Evaluación in vitro del potencial probiótico de Lactobacillus acidophilus SS80 y Streptococcus thermophilus SS77

Las cepas de Lactobacillus acidophilus SS80 y Streptococcus thermophilus SS77 pertenecen al cepario del Departamento de Veterinaria de la Universidad de Sancti Spíritus ¨José Martí Pérez¨. Los ensayos se realizaron en el laboratorio de Alimento del Departamento de Salud Pública Veterinaria de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional del Litoral, Argentina (UNL). Los microorganismos mencionados previamente se obtuvieron inicialmente por aislamiento desde un preparado liofilizado del Instituto de Investigaciones de la Industria Alimenticia (IIIA) de Cuba en los medios Man Rogosa Sharpe (MRS), Lactobacillus Anaerobic MRS con Vancomycina y Verde de Bromocresol, (LAMVAB), y medio Streptococcus thermophilus (ST). Los cultivos puros se mantuvieron en caldo MRS. Los aislamientos se conservaron a -80^oC en caldo MRS con 20 % de glicerol estéril para ser conservado por largos periodos.

La capacidad de las cepas para producir H₂O₂ se determinó siguiendo la metodología descrita por McLean y Rosenstein (13). Los cultivos bacterianos se sembraron en duplicado por estría sobre agar MRS suplementado con 2,5 mg/mL de Tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma) y 0,01 mg/mL de Peroxidasa de rábano (HRP) (Sigma). Las placas fueron incubadas a 37°C durante 48 h en condiciones de anaerobiosis. En presencia de H₂O₂, la enzima HRP oxida al TMB (incoloro) para dar lugar a la formación de un pigmento azul. La tonalidad de la coloración azul se consideró una medida semicuantitativa de la cantidad de H₂O₂ producido y liberado al medio por la cepa (14). La intensidad de la coloración azul fue incluida dentro de una de las siguientes categorías: azul claro o azul oscuro y, por la rapidez en la aparición, en Rápido (+++), Intermedio (++), Lento (+) y Negativo (-).

La actividad amino-descarboxilasa de las cepas se realizó mediante un método cualitativo (15), que consistió en un medio líquido base con la siguiente composición: Peptona de caseína 0,5 %, Extracto de levadura 0,3 %, D(+)Glucosa 0,1 %, Púrpura de bromocresol 0,0016 % (Mallinckrodt Baker, Inc). A 0,9 % del medio base se le agregó 0,5 % del aminoácido a testar, en este caso L Arginina, L Histidina, L Lisina, L Tirosina y L Triptofano (Biopack, Argentina). Luego se ajustó el pH del medio a 6,7 ± 0,1 a 25°C. Los tubos duplicados se inocularon con 10 µL de cultivo y se incubaron 72 horas a 37°C. El color del medio al momento de la siembra era de color púrpura. El medio inicialmente pasa a amarillo al acidificarse y retorna a púrpura si la cepa descarboxila los aminoácidos; el pH del medio aumenta. Prueba positiva: color del medio púrpura. Cepa productora de aminas biógenas. Prueba negativa: color del medio amarillo. La cepa no produce aminas biógenas con el aminoácido probado.

Para examinar la actividad proteolítica se siguió la metodología descrita por Harrigan (16) con algunas modificaciones. Se prepararon dos medios de cultivo: medio 1) agar leche descremada, que consistió en leche en polvo descremada al 5 % y agar al 1,3 % (Britania); medio 2) agar-leche que se preparó de la siguiente manera, se disolvió leche en polvo descremada al 2 % en agua destilada y agar (Britania) a una concentración de 1,3 % en agua de peptona; se esterilizaron por separado la leche y el medio peptonado, se dejaron enfriar a 60°C y luego se mezclaron y repartieron en placas Petri. Se prepararon placas con perforaciones de 6 mm de diámetro que se rellenaron con 20 µL de los cultivos y placas sin perforaciones que se sembraron por estrías. Se utilizó Staphylococcus aureus ATCC 25923 como control. Las placas se incubaron a 37°C durante 48 a 72 h. La presencia de un halo transparente alrededor de las colonias y pocillos se consideró como reacción positiva de proteólisis de la caseína. El ensayo se realizó por triplicado y en dos momentos diferentes.

