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Filtrados fúngicos de Trichoderma con actividad nematicida contra Meloidogyne incognita (Kofoid & White) Chitwood

Fungal filtrate of Trichoderma with nematicidal activity against Meloidogyne incognita (Kofoid & White) Chitwood

  [*] Autor para correspondencia: Juan Candelero-de la Cruz. Email: candelerocruz@hotmail.com


RESUMEN

El objetivo de este estudio fue evaluar in vitro la capacidad de 41 filtrados de aislados nativos de Trichoderma en la inhibición de la eclosión de huevos y la mortalidad de juveniles del segundo estadio (J2) del nematodo agallador Meloidogyne incognita (Kofoid & White) Chitwood. Los aislados fúngicos crecieron en PDA a 30°C durante ocho días; se colocaron discos de 5 mm en el medio de cultivo líquido, 200 g papa y 20 g dextrosa. L-1 de agua destilada. Se realizó una serie de filtrados con gasas estériles, inmediatamente se centrifugó el sobrenadante durante 5 min a 3000 rpm, papel Whatman número 1 y a través de un filtro miliporo de 0,45 µm. El ensayo in vitro se condujo en dos etapas, la primera fue adicionar 1 ml de cada filtrado fúngico en siracusas con 50 huevos del fitonematodo y se evaluó el efecto inhibitorio de la eclosión a las 72, 96 y 120 h de exposición; la segunda consistió en colocar en estos filtrados 25 juveniles de segundo estadio (J2) de M. incognita y se estimó su actividad contra movilidad, mortalidad y reversibilidad a las 24 y 48 h. Los tratamientos los conformaron los 41 filtrados fúngicos y un testigo con agua destilada estéril, con cuatro repeticiones, distribuidas en un diseño completamente al azar. Los filtrados lograron hasta 91,1 % de inhibición de la eclosión de huevos del fitonematodo y hasta 92,24 % de mortalidad en los J2 en los diferentes periodos de exposición a los filtrados fúngicos.

Palabras clave:
biocontrol; fitonematodo; metabolitos secundarios; nematodos agalladores.

ABSTRACT

The objective of this study was to evaluate the in vitro properties of 41 Trichoderma native strains in egg hatching and mortality of the second stage (J2) of root knot nematode M. incognita. Trichoderma strains were grown on PDA at 30°C for eight days, and then 5 mm discs were placed in the liquid culture medium containing 200 g potato and 20 g dextrose L-1 distilled water. A series of filtrations were performed with sterile gauze, immediately centrifuged for 5 min at 3000 rpm, Whatman paper no. 1 and through a 0.45 μm milipore filter. The in vitro assay was conducted in two stages; the first was to add 1 ml of each fungal filtrate in siraccus with 50 eggs of the phytonematode and evaluated at 72. 96 and 120 h of exposure; the second consisted in adding these same filtrates with 25 second stage juvenils (J2) of M. incognita and its antagonistic effect was evaluated at 24 and 48 h, and the reversibility effect. The treatments consisted of 41 fungal filtrates and one control with sterile distilled water, four replicates distributed in a completely random design. The results indicated that the filtrates achieved up to 91.10 % inhibition of egg hatching of the phytonematode and up to 92.24 % mortality of J2 of M. incognita at different exposure times to the fungal filtrates.

Key words:
biocontrol; phytonematode; root knot nematodes; secondary metabolites.

INTRODUCCIÓN

Los nematodos del género Meloidogyne son endoparásitos sedentarios formadores de agallas radiculares, tienen una amplia distribución y están presentes en varias regiones agrícolas en el mundo. En México afectan un gran número de especies cultivadas (1,2). La presencia de estos organismos puede facilitar la penetración e infección de otros fitopatógenos, como hongos y bacterias, y causar mayores pérdidas de producción (3). En México se tienen registros de pérdidas anuales en tomate (Solanum lycopersicum L.) del 20 al 52 % y, en ocasiones, han causado el abandono total de parcelas de chile habanero (Capsicum chinense Jacq.) (4,5,6).

