Los nematodos del género Meloidogyne son endoparásitos sedentarios formadores de agallas radiculares, tienen una amplia distribución y están presentes en varias regiones agrícolas en el mundo. En México afectan un gran número de especies cultivadas (1,2). La presencia de estos organismos puede facilitar la penetración e infección de otros fitopatógenos, como hongos y bacterias, y causar mayores pérdidas de producción (3). En México se tienen registros de pérdidas anuales en tomate (Solanum lycopersicum L.) del 20 al 52 % y, en ocasiones, han causado el abandono total de parcelas de chile habanero (Capsicum chinense Jacq.) (4,5,6).
Para su control, en las últimas décadas se recurrió al uso excesivo de nematicidas químicos que resultaron inefectivos, especialmente cuando las poblaciones del nematodo son altas; además de que pueden generar poblaciones resistentes, sin mencionar los daños en la salud humana, al ambiente y la pérdida de la biodiversidad de las poblaciones antagonistas naturales contra fitoparásitos asociados a la rizosfera del suelo (7). A esta situación se suma la demanda por los consumidores de alimentos libres de agroquímicos y la exigencia de políticas internacionales para reducir las fuentes de contaminación ambiental a través de estrategias necesarias de control más amigables con el ambiente.
Ante este panorama, en los últimos años se intensificó la búsqueda de aislamientos microbianos con actividad nematicida para reducir el impacto negativo de estos contaminantes en los agroecosistemas. Entre los más estudiados, por sus efectos como agentes de biocontrol contra fitopatógenos de raíces y con origen en el suelo, se encuentran Bacillus subtilis Ehrenberg y Cohn, Arthrobotrys oligospora Fres., Rhizophagus intraradices (NC Schenck y GS Sm.) C. Walker y A. Schuessler (anteriormente Glomus intraradices) NC Schenck & GS Sms y especies de Trichoderma (8,9,10). Estas últimas se caracterizan por su habilidad competitiva de crecer y adaptarse en diversos tipos de sustratos y condiciones ambientales, cuya capacidad más señalada se asocia con la producción de metabolitos secundarios (volátiles o no), de bajo peso molecular, que se liberan durante su establecimiento en la rizosfera (11,12).
En este sentido, durante el proceso de obtención de nuevos productos biológicos es esencial la selección de aislados promisorios, por lo que los estudios in vitro son fundamentales para estos propósitos. El objetivo del presente trabajo consistió en evaluar la efectividad inhibitoria de eclosión de huevos y efecto nematicida en juveniles de segundo estadio de M. incognita de aislamientos nativos de Trichoderma.
El estudio se realizó en el laboratorio de Fitopatología del Instituto Tecnológico de Conkal (ITC), ubicado en Yucatán, a 20º06´ latitud norte y 89º29´ longitud Oeste.
La población de nematodos utilizada en el estudio provenía de cultivos hortícolas. A través de las características de los patrones perineales de hembras adultas extraídas y otros caracteres morfotaxonómicos (13), se determinó que se trataba de la especie M. incognita.
Los huevos y juveniles (J2) se obtuvieron de las raíces agalladas que se trasladaron al laboratorio; se lavaron con agua corriente para eliminar residuos de suelo, se cortaron y se depositaron en cajas Petri. Con ayuda de agujas de disección y microscopio estereoscopio (Leica Zoom 2000) se disectaron las raíces agalladas y se extrajeron las masas de huevos del fitoparásito, que se conservaron en refrigeración a 6⁰C y, posteriormente, se inocularon en plantas de 25 cm de altura para mantener la población del fitonematodo en una estructura de casa sombra.
El inóculo de M. incognita se obtuvo disectando las raíces para obtener masas de huevos. Para favorecer el desprendimiento de los huevos y eliminar microorganismos que pudieran dañar su viabilidad, se desinfestaron las masas con hipoclorito de sodio (NaClO) al 1 % durante 2 min y al finalizar se hicieron lavados sucesivos en tamices de malla números 300 y 400; se colocaronen estufa de cultivo a 29,6°C durante cuatro días para su eclosión (10,14).
Los aislados de Trichoderma spp. (Tabla 1) se obtuvieron del cepario del laboratorio de Fitopatología del ITC y se reactivaron en medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) a 30ºC durante ocho días; se inocularon discos de 5 mm con micelio fúngico en un medio de cultivo líquido a base de 300 y 20 g de papa y dextrosa, respectivamente, en un litro de agua destilada con un pH final de 6,8 y se dejaron crecer a 30ºC sin agitación, durante 27 días. Al finalizar, se realizó una serie de filtrados; el primero con gasas estériles, inmediatamente se centrifugó el sobrenadante durante 10 min a 3000 rpm, el tercero con papel Whatman número 1 y el último utilizando filtro milipore de 0,45 µm. Los filtrados fúngicos se recolectaron en tubos Falcon de 50 ml de capacidad y se conservaron a 4°C en refrigeración (14).