Para examinar la producción de las enzima lecitinasa y lipasa de las cepas, se siguió la metodología descrita por MacFaddin (17). Se utilizó el medio de cultivo agar Tripteina de Soya (Britania®) enriquecido con 10 % de yema de huevo. Se prepararon dos placas con perforaciones de 6 mm de diámetro que fueron inoculadas con 20 µL de cultivos y se utilizaron placas sin perforaciones que se sembraron por estrías. Se utilizó la cepa Staphylococcus aureus ATCC 25923 como control. Las placas se incubaron a 37°C durante 48 a 72 h. Un halo opaco, opalescente (blanco lechoso) rodeando las colonias en perforación se consideró como prueba lecitinasa positiva; un brillo aceitoso, iridiscente, sobre las colonias y alrededor de ellas en la placa sembrada por estrías, se interpretó como actividad lipasa positiva.

La actividad hemolítica de las cepas se realizó sobre Agar Columbia con 5 % de sangre de Caballo (Biomérieux, Marcy l’Etoile, Francia), según el método estándar con ligeras modificaciones (18). La incubación se realizó a 37°C por 48 h. Las cepas fueron evaluadas según la zona de hemólisis alrededor de la colonia, como positivas o negativas y de acuerdo al tipo de hemólisis: β- hemolisis cuando apareció una zona clara de hemólisis alrededor de la colonia, α- hemólisis una zona verde alrededor de la colonia y gamma (γ) cuando la zona alrededor de la colonia no era clara. Se utilizó como control positivo la cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923.

Para el desarrollo del ensayo (19), se prepararon en tubos Falcon de 20 mL de capacidad 10 mL de leche descremada en polvo con una concentración final de sólidos de 125 g/L. Posteriormente, se esterilizaron en calor fluido durante 20 min, dejando enfriar a 45°C y bajo flujo laminar, inoculándose con cultivo fresco de las dos cepas individuales y en simbiosis a razón de 250 µL. Los tubos se incubaron a 37°C, se realizaron lecturas a tiempo 0 y cada una hora, a partir de las dos horas, hasta observar estabilidad en el pH. El ensayo se realizó por triplicado y las mediciones se realizaron un pH metro Altronix TPX III (Taiwan).

Se prepararon tubos Falcon de 20 mL de capacidad con 10 mL de medio caldo MRS; se ajustóel pH con ácido fosfórico a pH 6,5, pH 5,5, pH 4,5 y pH 3,5. La esterilización de los medios de cultivo con diferentes pH se realizó en autoclave a 121°C durante 15 min. El ensayo de cinética de crecimiento se realizó en microplacas de 96 pocillos (Costar 3599, Corning). Para esto, se depositaron en cada pocillo 240 µL de los medios y 30 µL de inoculo de un cultivo de 18 h de cada cepa en estudio. El crecimiento microbiano se realizó a 37^oC durante 24 h. Las lecturas se realizaron cada 30 min a 630 nm mediante el Lector multimodal de microplacas Sinergy HT BioTEK (BioTEK Instrumentos-USA). Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.

El ensayo de tolerancia a los jugos gástricos se realizó con ajustes a la metodología descrita por Bao (20). El JGS consistió en una solución de pepsina (Riedel-de Haën, Alemania) (0,35 % p/v) y NaCl (0,2 % p/v); una mitad (50 %) ajustada a pH 3 con ácido clorhídrico y la otra restante a pH 6,5. La esterilización se realizó por filtración (0,22 µM). Las suspensiones de JGS se inocularon a 1 % con cultivos de 18 h de cada cepa y mezclados durante 10 s. El JGS con pH 3 se incubó durante 3 h a 37^oC. Se realizaron recuentos de células viables en agar MRS a tiempo 0 (N₀), (JGS pH 6,5) y se repitieron los recuentos pasadas las 3 h (N₁). En ambos casos las placas se incubaron durante 48 h a 37ºC en atmósfera de anaerobiosis. Todas las determinaciones se hicieron por triplicado. El porcentaje de supervivencia se calculó mediante la siguiente ecuación: % SP = Log UFC N₁ / Log UFC N₀ x100. Donde N₁ representa el total de células viables después del tratamiento y N₀ el número inicial de microorganismos inoculados.

La tolerancia a sales biliares se llevó a cabo de acuerdo con la metodología utilizada por Uriot et al. (21) en microplacas de 96 pocillos. Las cepas se multiplicaron en caldo MRS en presencia de 0,3 %, 0,5 % y 1 % de bilis bovina (Britania, Argentina); se adicionaron 240 µL en cada pocillo y 30 µL del cultivo de 18 h de las cepas en estudio. Los cultivos se incubaron a 37^oC durante 24 h y las lecturas se realizaron cada 30 min a 630 nm mediante el Lector multimodal de microplacas Sinergy HT BioTEK (BioTEK Instrumentos-USA). Todas las determinaciones fueron por triplicado.