Para su control, en las últimas décadas se recurrió al uso excesivo de nematicidas químicos que resultaron inefectivos, especialmente cuando las poblaciones del nematodo son altas; además de que pueden generar poblaciones resistentes, sin mencionar los daños en la salud humana, al ambiente y la pérdida de la biodiversidad de las poblaciones antagonistas naturales contra fitoparásitos asociados a la rizosfera del suelo (7). A esta situación se suma la demanda por los consumidores de alimentos libres de agroquímicos y la exigencia de políticas internacionales para reducir las fuentes de contaminación ambiental a través de estrategias necesarias de control más amigables con el ambiente.

Ante este panorama, en los últimos años se intensificó la búsqueda de aislamientos microbianos con actividad nematicida para reducir el impacto negativo de estos contaminantes en los agroecosistemas. Entre los más estudiados, por sus efectos como agentes de biocontrol contra fitopatógenos de raíces y con origen en el suelo, se encuentran Bacillus subtilis Ehrenberg y Cohn, Arthrobotrys oligospora Fres., Rhizophagus intraradices (NC Schenck y GS Sm.) C. Walker y A. Schuessler (anteriormente Glomus intraradices) NC Schenck & GS Sms y especies de Trichoderma (8,9,10). Estas últimas se caracterizan por su habilidad competitiva de crecer y adaptarse en diversos tipos de sustratos y condiciones ambientales, cuya capacidad más señalada se asocia con la producción de metabolitos secundarios (volátiles o no), de bajo peso molecular, que se liberan durante su establecimiento en la rizosfera (11,12).

En este sentido, durante el proceso de obtención de nuevos productos biológicos es esencial la selección de aislados promisorios, por lo que los estudios in vitro son fundamentales para estos propósitos. El objetivo del presente trabajo consistió en evaluar la efectividad inhibitoria de eclosión de huevos y efecto nematicida en juveniles de segundo estadio de M. incognita de aislamientos nativos de Trichoderma.

MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio se realizó en el laboratorio de Fitopatología del Instituto Tecnológico de Conkal (ITC), ubicado en Yucatán, a 20º06´ latitud norte y 89º29´ longitud Oeste.

Obtención del nematodo M. incognita

La población de nematodos utilizada en el estudio provenía de cultivos hortícolas. A través de las características de los patrones perineales de hembras adultas extraídas y otros caracteres morfotaxonómicos (13), se determinó que se trataba de la especie M. incognita.

Los huevos y juveniles (J2) se obtuvieron de las raíces agalladas que se trasladaron al laboratorio; se lavaron con agua corriente para eliminar residuos de suelo, se cortaron y se depositaron en cajas Petri. Con ayuda de agujas de disección y microscopio estereoscopio (Leica Zoom 2000) se disectaron las raíces agalladas y se extrajeron las masas de huevos del fitoparásito, que se conservaron en refrigeración a 6⁰C y, posteriormente, se inocularon en plantas de 25 cm de altura para mantener la población del fitonematodo en una estructura de casa sombra.

El inóculo de M. incognita se obtuvo disectando las raíces para obtener masas de huevos. Para favorecer el desprendimiento de los huevos y eliminar microorganismos que pudieran dañar su viabilidad, se desinfestaron las masas con hipoclorito de sodio (NaClO) al 1 % durante 2 min y al finalizar se hicieron lavados sucesivos en tamices de malla números 300 y 400; se colocaronen estufa de cultivo a 29,6°C durante cuatro días para su eclosión (10,14).

Filtrados de Trichoderma spp.

