papa.

Palabras clave: cítricos, modo de acción, tizón temprano.

ABSTRACT

Early blight is one of the main phytosanitary problems affecting the cultivation of tomato (Solanum lycopersicum L.) and potato (Solanum tuberosum L.). This disease is caused by Alternaria solani, whose control is basically by using synthetic fungicides. In this sense, plants are an alternative in the search for new sources of less aggressive antifungal compounds to the environment. Leaf extracts of Citrus latifolia in ethanol 70 % and Citrus aurantiifolia in methanol 70 % have proven antifungal activity against A. solani. The aim of this study was to determine the effect of these extracts on the cellular membrane and respiration of A. solani. The extracts were obtained by ultrasound-assisted extraction, and the total phenolic content was measured. The effect of the extracts on the cellular membrane and respiration was evaluated by determining the concentrations of phosphorus and potassium in the extracellular medium and the activity of the succinate dehydrogenase enzyme. The high concentrations of phosphorus and potassium found in the extracellular medium suggest damages in the permeability of the cellular membrane of A. solani. Similarly, the inactivity of the succinate dehydrogenase enzyme pointed to an inhibition of the cellular respiration of A. solani by the evaluated citrus extracts. The results obtained in this study confirmed the antifungal properties of leaf extracts of C. latifolia and C. aurantiifolia and suggested its possible use in the agro-ecological management of the causal agent of the early blight disease of tomato and potato.

Key words: citrus, action mode, early blight.

INTRODUCCIÓN

Alternaria solani Sor. es un hongo necrotrófico que causa el tizón temprano del tomate (Solanum lycopersicum L.) y de la papa (Solanum tuberosum L.) (1). Esta enfermedad reduce el área fotosintética de la planta y, en casos extremos, puede conducir a la total defoliación (2). En Cuba, A. solani se encuentra ampliamente distribuido y causa importantes daños económicos (3). El control fitosanitario del tizón temprano se realiza, mayormente, mediante fungicidas sintéticos (4), pero su uso indiscriminado en la agricultura, además de incrementar los costos de producción en forma significativa, causan contaminación ambiental y daños a la salud humana (5).

En el marco de una agricultura sostenible y en la búsqueda de nuevas fuentes de compuestos antifúngicos menos agresivos para el ambiente, las plantas constituyen una alternativa como fuente de metabolitos secundarios con esta función (6,7). En este sentido, el género Citrus constituye una importante fuente de compuestos con actividad antimicrobiana, dentro de los que se destacan los compuestos fenólicos (8,9). Recientemente se informó que los extractos alcohólicos de hojas de Citrus latifolia y Citrus aurantiifolia son ricos en compuestos fenólicos (10) y presentan actividad antifúngica frente a A. solani (11).

Los antifúngicos comerciales difieren ampliamente en su naturaleza química, propiedades y modo de acción. Entre sus principales efectos se encuentran la inhibición de la biosíntesis de macromoléculas, como son ADN, ARN y proteínas, inhibición de la biosíntesis del epóxido de escualeno, ergosterol y ácido fólico, así como la inhibición de la función de la membrana celular (8). La demostración de la bioactividad de un extracto es solamente el primer paso en el desarrollo de un producto comercial de origen natural y se requiere de la determinación del modo de acción del mismo (12,13). Por consiguiente, este trabajo tiene como objetivo determinar el efecto de los extractos de C. latifolia y C. aurantiifolia sobre la membrana y la respiración celular de A. solani.

MATERIALES Y MÉTODOS

Recolecta de las hojas y obtención de los extractos

Las hojas de C. latifolia y C. aurantiifolia se recolectaron en áreas del Centro de Estudios Jardín Botánico de la Universidad Central "Marta Abreu" de Las Villas, Santa Clara, Cuba (22N25'55", 79W53'44"). Las plantas se identificaron taxonómicamente y una muestra de cada especie se depositó en el herbario de dicha institución (O. Méndez No. 9885 y 9884 (ULV), respectivamente). Los extractos de C. latifolia en etanol 70 % (UniChem, China) y C. aurantiifolia en metanol 70 % (UniChem, China) se obtuvieron por ultrasonido, según Ojito-Ramos et al. (10).