El ensayo in vitro se condujo en dos etapas, la primera consistió en adicionar 1 ml de cada filtrado de los 41 aislados nativos del género Trichoderma en siracusas estériles; posteriormente, se colocaron 50 huevos del nematodo agallador y se evaluó la inhibición de la eclosión de huevos a las 72, 96 y 120 h de exposición a los filtrados fúngicos.
En la segunda etapa se colocaron en las siracusas 25 juveniles de segundo estadio (J2) de M. incognita y se evaluó el efecto nematostático de los filtrados a las 24 y 48 h. La inmovilización del nematodo se confirmó con la ayuda de un pincel con el que se estimuló al nematodo en su región cefálica, si no daba respuesta de movimiento al estímulo se consideró inviable (15,10). Al finalizar las evaluaciones, se realizó la prueba de reversibilidad que consistió en retirar, con ayuda de una jeringa, el filtrado y su reemplazo con agua destilada estéril. Después de 24 h se contabilizaron la movilidad y la mortalidad de los J2.
Los filtrados fúngicos conformaron 41 tratamientos y un testigo con agua destilada estéril (Tabla 1), con cuatro repeticiones, distribuidas en un diseño experimental completamente al azar. Para la selección del mejor aislado con actividad de inhibición de huevos y mortalidad de J2 de M. incognita, se realizó un análisis de varianza y comparación de medias (Scott & Knott, p≤0,05) mediante el paquete estadístico InfoStat versión 2012 (16).
Los filtrados fúngicos afectaron, significativamente (p≤0,001), la eclosión de huevos de M. incognita en los tres momentos de evaluación.
Al finalizar el estudio se confirmó la viabilidad de huevos del fitonematodo con el tratamiento testigo (agua destilada estéril), que presentó el porcentaje más alto de la eclosión de huevos del fitonematodo en los tres tiempos de evaluación (Tabla 2). Este hecho manifestó que los filtrados fúngicos de Trichoderma afectaron, negativamente, la viabilidad de los huevos del fitonematodo. Por lo que el efecto de inhibición se detectó a partir de las primeras 72 h, lo que significó igualdad de tratamientos de 40 filtrados, con más del 98,03 % de efectividad sobre este parámetro de estimación (Scott & Knott, p≤0,05). A las 96 h de exposición, solamente 33 filtrados fúngicos lograron mantener hasta 94,17 % de efectividad. Los resultados a las 120 h permitieron establecer criterios de selección de 33 aislados nativos de Trichoderma spp. en su capacidad de evitar, al menos, hasta 93,30 % de inhibición sobre la eclosión de huevos de M. incognita.
A las 120 h se evidenció la capacidad inhibitoria sobre la eclosión de huevo de, al menos, 33 filtrados fúngicos de Trichoderma, procedentes de suelo con y sin uso agrícola, al inhibirla eclosión de huevos de M. incognita del 94,74 al 100 %; este parámetro de estimación se considera fundamental en pruebas de control de nematodos agalladores, ya que representa la capacidad reproductora del nematodo, lo que podría traducirse en una disminución importante de este fitoparásito para condiciones de campo.
Estudios similares realizados por Algarate et al. (17) y Dávila y Clímaco (18) evidenciaron el efecto inhibitorio de especies nativas de Trichoderma spp., Pochonia chlamydosporia (Goddard) Zare y Gams, Arthrobotrys sp. y Paecilomyces sp. Samson (106conidias x ml-1) cuando se expusieron huevos de Meloidogyne sp. 24, 48 y 72 h. Mientras que, en un estudio de micoparasitismo con especies de Trichoderma, T. atroviride P. Karst, T. harzianum Rifai y T. viride Pers., se observó el crecimiento de hifas y la destrucción completa de huevos de M. incognita raza 2 después de las 72 h en condiciones de laboratorio (4,19). También Cardona et al. (20), con la concentración de 100 % de filtrado crudo de Purpureocillium sp. (Cepa UdeA0106), lograron mantener baja la eclosión de huevos de este fitonematodo a partir de las 24 h y, de igual manera, observaron vacuolas alteradas, las cuales asociaron con la deformación de este estadio.
El efecto inhibitorio en la eclosión de huevos debe estar relacionado con enzimas hidrolíticas, ya que estudios in vitro demostraron que las especies de Trichoderma parasitan las capas de vitelina, quitina y lípidos que protegen al embrión del huevo, cuyo efecto micoparasitario se debe al incremento en la actividad de enzimas como quitinasas y proteasas (4,11).
Se mostraron diferencias significativas (p≤0,001) en el efecto de 41 filtrados fúngicos de Trichoderma spp., aislados de suelos con y sin uso agrícola, sobre el porcentaje de mortalidad.