Los aislados de Trichoderma spp. (Tabla 1) se obtuvieron del cepario del laboratorio de Fitopatología del ITC y se reactivaron en medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) a 30ºC durante ocho días; se inocularon discos de 5 mm con micelio fúngico en un medio de cultivo líquido a base de 300 y 20 g de papa y dextrosa, respectivamente, en un litro de agua destilada con un pH final de 6,8 y se dejaron crecer a 30ºC sin agitación, durante 27 días. Al finalizar, se realizó una serie de filtrados; el primero con gasas estériles, inmediatamente se centrifugó el sobrenadante durante 10 min a 3000 rpm, el tercero con papel Whatman número 1 y el último utilizando filtro milipore de 0,45 µm. Los filtrados fúngicos se recolectaron en tubos Falcon de 50 ml de capacidad y se conservaron a 4°C en refrigeración (14).

MunicipiosRegistros
TizimínTh01-011, Th01-021, Th02-042
PanabáTh03-051, Th04-072
Dzilám G.Th05-071, Th06-B62, Th06-712
BuctzotzTh09-121, Th09-131, Th10-D862
DzidzantúnTh11-D1101, Th12-B852
YobainTh13-201, Th14-212
MaxcanúTh16-A942, Th16-B922, Th16-C1072, Th16-D1062
HalachóTh18-302, Th18-632
TzucacabTh19-321, Th20-352
PetoTh21-411, Th22-432
TekaxTh23-681
TadzhiuTh25-521, Th25-681, Th26-532
AkilTh29-541, Th29-551, Th30-662
OxkuztcabTh32-562
TiculTh33-371, Th33-581, Th33-591
SaccalumTh35-671, Th35-701, Th36-602
CuzamáTh38-612
HomúnTh40-622
TestigoAgua destilada estéril (ADE)

Inhibición de la eclosión de huevos de M. incognita por filtrados de Trichoderma spp. en

El ensayo in vitro se condujo en dos etapas, la primera consistió en adicionar 1 ml de cada filtrado de los 41 aislados nativos del género Trichoderma en siracusas estériles; posteriormente, se colocaron 50 huevos del nematodo agallador y se evaluó la inhibición de la eclosión de huevos a las 72, 96 y 120 h de exposición a los filtrados fúngicos.

Efecto de los filtrados de Trichoderma spp. contra juveniles (J 2 ) de M. incognita

En la segunda etapa se colocaron en las siracusas 25 juveniles de segundo estadio (J2) de M. incognita y se evaluó el efecto nematostático de los filtrados a las 24 y 48 h. La inmovilización del nematodo se confirmó con la ayuda de un pincel con el que se estimuló al nematodo en su región cefálica, si no daba respuesta de movimiento al estímulo se consideró inviable (15,10). Al finalizar las evaluaciones, se realizó la prueba de reversibilidad que consistió en retirar, con ayuda de una jeringa, el filtrado y su reemplazo con agua destilada estéril. Después de 24 h se contabilizaron la movilidad y la mortalidad de los J2.

Los filtrados fúngicos conformaron 41 tratamientos y un testigo con agua destilada estéril (Tabla 1), con cuatro repeticiones, distribuidas en un diseño experimental completamente al azar. Para la selección del mejor aislado con actividad de inhibición de huevos y mortalidad de J2 de M. incognita, se realizó un análisis de varianza y comparación de medias (Scott & Knott, p≤0,05) mediante el paquete estadístico InfoStat versión 2012 (16).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Inhibición de la eclosión de huevos de M. incognita por acción de filtrados de Trichoderma spp.

Los filtrados fúngicos afectaron, significativamente (p≤0,001), la eclosión de huevos de M. incognita en los tres momentos de evaluación.

