Identificación de Streptococcus agalactiae en leche de bovinos afectados por mastitis en el occidente de Cuba

Las muestras de leche se descongelaron a 37ºC y se homogenizaron por agitación; posteriormente se sembraron 100 µL de cada una en placas de agar base (BIOLIFE, Italia) suplementada con 7 % de sangre desfibrinada de carnero (CENPALAB, Cuba). Las placas se incubaron de 24 a 48 horas a 37ºC. Las colonias con características morfológicas típicas de S. agalactiae (pequeñas, claras de aproximadamente 2 mm de diámetro, lisas y con β-hemólisis leve) se analizaron con las pruebas de catalasa, oxidasa y tinción de Gram. Los cultivos que revelaron cocos Gram positivos en forma de cadena, oxidasa y catalasa negativos, se sembraron en medio selectivo de Edward (OXOID, Inglaterra) suplementado con 7 % de sangre desfibrinada de carnero. Las placas se incubaron durante 48 h a 37ºC. Las colonias con características presuntivas de S. agalactiae (pequeñas, con tonalidad azul) se sometieron a la prueba de Christie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP), donde se sembró una estría de Staphylococcus aureus (ATCC25923) en el medio de placas de Agar base sangre y las líneas de cada una de las cepas sospechosas, así como las cepas de control positivo y negativo se estriaron perpendicularmente a la de S. aureus. Las cepas S. agalactiae (ATCC13813) y Enterococcus faecalis (ATCC 29212) se utilizaron como control positivo y negativo, respectivamente. La distancia entre dos líneas perpendiculares fue aproximadamente de 1-2 mm. Las placas se incubaron aeróbicamente a 37°C por 18-24 h. La reacción de CAMP positiva se observó en forma de punta de flecha de beta-hemólisis en la unión de las líneas perpendiculares (17).

Para la extracción de ADN se empleó la metodología descrita por Perreten et al. (18) con modificaciones. Se partió de cultivos en Agar Nutriente (BIOCEN, Cuba) de cada cepa identificada presuntivamente como S. agalactiae, incubadas por 48 horas a 37ºC. Se tomo ½ asada del cultivo y se introdujo en 450 µL de tampón de lisis (Tris-HCl 0,1 M, pH 8,5; Tween 20 (0,05 %) y 0,24 mg / mL de proteinasa K) durante 1 hora a 60°C, seguido de una desnaturalización de 15 minutos a 95°C. A continuación, se centrifugó a 10 000 rpm (Centrifuge Eppendorf 5415; Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) por cinco minutos y el sobrenadante se transfirió a un tubo eppendorf. El ADN se precipitó en dos volúmenes de etanol absoluto (Merck, Alemania) y 0,1 volumen de acetato de sodio 3M, pH 5,2 y se incubó a -20ºC durante 24 horas. A continuación, se centrifugó a 10 000 rpm durante 15 minutos y se eliminó el sobrenadante. El sedimento de ADN se lavó una vez con etanol a 70 % y, después de 5 minutos de centrifugación a 10 000 rpm, se secó al vacío y se resuspendió en 100 µL de agua estéril libre de nucleasas.

La pureza e integridad del ADN extraído se verificó por electroforesis en gel agarosa a 0,8 %, teñido con bromuro de etidio y posterior visualización en un transiluminador de luz ultravioleta (Macrovue 2011, LKB). La concentración de ADN se determinó por espectrofotometría a 260 nm con espectrofotómetro (ETX-F20-L).

Se realizó la identificación por PCR mediante la amplificación de un fragmento de 270 bp del segmento intergénico 16S - 23S rRNA específico para S. agalactiae. Se utilizaron los cebadores STRA-AgI F-5´- AAGGAAACCTGCCATTTG - 3'; STRA-AgII R - 5'-TTAACCTAGTTTCTTTAAAACTAGAA - 3', (13). La reacción se realizó en un volumen final de 2,5 μL que contenía: 0,625 U de GoTaq® Flexi DNA Polymerase (Promega, USA), 5µL de solución tampón 5X Green GoTaq® Flexi, 2.,5 µL de MgCL₂ 25 mM; 0,5 µL de la mezcla de dNTPs 10mM, 0,4 μM de cada cebador y 3 µL de ADN. La PCR se realizó en un termociclador eppendorf Termal cycler C1000®, con el siguiente perfil térmico: un ciclo inicial de 94ºC por tres minutos, 40 ciclos en condiciones de 94°C por 30 segundos, 58ºC por 45 segundos y 72ºC por un minuto y un ciclo final de 72ºC durante siete minutos. Los productos resultantes se analizaron por electroforesis en gel de agarosa 1,5 % en 0,5X Tris -Borato-EDTA. Los geles se tiñeron con una solución de 0,5 g/mL de bromuro de etidio; posteriormente, se visualizaron en un transiluminador UV (Macrovue 2011, LKB) y se fotografiaron.