Los ensayos de autoagregación y coagregación con patógenos intestinales se llevaron a cabo de acuerdo con la metodología descrita por Maldonado et al. (23). Se emplearon los microorganismos patógenos Escherichia coli y Salmonella enterica serotipo Dublin. Las pruebas se consideraron positivas cuando se hizo visible la sedimentación de las células sobre el fondo del tubo en un periodo máximo de 2 h a temperatura ambiente. Se desarrollaron controles con suspensiones en PBS de las BAL y los patógenos utilizados.

Para la determinación de la hidrofobicidad de la superficie celular, se empleó la técnica de partición en solventes orgánicos (23,24). Los valores de por ciento de hidrofobicidad obtenidos permiten clasificar a las cepas con una hidrofobicidad alta (51-100 %), media (30- 50 %) y baja (0-29 %) (24).

Los datos se tabularon y se analizaron con el programa estadístico SPSS 11.5. Se empleó un análisis de varianza de clasificación simple, una prueba T para grupos independientes y comparación de Proporciones, considerando en todos los casos un nivel de significación de 5 %.

Para el procesamiento estadístico de las variables discretas se utilizó la Prueba de hipótesis para proporciones y para las variables continuas un Análisis de varianza de clasificación simple (ANOVA) y la prueba de Rangos múltiples de Tukey. Previamente, se valoró la distribución normal de los datos mediante el test de Kolmogorov-Smirnov para la bondad de ajuste y se aplicó la prueba de Levene para evaluar la Homocedasticidad. Se utilizaron los software estadísticos SPSS 15.0.1 para Windows.

La Tabla 1 evidencia que las dos cepas resultaron positivas a la prueba de peróxido de hidrógeno; la cepa L. acidophilus SS80 fue superior por la intensidad de la coloración y rapidez con que apareció la reacción.

En las primeras 12 horas las dos cepas no utilizaron los aminoácidos incluidos en el ensayo. La cepa Streptococcus thermophilus SS77 fue capaz de utilizar la Alanina a partir de las 36 h, mientras que la cepa de L. acidophilus SS80 lo hizo con la Histidina a partir de las 72 h. Las cepas evaluadas no usaron el resto de los aminoácidos en los tiempos evaluados (Tabla 2).

S. thermophilus SS77 mostró actividad de las tres enzimas, L. acidophilus SS80 solo fue positivo a la lipasa y lecitinasa (Tabla 3).

La Tabla 4 muestra que la cepa L. acidophilus SS80 produjo a las 7 h un pH más bajo (pH 3,78) que S. thermophilus SS7 (pH 5,71), valores que difieren entre sí. Cuando se crecieron las cepas en simbiosis, el pH mostró valores intermedios (pH 4,17) y difirió significativamente (p<0,05) al alcanzado por las cepas independientes.

Las dos cepas fueron capaces de crecer a pH 6,5 y 5,5, no así en pH 4,5 y 3,5 (Tabla 5); sin embargo, toleraron el JGS donde enfrentaron un pH 3; se observó que no existen diferencias significativas entre los conteos y mostraron porcentaje de supervivencia de 98,9 % y 99,7 % para L. acidophilus SS80 y S. thermophilus SS77, respectivamente (Tabla 6).

Solamente la cepa de S. thermophilus SS77 fue capaz de crecer en todas las concentraciones de bilis evaluadas (Tabla 7).

La Tabla 8 muestra los resultados de la actividad antagónica de las dos cepas BAL frente a los cinco patógenos estudiados “mota en césped” (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica serotipo Dublin, Escherichia coli 289, Bacillus cereus y Staphylococcus aureus. El mayor efecto inhibitorio lo exhibieron ambas cepas sobre Listeria monocytogenes. Los valores de los halos de inhibición de L. acidophilus SS80 fueron mayores que los encontrados con la cepa S. thermophilus SS77; no obstante, de acuerdo a la clasificación ambas cepas son inhibidoras.

En el cruzamiento de las cepas por el método de “mota en césped”, estas mostraron halo de inhibición inferior a los encontrados en el enfrentamiento a los patógenos, no existiendo diferencias significativas entre ellas (Tabla 9).