Al finalizar el estudio se confirmó la viabilidad de huevos del fitonematodo con el tratamiento testigo (agua destilada estéril), que presentó el porcentaje más alto de la eclosión de huevos del fitonematodo en los tres tiempos de evaluación (Tabla 2). Este hecho manifestó que los filtrados fúngicos de Trichoderma afectaron, negativamente, la viabilidad de los huevos del fitonematodo. Por lo que el efecto de inhibición se detectó a partir de las primeras 72 h, lo que significó igualdad de tratamientos de 40 filtrados, con más del 98,03 % de efectividad sobre este parámetro de estimación (Scott & Knott, p≤0,05). A las 96 h de exposición, solamente 33 filtrados fúngicos lograron mantener hasta 94,17 % de efectividad. Los resultados a las 120 h permitieron establecer criterios de selección de 33 aislados nativos de Trichoderma spp. en su capacidad de evitar, al menos, hasta 93,30 % de inhibición sobre la eclosión de huevos de M. incognita.

Tiempo de exposición (h)
Aislados7296120
Inhibición de la eclosión de huevos*%
Th02-04, Th36-60, Th03-05100a100a100a
Th01-01, Th35-70, Th13-20100a100a100a
Th01-02, Th30-66, Th14-21100a100a100a
Th09-13, Th18-63, Th11-D110100a100a100a
Th12-B85, Th22-43, Th19-32100a100a100a
Th23-68, Th04-07, Th06-B6100a100a100a
Th06-71100a100a100a
Th10-D86100a100a100a
Th35-67100a100a100a
Th38-61100a100a100a
Th16-A94, Th33-59100a100a100a
Th40-62, Th33-37100a96,67a96,67a
Th21-41100a95,00a95,00a
Th29-55100a94,74a93,30a
Th26-52100a94,17a94,17a
Th20-35100a92,11b92,11b
Th29-54100a89,17b89,17b
Th26-53, Th33-58100a88,82b85,83b
Th16-C107100a88,82b87,50b
Th32-56100a87,50b84,17b
Th16-D106100a85,00b78,29c
Th05-0799,17a99,17a99,17a
Th16-B9298,34a98,34a98,34a
Th09-12, Th25-6898,03a98,03a98,03a
Th18-3079,41b79,41b79,41c
Testigo (ADE)0,00c0,00c0,00d

Nota: medias con igual literal, en una misma columna, no difieren estadísticamente (Scott & Knott p≤0,05), ADE: agua destilada estéril, *Porcentaje de inhibición en la eclosión de 50 huevos de M. incognita.

A las 120 h se evidenció la capacidad inhibitoria sobre la eclosión de huevo de, al menos, 33 filtrados fúngicos de Trichoderma, procedentes de suelo con y sin uso agrícola, al inhibirla eclosión de huevos de M. incognita del 94,74 al 100 %; este parámetro de estimación se considera fundamental en pruebas de control de nematodos agalladores, ya que representa la capacidad reproductora del nematodo, lo que podría traducirse en una disminución importante de este fitoparásito para condiciones de campo.

Estudios similares realizados por Algarate et al. (17) y Dávila y Clímaco (18) evidenciaron el efecto inhibitorio de especies nativas de Trichoderma spp., Pochonia chlamydosporia (Goddard) Zare y Gams, Arthrobotrys sp. y Paecilomyces sp. Samson (106conidias x ml-1) cuando se expusieron huevos de Meloidogyne sp. 24, 48 y 72 h. Mientras que, en un estudio de micoparasitismo con especies de Trichoderma, T. atroviride P. Karst, T. harzianum Rifai y T. viride Pers., se observó el crecimiento de hifas y la destrucción completa de huevos de M. incognita raza 2 después de las 72 h en condiciones de laboratorio (4,19). También Cardona et al. (20), con la concentración de 100 % de filtrado crudo de Purpureocillium sp. (Cepa UdeA0106), lograron mantener baja la eclosión de huevos de este fitonematodo a partir de las 24 h y, de igual manera, observaron vacuolas alteradas, las cuales asociaron con la deformación de este estadio.

El efecto inhibitorio en la eclosión de huevos debe estar relacionado con enzimas hidrolíticas, ya que estudios in vitro demostraron que las especies de Trichoderma parasitan las capas de vitelina, quitina y lípidos que protegen al embrión del huevo, cuyo efecto micoparasitario se debe al incremento en la actividad de enzimas como quitinasas y proteasas (4,11).