Los valores de prevalencia de mastitis (general), clínica y subclínica (grado dos y tres), a nivel de animales en cada una de las razas estudiadas se muestran en la Tabla 1.

De acuerdo a los resultados de la prueba de CMT y al examen clínico realizado al momento del ordeño, la prevalencia general de mastitis fue superior a 43 % para el total de animales y entre 30 y 50 % en las tres razas de animales analizados con cualquiera de las manifestaciones de la enfermedad (Tabla 1).

Los valores de mastitis por animal resultaron ligeramente superiores a 39,1 %, valor referido por Ruiz et al. (15) en 383 animales con ordeño mixto. Sin embargo, fueron inferiores a los valores superiores a 60 %, reportados con anterioridad en Cuba (19,20,21,22) en rebaños con ordeño mecanizado. De igual manera, resultaron inferiores a 45,4 % referido por Sanchez et al. (23) en Colombia y a datos de África superiores a 60 % (24).

Los valores de prevalencia para mastitis clínica general obtenidos en este estudio se encuentran entre los datos reportados en Cuba por Armenteros et al. (25) y Novoa et al. (21), de 3,0 y 5,0 %; así como los de Ruiz et al. (15,19) de 0,9 % y 1,8 % en rebaños predominantemente Siboney y con ordeño mecánico, respectivamente. Sin embargo, cuando este parámetro se analizó por raza se observaron coincidencias entre los bajos valores obtenidos en este estudio para el Siboney de Cuba y Jersey con los datos referidos por Ruiz et al. (15,19), al igual que el 5,36 % observado en la raza Holstein y los valores encontrados por Armenteros y et al. (25), Relova et al. (20) y Novoa et al. (21), quienes refirieron valores superiores a 4 %. El diagnóstico clínico y/o subclínico depende de cuán detenidamente se observe a la vaca y sugiere que los valores muy bajos de mastitis clínica se debe, en ocasiones, a falta y/o deficiencias de diagnóstico (15).

La prevalencia de mastitis subclínica, calculada solo a partir de los resultados grado 2 y 3 del CMT, mostró un valor general por encima de 40 %.

En los lecherías estudiadas se obtuvieron diferentes valores de prevalencia que abarcan un rango desde 11,7 a 100 %; además, se observaron diferencias estadísticamente significativas, entre estas, con respecto a los valores de prevalencia de mastitis (Fig. 1), lo cual demuestra que, además de la raza, existen otros elementos predisponentes entre los rebaños estudiados, asociados con prácticas de manejo, el número de partos o lactancias, la etapa de la lactancia, el nivel de producción y la rutina e higiene del ordeño que, sin duda, influyeron en estos resultados. La enorme cantidad de vacas con mastitis presentes en algunos de los rebaños es muestra de un ineficiente control de la mastitis infecciosa y de un pobre manejo de la mastitis mediambiental, problemas que también se señalan por otros autores en trabajos recientes en Cuba (14).

La mastitis subclínica es de 15-40 % más prevalente que la mastitis clínica en rebaños afectados (19). En el presente estudio la diferencia observada, de manera general, fue de aproximadamente 40 %. De modo más específico, en las razas Holstein y Jersey fue cerca de 30 %; sin embargo, en la raza Siboney de Cuba se observó 51 %.

Los valores promedio de mastitis subclínica general y a nivel de razas de este estudio, a pesar de no incluir los valores de grado traza y 1 de CMT, resultaron similares o superiores al 38,2 % referido por trabajos recientes (15) y a los 28,3 y 18,1% reportados en la década pasada (26,27), respectivamente. En trabajos anteriores realizados en Cuba en el siglo pasado, y mencionados por Ruiz et al. (2), también se encontraron prevalencias superiores (45,1 y 45,5 %); de igual manera, en la década pasada fueron referidos 62,2 y 76,9 % (20,22).