Las cepas de S. thermophilus SS77 y L. acidophilus SS80 a los 120 min mostraron capacidad de autoagregar y coagregar; la coagregación para ambas cepas fue más compacta en el caso de la Escherichia coli 298. Las dos cepas utilizadas en el ensayo mostraron valores medio de hidrofobicidad y no existieron diferencias significativas entre ellas (Tabla 10).

Las cepas de L. acidhophillus SS80 y S. thermophillus SS77 mostraron baja capacidad de producción de aminas biógenas (AB): de los cinco aminoácidos ensayados solo utilizaron uno, pasadas las 36 horas. Este es otro indicador de seguridad en la evaluación de cepas candidatas a probióticos, partiendo de que altas concentraciones de aminas en los alimentos, pueden ingresar en la cadena alimentaria y ser responsables de varios problemas toxicológicos en humanos (25). No obstante, la formación de AB ha estado asociada a cepas de Lactobacillus spp., tales como L. plantarum, L. curvatus, L. alimentarius, L. reuteri, y L. sakei (26). En productos cárnicos fermentados fueron descritos con baja actividad de producción de AB cepas de L. casei, L. fermentum y L. reuteri (27). Tarrah et al. (28) realizaron un estudio in vitro de cepas de S. thermophilus y estas manifestaron diferencias en la producción de AB, por lo que los autores concluyeron que es una característica dependiente de la cepa (28).

La cepa de L. acidophilus SS80 no mostró actividad proteolítica, correspondiendo con lo planteado por Peres Cátia et al. (29), quienes reportaron cepas que exhibían baja actividad de la enzima. La variación encontrada entre cepas puede estar dada por componentes de la pared celular o del medio en que se desarrollan las cepas. La actividad proteolítica de las cepas es un indicador a tener en cuenta para evaluar su actividad probiótica, específicamente referente a la liberación de péptidos bioactivos, los cuales se generan durante la fermentación del alimento o en el proceso de la digestión (30). Estos péptidos bioactivos incluyen algunas secuencias de aminoácidos que ejercen una actividad biológica específica en el consumidor (31).

Dentro de los indicadores recomendados por la FAO/WHO (32) para evaluar los probióticos, la actividad hemolítica es uno de los criterios de seguridad debido a su relación con la virulencia de las cepas. Las dos cepas evaluadas no revelaron actividad hemolítica. Estos resultados coinciden con los encontrados por Kalui et al. (33), quienes reportaron actividad hemolítica negativa en estudios del género Lactobacillus.

Los resultados obtenidos en el monitoreo del pH cada 2 h difieren con lo planteado por Bauman y Longo (34), pues estos encontraron un crecimiento más rápido de S. termophilus. La conversión de lactosa en ácido láctico se encuentra directamente relacionada con el descenso del pH y es provocado, principalmente, por L. acidophilus SS80. Los valores de pH del medio disminuyeron a valores por debajo de 5 en 18 h, lo que se corresponde con otros estudios donde las cepas de lactobacilos redujeron el pH a valores ≤ 5,5 en 24 h (35,36). Es de esperar que con estas características las cepas trabajadas ejerzan alguna acción benéfica, ya que se conoce que la mayoría de los enteropatógenos tienen inhibición del crecimiento a valores cercanos a pH 5,5 (37,38).

La tolerancia a las sales de bilis y bajo pH son propiedades esenciales requeridas por las BAL para sobrevivir en el tracto digestivo y expresar sus propiedades benéficas (39). En el presente estudio, las cepas de L. acidophilus SS80 y S. thermophilus SS77 crecieron en pH 6,5 y 5,5 y resistieron un pH 3 durante tres horas; sin embargo, las concentraciones de bilis 0,5 % y 1 % inhibieron el crecimiento de L. acidophilus SS80. En otros estudios se encontraron mejores crecimientos en el medio MRS cuando ajustaron el pH superior a 5; a pH 3 la mayoría de las cepas redujeron el crecimiento significativamente, incluso la cepa testigo de L. acidophilus LA5 que disminuyó en 2 log (40). Concentraciones de 0,3 % de bilis es el punto crítico de resistencia para las cepas a evaluar, mientras que en la predicción de la supervivencia de probióticos, después de su administración vivos por vía oral, el pH del jugo gástrico a pH 2 durante 3 h es a menudo utilizado como una condición extrema para simular las condiciones en el estómago (41); límite muy similar al que las cepas evaluadas toleraron.