Efecto de los filtrados de Trichoderma spp. contra juveniles (J 2 ) de M. incognita

Se mostraron diferencias significativas (p≤0,001) en el efecto de 41 filtrados fúngicos de Trichoderma spp., aislados de suelos con y sin uso agrícola, sobre el porcentaje de mortalidad.

Los filtrados de hongos benéficos se agruparon de acuerdo a la separación de las medias. Los resultados a las 24 h de evaluación se mostraron de la siguiente manera: el primer grupo se conformó por 12 aislados de Trichoderma spp., estadísticamente iguales (Scott & Knott, p≤0,05) que lograron inducir un efecto de inmovilidad con valores que oscilaron de 91,38 a 97,41 % de la inactividad en J2 de M. incognita; le siguió un grupo de nueve aislados con 83,62 a 89,66 % de efectividad sobre este parámetro de estimación; por debajo de estos se encontraron ocho aislados de los hongos que lograron, al menos, hasta 59,48 % de inmovilidad; finalmente, el resto de los filtrados fúngicos indujo los valores menores a 16,38 %. En el tratamiento testigo (agua destilada estéril) se observó el porcentaje más alto de movilidad en los J2 del nematodo agallador, lo que confirmó la viabilidad de estos. Transcurridas 48 h de exposición de filtrados fúngicos, ocho aislados conformaron el primer grupo, que causaron la inmovilidad de J2 con rangos que oscilaron de 97,41 a 100 % de efectividad (Scott & Knott, p≤0,05). El segundo y el tercer grupo, con 11 y ocho registros de filtrados fúngicos, obtuvieron sobre este parámetro de estimación hasta 93, 10 y 90,50 % de efectividad, respectivamente. Por último, el cuarto grupo lo representó el aislado Th13-20 con 81,03 % de inactividad de J2 en M. incognita (Tabla 3).

AisladosTiempo de exposición (h)
24 4824
Inmovilidad % Reversibilidad* %
Th33-5897,41a97,41a0,00a
Th40-6297,41a100a66,38e
Th26-5296,55a96,55b0,00a
Th25-6894,83a95,69b0,00a
Th01-0294,83a98,27a0,00a
Th02-0494,83a96,55b0,00a
Th33-5793,11a93,10b0,00a
Th35-7093,11a93,96b0,00a
Th10-D8693,11a95,69b0,00a
Th33-5993,11a97,41a0,00a
Th22-4393,11a98,27a3,45a
Th20-3591,38a95,69b29,31c
Th32-5689,66b89,66c0,00a
Th29-5489,66b94,83b51,72d
Th30-6688,79b88,79c0,00a
Th21-4188,79b93,96b3,45a
Th26-5387,07b98,27a5,18a
Th23-6887,07b86,21c0,00a
Th16-C10785,35b90,5c6,90a
Th14-2185,34b93,1b0,00a
Th03-0583,62b84,48c0,00a
Th12-B8578,45c87,9c0,00a
Th29-5571,55c87,93c41,38d
Th06-B667,24c86,21c46,56d
Th09-1366,38c86,21c0,00a
Th35-6766,38c94,83b7,76a
Th16-A9463,79c75,00e82,76f
Th38-6163,79c100a14,66b
Th09-1259,48c71,55e20,69b
Th36-6056,03d93,1b0,00a
Th13-2054,31d81,03d60,35e
Th11-D11047,41e99,14a18,10b
Th06-7144,83e50,86f45,69d
Th01-0144,83e89,66c63,80e
Th19-3239,65e51,72f0,00a
Th16-B9238,79e50,86f26,73c
Th18-6322,41f43,1g50,00d
Th16-D10616,38f42,24g93,97g
Th05-073,45g51,72f50,86d
Th18-300,00g13,79i59,49e
Th04-070,00g20,69h75,86f
Testigo (ADE)0,00g0,00i0,00g