Los filtrados de hongos benéficos se agruparon de acuerdo a la separación de las medias. Los resultados a las 24 h de evaluación se mostraron de la siguiente manera: el primer grupo se conformó por 12 aislados de Trichoderma spp., estadísticamente iguales (Scott & Knott, p≤0,05) que lograron inducir un efecto de inmovilidad con valores que oscilaron de 91,38 a 97,41 % de la inactividad en J2 de M. incognita; le siguió un grupo de nueve aislados con 83,62 a 89,66 % de efectividad sobre este parámetro de estimación; por debajo de estos se encontraron ocho aislados de los hongos que lograron, al menos, hasta 59,48 % de inmovilidad; finalmente, el resto de los filtrados fúngicos indujo los valores menores a 16,38 %. En el tratamiento testigo (agua destilada estéril) se observó el porcentaje más alto de movilidad en los J2 del nematodo agallador, lo que confirmó la viabilidad de estos. Transcurridas 48 h de exposición de filtrados fúngicos, ocho aislados conformaron el primer grupo, que causaron la inmovilidad de J2 con rangos que oscilaron de 97,41 a 100 % de efectividad (Scott & Knott, p≤0,05). El segundo y el tercer grupo, con 11 y ocho registros de filtrados fúngicos, obtuvieron sobre este parámetro de estimación hasta 93, 10 y 90,50 % de efectividad, respectivamente. Por último, el cuarto grupo lo representó el aislado Th13-20 con 81,03 % de inactividad de J2 en M. incognita (Tabla 3).
Los resultados del ensayo de la prueba de reversibilidad, después de 24 h sin exposición a los filtrados fúngicos, agruparon a los aislamientos en cinco grupos. El primero incluyó 23 filtrados, estadísticamente iguales (Scott & Knott, p≤0,05) con efecto nematicida de al menos el 92,24 % de mortalidad en los J2 de M. incognita; le siguieron en efectividad los grupos 2 y 3, con tres filtrados cada uno, con 81,90 a 85,34 y de 70,69 a 73,27 % de mortalidad sobre este parámetro de estimación. El resto de los grupos presentaron de 26,73 a 93,97 % de reversibilidad, después de retirar el filtrado y adicionar agua destilada. Estos resultados permitieron establecer un criterio para seleccionar aislados de Trichoderma promisorios para futuras investigaciones de control del nematodo. (Tabla 3)
En este estudio se confirmó que el origen de los filtrados fúngicos no influyó en el potencial efecto biológico de los mismos para disminuir la reproducción del nematodo agallador cuando provocaron inhibición de la eclosión de huevos. También, se demostró que la consecuencia del biocontrol de fitoparásitos por el género de Trichoderma depende más del tipo de sustrato como medio de cultivo que de la propia especie (19). En ensayos similares, el efecto potencial de los filtrados fúngicos de Arthrobotrys sp. Y Paecylomices sp. mostraron actividad nematicida contra J2 de poblaciones de M. incognita (18). Xalxo et al. (21) informaron un efecto in vitro de filtrados de T. viride de 65 a 93,75 % de mortalidad en J2 de Meloidogyne spp. Estos efectos encontraron Pinzón et al. (10) y Candelero et al. (14) al obtener 100 % de mortalidad en los J2 de este nematodo en las primeras 24 h de exposición de 14 filtrados fúngicos de Trichoderma provenientes de patosistemas silvestres. Asimismo, se confirmó en estudios in vitro que, a las 24 h de exposición de los filtrados toxigénicos de T. asperellum (cepa Ta. 90) en dilución 1/50, causó la mortalidad de J2 de M. incognita hasta 90 % (4); esta cepa produjo quitinasas y β-1,3-glucanasas, enzimas relacionadas con la hidrólisis de la cutícula en los fitopatógenos incapaces de sintetizarlas durante su establecimiento (11,17). También, esta actividad inhibitoria de los filtrados se le ha atribuido a los metabolitos secundarios que actúan como nematicidas y que se han reportado en T. harzianum son: tricotecenos, trichodermina, suzukacilina, alameticina, dermadina, penicilina, trichotecenosa y tricorzinianos (12).
De los 41 filtrados fúngicos de Trichoderma, se confirmó que el origen de 33 aislados de suelos, con y sin uso agrícola, no influyó en su actividad contra la inhibición de la eclosión de huevos, la motilidad ni la mortalidad sobre J2 de Meloidogyne incognita.
El origen de 23 aislados fúngicos de Trichoderma no determinó el efecto nematicida sobre J2 del fitonematodo agallador, después de evaluar el efecto de reversibilidad a las 48 h.
Se demuestra que las especies nativas de Trichoderma son agentes potenciales para emplearse como agente biocontrol del fitonematodo agallador.
Se sugiere realizar pruebas más contundentes in vitro que demuestren los mecanismos que inducen la inhibición de la eclosión de huevos, la mortalidad de juveniles del segundo estadio (J2) de M. incognita y la efectividad biocontroladora en plantaciones comerciales.