El nivel de supervivencia observado en el trabajo por las cepas de L. acidophilus SS80 y S. thermophilus SS77 es superior al observado en otros estudios (29,42). En pruebas de selección de BAL se reportaron también cepas resistente a sales biliares (0,5 %, 1 %, 2 % y 3 %), pH (2,5, 3,5 y 7,6) y temperatura de 38 a 45°C (35).

La producción de sustancias inhibidoras se ha reportado para todo el género Lactobacillus y otros géneros como Lactococcus, Estreptococo, Lactobacillus, Leuconstoc y Pediococcusas, así como Enterococcus (43). En este estudio todas las cepas patógenas se inhibieron por L. acidophilus SS80 y S. thermophilus SS77, lo que demuestra la interacción de factores con efecto inhibidor (44). En trabajo de caracterización, mediante pruebas in vitro de cepas BAL procedentes de fuente animal para considerar su posterior aplicación como probiótico en animales, se encontró que la mayoría de las cepas evaluadas exhibieron actividad antagónica contra los patógenos B. cereus, S. aureus, S. typhimurium y P. aeruginosa (24,45). Resulta significativo el efecto inhibidor sobre patógenos implicados en procesos diarreicos y casos de toxiinfecciones alimentarias, como lo son Salmonela, E. coli, L. monocytogenes y Staphylococcus aureus. No obstante, no se tiene un completo análisis de la naturaleza de las sustancias antagónicas que producen las cepas evaluadas. Se describe por varios autores que en esta actividad pueden estar presentes los ácidos orgánicos, como el ácido láctico, peróxido de hidrógeno, dióxido de carbono, diacetilo, acetaldehído y sustancias de naturaleza proteica antimicrobiana, llamadas bacteriocinas (35,43).

Otra propiedad importante de los probióticos que debe ser evaluada es su capacidad para permanecer y colonizar el tracto gastrointestinal. La hidrofobicidad se basa en la propiedad que presentan las paredes celulares de las bacterias de conjugarse a los hidrocarburos. En general, se sugiere que este método puede emplearse gracias a la naturaleza hidrofóbica que presentan las adhesinas de la superficie celular (37). Los por cientos de hidrofobicidad que mostraron las cepas de L. acidophilus SS80 y S. thermophilus SS77, 48,4 % y 48,8 % respectivamente, fue de media según la clasificación utilizada (46). En estudios de lactobacilos de productos fermentados se encontraron cepas que mostraron valores de hidrofobicidad y autoagregación <60 % (40) y entre 55,03 % y 30 % para cepas de origen intestinal (37): mientras que Sanchez y Tropms (24) reportan valores de hidrofobicidad de cepas de Lactobacillus sp. y Streptococcus sp. por encima de 82 % y para Lactococcus sp. y Pediococcus sp. inferiores al 50 %. Resultados con rangos similares también reportaron Frizzo et al. (47).

En los pasos iniciales de la adhesión microbiana es fundamental que exista una interacción hidrofóbica entre la célula bacteriana y el sustrato de contacto. Un valor bajo de hidrofobicidad no indica que la cepa tenga menores posibilidades de adherirse al epitelio intestinal, ya que los dominios hidrofílicos podrían también estar implicados en el proceso de adhesión. Los mecanismos de adhesión pueden requerir la participación de distintos constituyentes de superficie que interactúan, de manera secuencial, para vencer las fuerzas repulsivas (48,49). Según estos resultados, ambas cepas presentan posibilidades de adherirse a la mucosa intestinal y, por tanto, la ventaja de desplegar acciones como barrera intestinal frente a microorganismos patógenos, activar el sistema inmune y mejorar la salud del hospedero.

Las dos cepas estudiadas fueron capaces de autoagregar, por lo que, a pesar de no haber existido coagregación frente a los dos patógenos utilizados, ese comportamiento la distingue frente a otras por su potencial actividad frente a microorganismos patógenos. La capacidad de agregación es una característica que puede utilizarse para iniciar el estudio de las interacciones microbianas. Hay una asociación entre la habilidad de los lactobacilos para adherirse al epitelio intestinal, la actividad de agregación y la hidrofobicidad de su superficie (50,51). Los resultados de agregación estuvieron dentro de los 120 minutos (2 h); rangos similares reportan Ehrmann et al. (52), al evaluar diferentes cepas de Lactobacillus y Streptococcus, existieron algunos microorganismos que no coagregaron con los patógenos utilizados, serotipos de Salmonella y Escherichia coli, pues una fuerte actividad de agregación no siempre se corresponde con un comportamiento similar en la coagregación.