Nota: Medias con la misma literal dentro de columnas son iguales (Scott & Knott, p≤0,05), ADE: agua destilada estéril, *Porcentaje de recuperación de la movilidad o la mortalidad de 50 J2 de M. incognita

Los resultados del ensayo de la prueba de reversibilidad, después de 24 h sin exposición a los filtrados fúngicos, agruparon a los aislamientos en cinco grupos. El primero incluyó 23 filtrados, estadísticamente iguales (Scott & Knott, p≤0,05) con efecto nematicida de al menos el 92,24 % de mortalidad en los J2 de M. incognita; le siguieron en efectividad los grupos 2 y 3, con tres filtrados cada uno, con 81,90 a 85,34 y de 70,69 a 73,27 % de mortalidad sobre este parámetro de estimación. El resto de los grupos presentaron de 26,73 a 93,97 % de reversibilidad, después de retirar el filtrado y adicionar agua destilada. Estos resultados permitieron establecer un criterio para seleccionar aislados de Trichoderma promisorios para futuras investigaciones de control del nematodo. (Tabla 3)

En este estudio se confirmó que el origen de los filtrados fúngicos no influyó en el potencial efecto biológico de los mismos para disminuir la reproducción del nematodo agallador cuando provocaron inhibición de la eclosión de huevos. También, se demostró que la consecuencia del biocontrol de fitoparásitos por el género de Trichoderma depende más del tipo de sustrato como medio de cultivo que de la propia especie (19). En ensayos similares, el efecto potencial de los filtrados fúngicos de Arthrobotrys sp. Y Paecylomices sp. mostraron actividad nematicida contra J2 de poblaciones de M. incognita (18). Xalxo et al. (21) informaron un efecto in vitro de filtrados de T. viride de 65 a 93,75 % de mortalidad en J2 de Meloidogyne spp. Estos efectos encontraron Pinzón et al. (10) y Candelero et al. (14) al obtener 100 % de mortalidad en los J2 de este nematodo en las primeras 24 h de exposición de 14 filtrados fúngicos de Trichoderma provenientes de patosistemas silvestres. Asimismo, se confirmó en estudios in vitro que, a las 24 h de exposición de los filtrados toxigénicos de T. asperellum (cepa Ta. 90) en dilución 1/50, causó la mortalidad de J2 de M. incognita hasta 90 % (4); esta cepa produjo quitinasas y β-1,3-glucanasas, enzimas relacionadas con la hidrólisis de la cutícula en los fitopatógenos incapaces de sintetizarlas durante su establecimiento (11,17). También, esta actividad inhibitoria de los filtrados se le ha atribuido a los metabolitos secundarios que actúan como nematicidas y que se han reportado en T. harzianum son: tricotecenos, trichodermina, suzukacilina, alameticina, dermadina, penicilina, trichotecenosa y tricorzinianos (12).

CONCLUSIONES

De los 41 filtrados fúngicos de Trichoderma, se confirmó que el origen de 33 aislados de suelos, con y sin uso agrícola, no influyó en su actividad contra la inhibición de la eclosión de huevos, la motilidad ni la mortalidad sobre J2 de Meloidogyne incognita.

El origen de 23 aislados fúngicos de Trichoderma no determinó el efecto nematicida sobre J2 del fitonematodo agallador, después de evaluar el efecto de reversibilidad a las 48 h.

Se demuestra que las especies nativas de Trichoderma son agentes potenciales para emplearse como agente biocontrol del fitonematodo agallador.

Se sugiere realizar pruebas más contundentes in vitro que demuestren los mecanismos que inducen la inhibición de la eclosión de huevos, la mortalidad de juveniles del segundo estadio (J2) de M. incognita y la efectividad biocontroladora en plantaciones comerciales.

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Recibido: 24/05/2017

Aceptado: 18/01/2018

 

 


Los autores de este trabajo declaran no presentar conflicto de intereses.

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