Crecimiento de A. solani

Los discos de micelio de 0,6 cm de diámetro de A. solani se cultivaron en medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (Difco, Alemania) durante siete días a 27°C en la oscuridad. Posteriormente, se transfirieron a medio de cultivo Caldo Papa Dextrosa (Difco, Alemania) y se dejaron crecer en constante movimiento en una zaranda (Gerhardt, Alemania) durante 72 h, a 120 rpm y 27°C.

Determinación de la concentración de P⁺ y K⁺ en el medio extracelular

Se trituró 0,5 g de micelio de A. solani que creció en las condiciones mencionadas anteriormente en un homogenizador Ultra-Turrax T25 (Rose Scientific Ltd., Canadá) en tampón Tris-HCl 5 mmol.l^-1 (UniChem, China) (pH 7,0). Luego, el micelio triturado se ajustó a una concentración aproximada de 5 x 10⁵ propágulos.ml^-1 en cámara de Neubauer (Brand, Alemania). Seguidamente, se incubó durante 24 y 48 h a 27°C en la oscuridad en tampón Tris-HCl 5 mmol.l^-1 (pH 7,0) con el extracto a evaluar a una concentración de fenoles totales de 20 mg EAG.ml^-1, según la concentración inhibitoria mínima frente a A. solani (11), o el solvente (etanol o metanol 70 %) diluido en agua destilada estéril a la misma dilución en que se prepararon los extractos (control). La concentración de los fenoles totales se determinó por el método de Folin-Ciocalteu descrito por Silva-Espinoza et al. (14), mediante extrapolación en una curva de calibración con ácido gálico (Sigma-Aldrich, Alemania) como patrón. La misma se expresó en mg de equivalentes de ácido gálico.ml^-1 de extracto (mg EAG.ml^-1). Las determinaciones se hicieron por triplicado para cada uno de los extractos.

La concentración de P⁺ en el medio extracelular se determinó según Vásquez y Torres (15), con modificaciones. A 1 ml del medio extracelular se le adicionaron 2 ml de solución ácida de sulfomolibdato de amonio (Merck, Alemania) para formar el complejo fosfomolibdato. Luego, se añadió 1 ml de solución ácida de hidroquinona 1 % (Merck, Alemania). Después de 5 min, se adicionaron dos gotas de cloruro de estaño (Merck, Alemania). Pasados 5 min, se midió la absorbancia en un espectrofotómetro UV-VIS (Rayleigh 1601, China), a una longitud de onda de 340 nm. La concentración de P⁺ se determinó por extrapolación en una curva de calibración con KH₂PO₄ (Sigma-Aldrich, Alemania) como patrón, en un rango entre 40-100 mg.l^-1. La concentración de K⁺ en el medio extracelular se determinó en un espectrofotómetro de absorción atómica SP9 Pye UNICAM (Philips, Reino Unido). Los resultados se expresaron en mg.l^-1. Las determinaciones se hicieron por triplicado y el experimento se repitió una vez.

Determinación de la actividad de la enzima succinato deshidrogenasa (EC 1.3.5.1)

Las mitocondrias de A. solani se aislaron por centrifugación diferencial según Hernández et al. (16). Se tomó 1 g de micelio de A. solani que creció en las condiciones descritas anteriormente y se trituró con arena lavada. Luego, se añadió una solución fría de sacarosa 0,25 mol.l^-1 (UniChem, China) en tampón Tris-HCl 2,5 mmol.l^-1 (pH 7,4) hasta completar un volumen de 20 ml y se centrifugó a 600 g durante 10 min a 0°C. El sobrenadante extraído se centrifugó nuevamente a 10 000 g durante 20 min a 0°C y se recuperó el sobrenadante para su posterior uso (fracción citoplasmática). El precipitado se resuspendió en 20 ml de solución fría de sacarosa 0,25 mol.l^-1 en tampón Tris-HCl 2,5 mmol.l^-1 (pH 7,4) y se centrifugó a 10 000 g por 20 min a 0°C. El sobrenadante se eliminó por decantación y el precipitado se resuspendió nuevamente en 20 ml de solución fría de sacarosa 0,25 mol.l^-1 en tampón Tris-HCl 2,5 mmol.l^-1 (pH 7,4) para su posterior uso (fracción mitocondrial).