Trabajos más recientes mostraron valores superiores al obtenido en esta investigación, como es el caso de 47,3 y 59 % en ganado Siboney con ordeño mecanizado (14,19), inferior también a 60 % referido por García et al. (3) en un estudio realizado igualmente en el occidente de Cuba con animales Holstein y ordeño mecanizado.

El análisis estadístico de los datos de prevalencia de mastitis encontradas en las razas estudiadas confirmó con valores estadísticamente significativos las diferencias observadas. Para la mastitis general y subclínica, las razas Holstein y Jersey no mostraron diferencias entre ellas, pero sí respecto a la raza Siboney de Cuba y, para el caso de la mastitis clínica las razas Siboney y Jersey, no fueron diferentes entre ellas, pero sí con relación a Holstein (Fig. 2).

Este resultado es una evidencia de la influencia de la raza sobre la prevalencia de la enfermedad. Varios autores han comentado acerca de la influencia racial en la mastitis bovina y se ha evidenciado la elevada susceptibilidad de razas como la Holstein con respecto a otros cruces (20,28). Coincidiendo con estos reportes, en el presente estudio los mayores valores de mastitis clínica se observaron en rebaños de esta raza. Sin embargo, los mayores valores de mastitis general y subclínica estuvieron asociados a los rebaños mestizos (5/8Holstein -3/8Cebú) de Siboney de Cuba, con valores similares a los mostrados por autores cubanos en años recientes (14,19).

En este sentido, autores como Lakew et al. (24) refirieron prevalencias de mastitis estadísticamente superiores en ganado de cruce (Holstein-Cebú) con respecto al ganado Cebú en Etiopía. Algunos factores intrínsecos del animal asociados a la mastitis, como son la forma de los pezones, el tono del esfínter, la anatomía del canal del pezón y la susceptibilidad al debilitamiento del ligamento suspensorio (ubre pendulosa), están predispuestos genéticamente (24,29). Se ha demostrado que la selección genética dirigida al aumento de la producción de leche tiene un efecto perjudicial sobre el estado de salud de la glándula mamaria. Por lo tanto, la enfermedad es un problema, principalmente en rebaños de alta producción que se crían de forma intensiva (30).

Se estima que un rebaño lechero en apariencia sano tiene entre 15 y 45 % de sus vacas en producción con mastitis subclínica en algún momento de su periodo de producción y que la capacidad potencial para producir leche se reduce hasta 35 % (31). Los valores promedio de prevalencia de mastitis subclínica obtenidos en este estudio fueron inferiores a 40 %, lo que parece sugerir una cierta mejoría en la salud de la ubre, principalmente en los rebaños de las razas Holstein y Jersey, a diferencia de los rebaños Siboney de Cuba, en los cuales resulta preocupante la elevada prevalencia observada, ya que se supone que están mejor adaptados a las condiciones tropicales de Cuba y componen la mayoría de los rebaños lecheros cubanos. Estos resultados pueden estar asociados a la falta de higiene durante la rutina de ordeño, mal funcionamiento o mal estado de las máquinas y accesorios utilizados durante el ordeño de estos rebaños, además de las afectaciones en el fluido eléctrico que pueden provocar demoras o suspender el proceso de ordeño (19).

La variabilidad en los reportes de prevalencia de cualquiera de las manifestaciones de mastitis sugiere la complejidad de esta enfermedad, la cual envuelve la interacción de multiples factores, principalmente los relacionados con las prácticas de manejo del rebaño, la rutina e higiene de los sistemas de ordeño, la raza de los animales del rebaño, las condiciones ambientales, los factores de riesgo para el animal, los agentes causales y los dependientes del animal, como son la estructura de la ubre, la edad, los días y la cantidad de lactancias; por tanto, es de esperarse que las prevalencias varíen entre los diferentes escenarios donde se evalúe este parámetro (24,30).

Se observó una prevalencia general de 4,22 % de cuartos atrofiados, donde el mayor por ciento se detectó en animales de la raza Siboney de Cuba. El análisis de comparación de proporciones para los cuartos atrofiados indicó diferencias significativas entre las razas Siboney y Jersey, pero no se encontró entre estas y la raza Holstein. Esta elevada prevalencia de cuartos atrofiados demuestra la presencia de mastitis crónica en estos rebaños que conlleva a cuartos atrofiados, así como la no aplicación de antibióticos para el tratamiento inmediato de mastitis clínica o el inadecuado manejo de los animales afectados y de esta manera evitar la pérdida del cuarto. Este valor resulta superior a 3,8; 3,1 y 3 % reportados con anterioridad (14,15,19) y es muy similar a datos referidos en la década pasada (4,8 %) en rebaños con ordeño mecánico en la provincia Mayabeque (32).

Coincidentemente, la raza Siboney fue también la que más cuartos afectados por mastitis mostró. Se observaron diferencias estadísticamente significativas entre las tres razas al analizar el número de cuartos afectados por mastitis, en cualquiera de sus variantes (Fig. 3). Desde el punto de vista de los cuartos, los valores de prevalencia de mastitis observados resultan muy inferiores a los reportados en Cuba en los últimos años (14,15,19); lo anterior pudo estar dado a que en el presente análisis no se consideraron los resultados de traza y grado 1 de mastitis por el CMT.

En la Tabla 2 se ilustran los cuartos afectados por animal y por raza. El 43,46 % de los animales analizados tenía al menos un cuarto afectado por mastitis. El 29,52 % (248) de las muestras colectadas correspondieron a animales individuales, 6,01 % de los animales mostró dos cuartos afectados, 5,11 % tres cuartos afectados y 2,73 % de las vacas muestreadas tenían los cuatro cuartos afectados. Es importante señalar que, de estos últimos animales, el mayor por ciento correspondió a animales Siboney de Cuba y no se encontraron animales de la raza Jersey con cuatro cuartos afectados. Siboney de Cuba fue la raza que más animales presentó con más de un cuarto afectado, seguido de las Holstein y, en menor medida, las vacas de la raza Jersey.

En algunos estudios las vacas de la raza Holstein han mostrado un riesgo mayor de sufrir mastitis, en comparación con vacas de las razas Jersey y de otros cruces (28). La selección intensa por parámetros de producción en algunas razas lecheras podría influir negativamente en su propensión a mastitis, es decir, que las vacas con altos registros de producción son más propensas a contraer mastitis (33).

De las 574 muestras de leche analizadas por cultivo microbiológico, en 9,93 % (n=57) se aislaron cepas con características morfológicas y bioquímicas distintivas de S. agalactiae (Fig. 4). Los resultados de prevalencia del microorganismo fueron superiores a 6,8 % que mencionaron Novoa et al. (22) en trabajos realizados en rebaños con ordeño mecanizado en provincias del occidente de Cuba. Sin embargo, resultaron inferiores a 12 % mencionado por Relova et al. (20) en ganado Holstein de la provincia Mayabeque; al 16 % reportado por Alfonso et al. (14) en rebaños Siboney de Cuba en la provincia Villa Clara y a 68 % referido por Ruiz et al. (19). Estos resultados están en concordancia con los referidos por Ruiz et al. (15) con 10 % de prevalencia de este patógeno en rebaños con ordeño mixto de diferentes zonas geográficas de Cuba.

El análisis, por el ensayo de PCR, de las 57 aislados diagnosticados presuntamente como S. agalactiae reveló una banda de 270 pb en 43 y resultó negativo en 14 de ellos (Fig. 5). Los cebadores para la amplificación del segmento intergénico 16S-23S RNA de S. agalactiae empleados en este estudio se usan ampliamente en el diagnóstico específico del patógeno en muestras de leche (13,34).

Phuektes et al. (13) y Wu et al. (34) han referido que 5,9 % (1/17) y 3,8 % (7/182) de las muestras con diagnóstico microbiológico positivo a S. agalactiae, revelaron un resultado por PCR negativo. En el presente estudio, 24,56 % (14/57) de las muestras, inicialmente diagnosticadas como S. agalactiae, mostró este comportamiento.

Como se mencionó anteriormente, el diagnóstico microbiológico del S. agalactiae se basó en características del cultivo, la negatividad para las pruebas catalasa y oxidasa y positividad a la prueba de Camp. Las dos primeras son ensayos que definen al género Streptoccocus, mientras el factor CAMP se considera una prueba presuntiva para identificación de S. agalactiae (15,17).

Según varios autores, el factor CAMP es altamente específico para S. agalactiae, por lo que casi la totalidad de las cepas de esta especie muestran una reactividad positiva al ensayo (17). Sin embargo, se describe que otras especies de Streptococcus poseen genes similares al cfb que codifica para este factor; como Streptococcus piogenes, Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae y Streptococcus bovis, las cuales bajo determinadas condiciones muestran una reactividad similar a la del S. agalactiae en este ensayo (35,36).