Se realizaron dos tratamientos y dos controles. En un tubo de ensayo se colocaron 0,5 ml de la fracción mitocondrial, 0,5 ml de tampón Tris-HCl 2,5 mmol.l^-1 (pH 7,4), 1 ml de succinato de sodio 1 % (Merck, Alemania), 0,5 ml de azul de metileno 0,01 % (Merck, Alemania) y 1 ml de extracto de C. latifolia o C. aurantiifolia a una concentración de fenoles totales de 20 mg EAG.ml^-1. En los controles positivo y negativo de la respiración celular se adicionó sacarosa 0,25 % en lugar del extracto; además, en este último se sustituyó la fracción mitocondrial por la fracción citoplasmática.

Posteriormente, se añadió una capa de aceite mineral en cada uno de los tubos de ensayo correspondientes a los tratamientos y controles y se incubó a 37°C en baño termostatado (Julabo, Alemania). Se evaluó el cambio de coloración del azul de metileno cada 4 h durante 48 h. Cada tratamiento se realizó por triplicado y el experimento se repitió una vez.

Análisis estadístico

El procesamiento estadístico de los datos se realizó con la ayuda del paquete estadístico computacional SPSS Inc. (del inglés: Statistic Package for the Social Science) versión 18 para Windows. En todos los casos se verificaron los supuestos de normalidad (Sapiro Wilk) y homogeneidad de varianza (Levene). Los datos obtenidos se procesaron estadísticamente mediante la prueba de Kruskal Wallis (p<0,05) y Mann Whitney a posteriori (p<0,01).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En este trabajo se determinó la concentración extracelular de iones P⁺ y K⁺ para investigar posibles cambios en la integridad de la membrana celular de A. solani, debido a la acción de extractos de hojas de cítricos.

A las 24 h de incubación de A. solani con los extractos de C. latifolia y C. aurantiifolia, la concentración de P⁺ en el medio extracelular fue mayor que en sus respectivos controles (Fig. 1A). Las mismas aumentaron en 49,31 y 51,82 %, respectivamente, sin mostrar diferencias significativas entre los extractos evaluados. Del mismo modo, a las 48 h de incubación, la concentración de P⁺ en el medio extracelular fue mayor que en sus respectivos controles. Las mismas aumentaron en 19,82 y 27,21 %, respectivamente, con diferencias significativas entre los extractos.

A las 24 y 48 h de incubación de A. solani con los extractos de C. latifolia y C. aurantiifolia, la concentración de K⁺ en el medio extracelular se mostró de manera similar (Fig. 1B). Esta fue mayor en 69,13 y 72,42 % a las 24 h y en 71,10 y 70,01 % a las 48 h, en comparación con sus respectivos controles. Entre los extractos no hubo diferencias significativas.

De forma general, la salida de iones intracelulares al medio extracelular constituye una medida indirecta del efecto de ciertos metabolitos secundarios de plantas sobre la integridad de la membrana celular de los hongos (8,17). La lisis de la membrana celular provoca una alteración enzimática, lo que ocasiona la degradación de numerosos sustratos. Bajo estas condiciones, las fosfatasas separan el grupo fosfato de diferentes moléculas, lo que conlleva al aumento de concentraciones de P⁺ inorgánico en el medio extracelular (18). Este mecanismo pudiera estar relacionado con los altos valores de P⁺ encontrados en el medio extracelular del cultivo de A. solani ante la presencia de extractos de cítricos. Algunos compuestos antifúngicos obtenidos a partir de las plantas afectan la integridad de la membrana celular (8,17,18). En este sentido, los cultivos de Botrytis cinerea Pers., en presencia de diterpenos, produjeron un incremento significativo en la concentración de P⁺ en el medio extracelular (17). Del mismo modo, los flavonoides aislados de Terminalia catappa L. afectaron la permeabilidad de la membrana de Rhizoctonia solani Kühn y Sclerotium rolfsii Sacc., lo cual provocó la salida de P⁺ al medio extracelular (19).

Además, la presencia de compuestos antifúngicos puede afectar el equilibrio osmótico dentro de la célula debido a la pérdida de iones K⁺ (20). En este trabajo se constató un aumento de estos iones en el medio extracelular. En este sentido, flavonas polimetoxiladas aisladas de Citrus reticulata Blanco aumentaron las concentraciones extracelulares de este ion en cultivos de Aspergillus niger Tiegh. No obstante, se evidenciaron variaciones de este ion debido, probablemente, a la activación de la bomba Na⁺-K⁺ en los momentos iniciales de contacto entre el hongo y las flavonas polimetoxiladas (8). Por otra parte, los flavonoides como la quercetina, naringenina y umbeliferona inhiben la producción de ATP (22) y algunas flavonas sintéticas inducen la muerte de hongos mediante la inhibición de la cadena de transporte de electrones en la mitocondria (23).