Las 14 muestras negativas a la PCR pudieran corresponder a algunas de las otras especies de Streptococcus mencionadas anteriormente. En la última década se han referido prevalencias de Streptoccocus spp. en rebaños afectados por mastitis en Cuba, con valores que oscilan entre 2,9 y 75 % (2,3,14,15,19), razón por la cual se puede inferir la circulación de algunas de estas cepas de Streptococcus spp. en los rebaños estudiados.

Los aislados positivos se obtuvieron de 40 (10,95 %) vacas provenientes de ocho de las lecherías estudiadas, lo que evidencia que más de 50 % de los rebaños estudiados estaban afectados por S. agalactiae. La diferencia entre el número de aislamientos realizados y animales infectados se debe al aislamiento del microorganismo en dos de sus cuartos en tres animales (dos Holstein y uno Siboney); se aisló el microorganismo en dos de sus cuartos.

La mayor frecuencia de aparición del microorganismo se encontró en los rebaños Siboney con 20 animales procedentes de cuatro unidades, seguido de los rebaños Holstein con 16 ejemplares de dos unidades y Jersey con cuatro vacas de dos unidades. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre el número de aislados encontrados entre las razas Holstein y Siboney, aunque sí entre estas dos respecto a la raza Jersey (Fig. 6). La lechería con mayor frecuencia de aislados y animales infectados fue de la raza Holstein, con 13 aislamientos provenientes de 11 animales, el resto de las lecherías osciló entre tres y 10 aislamientos.

En el Tabla 3 se puede observar la relación entre los aislamientos de S. agalactiae, la clasificación por CMT y la raza de los animales de donde se aisló la bacteria. El 7,2 % (40/555) de los cuartos con mastitis subclínica y el 15,8 % (3/19) de los cuartos clínicos resultaron infectado por S. agalactiae. Se observó la mayor prevalencia de la bacteria en los cuartos con mastitis subclínica grado tres y dos, los cuales representaron el 93,02 % del total de aislados identificados, el resto se identificó en cuartos clínicos.

Las diferencias estadísticamente significativas encontradas entre las tres clasificaciones de cuartos analizados y los aislamientos con S. agalactiae coinciden con autores que refieren que, por lo general, las infecciones con este microorganismo son causa de casos subclínicos y solo son responsables de un pequeño porcentaje de los cuartos con mastitis clínicas. Si se considera la inflamación de las ubres, los problemas sistémicos de la vaca o la pérdida de cuartos mamarios, las infecciones con S. agalactiae son relativamente leves. Normalmente, estas infecciones no resultan en mastitis agudas o en la muerte del animal. Sin embargo, algunos de los cuartos infectados pueden dejar de producir leche (31).

Para controlar eficazmente la mastitis bovina se requieren pruebas sensibles, rápidas y específicas que permitan detectar e identificar, de manera certera, los principales patógenos que la causan. Los valores de prevalencia de mastitis, y específicamente de la infección por S. agalactiae encontrados en el presente estudio, no resultan alarmantes si se comparan con trabajos similares en Cuba (2) y con reportes internacionales (4,24); no obstante, es importante recordar que S. agalactiae se considera una de las causas más comunes del incremento en el recuento de células somáticas en leche de tanque, lo que implica que disminuya la calidad físico-química e higiénico sanitaria de la leche y conduzca a pérdidas económicas considerables para el productor (31).

El empleo de herramientas moleculares para la identificación de este importante patógeno durante este estudio permitió incrementar la especificidad en la identificación del mismo, corroborando una vez más la utilidad de este tipo de metodologías en el diagnóstico de microorganismos de interés para la salud y la economía.

La naturaleza altamente contagiosa de este microorganismo. desde animales infectados hacia no infectados durante las rutinas de ordeño y manejo del rebaño (6), así como las recientes evidencias de nuevas rutas de transmisión zoonótica y/o antropozoonótica entre humanos y vacas (8,10), sugieren que deben implementarse con urgencia programas preventivos y de diagnóstico de forma regular con el objetivo de controlar o mitigar la infección de S. agalactie en rebaños lecheros afectados, para así disminuir los riesgos que este microorganismo implica para la salud humana y animal en estas interfaces.