El aumento de las concentraciones de P⁺ y K⁺ en el medio extracelular, determinado en este trabajo, puede deberse a la acción sobre A. solani, independiente o combinada, de diferentes compuestos fenólicos presentes en los extractos de hojas de C. latifolia y C. aurantiifolia (10).

En este trabajo, además, se investigó la posible inhibición de la respiración celular de A. solani debido a la acción de extractos de hojas de cítricos mediante la actividad de la enzima succinato deshidrogenasa (SDH). Al inicio (0 h), el azul de metileno se encontraba en su forma oxidada (Fig. 2A). A las 48 h no se observó un cambio de coloración en el azul de metileno en los tubos donde se encontraba la fracción mitocondrial de A. solani con los extractos evaluados, similar a lo observado en el control negativo de la respiración celular (Fig. 2B). Esto evidenció una posible afectación en la actividad de la enzima SDH provocada por los extractos. Sin embargo, en el control positivo de la respiración celular, que solo contenía la fracción mitocondrial sin extracto, se apreció la decoloración total del azul de metileno (Fig. 2B).

La enzima SDH está unida a la membrana interna de la mitocondria, cataliza la oxidación del ácido succínico a ácido fumárico a expensas de la reducción del FAD a FADH₂ y, además, forma parte del complejo II de la cadena de transporte de electrones (21). Para demostrar la reacción de oxidación-reducción se empleó el azul de metileno, el cual es capaz de aceptar protones H⁺ y se transforma en su forma reducida o incolora (16). La no decoloración del azul de metileno observada en este trabajo indica que este no se utilizó como agente reductor en la reacción catalizada por la enzima SDH. Esto pudiera deberse a la inhibición de la actividad de la enzima por parte de la acción de los metabolitos presentes en los extractos de cítricos evaluados.

Varios fungicidas sintéticos de amplio uso comercial presentan, como modo de acción, la inhibición de la actividad de la enzima SDH (22-24). Además, metabolitos secundarios como los flavonoides pueden afectar diferentes componentes de la cadena transportadora de electrones, donde el complejo II (succinato deshidrogenada) es uno de los más sensibles a la acción de los mismos (25). También se ha demostrado que las fitoalexinas, tipo flavononas, inducen la muerte de Magnaporthe oryzae Couch por inhibición de la cadena respiratoria mitocondrial (26).

Además, al encontrase las mitocondrias de A. solani aisladas y expuestas a los extractos de cítricos, pudo haber ocurrido un desacople de la enzima SDH, lo cual debió afectar la actividad de la misma. Tal es el caso de los aceites esenciales de Anethum graveolens L., que afectaron la integridad de la membrana mitocondrial de Aspergillus flavus Link. y, como consecuencia, una disminución de la actividad de esta enzima (27). La alteración de la membrana mitocondrial también puede afectar el potencial de membrana mitocondrial, la producción de ATP y generar estrés oxidativo, entre otros, lo que pudiera conducir a la muerte celular (18).

CONCLUSIONES

Los extractos de hojas de C. latifolia en etanol 70 % y C. aurantiifolia en metanol 70 % afectan la integridad de la membrana celular e inhiben la respiración de A. solani. Este efecto puede deberse a la acción, independiente o combinada, de los metabolitos presentes en estos extractos. Según el modo de acción determinado, estos extractos pueden clasificarse como antifúngicos multisitio, debido a que actúan sobre varios componentes o procesos celulares, lo cual dificulta la aparición de resistencia en los microorganismos. Los resultados demuestran el potencial de estos extractos como alternativa en el manejo agroecológico de A. solani.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Ángel Mollineda Trujillo (Centro de Investigaciones Agropecuarias, Universidad Central "Marta Abreu" de Las Villas) por la asistencia técnica en el uso del espectrofotómetro de absorción atómica.

REFERENCIAS

Recibido: 15/1/2016

Aceptado: 1/6/2016

* Autor para correspondencia: Orelvis Portal. E-mail: orelvispv@uclv.cu