INTRODUCCIÓN
El cultivo celular juega un papel importante en la biotecnología moderna y en el desarrollo de numerosos proyectos de investigación (1). La contaminación de estos cultivos por hongos y bacterias es frecuente y tratable; sin embargo, se produce una contaminación grave y no fácilmente detectable por micoplasmas (2).
Estos microorganismos se aislaron por primera vez de un cultivo celular en 1956 por Robinson y Wichelhausen (3). Desde entonces y hasta la fecha, alrededor de 20 especies se describen como contaminantes en los cultivos celulares, donde Mycoplasma arginini, Mycoplasma salivarium, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma orale y Acholeplasma laidlawii se identifican como causantes del 95 % de las contaminaciones (4). La incidencia de contaminación a nivel mundial de los cultivos celulares para una especie se encuentra entre 15 y 80 %; mientras que la coinfección puede encontrarse hasta en 60 % (5).
Se conoce que las especies Mycoplasma orale, Mycoplasma fermentans y Mycoplasma hominis se hallan comúnmente en el tracto orofaríngeo de los humanos, lo cual supone que el personal de laboratorio constituye una de las fuentes de contaminación de los cultivos celulares con micoplasmas (6). Por otra parte, Mycoplasma arginini y Acholeplasma laidlawi son frecuentemente identificadas en el suero bovino y Mycoplasma hyorhinis es un patógeno frecuente de cerdos, de ahí que, tanto el suero bovino como el porcino que se utilizan para la elaboración de los medios de cultivo, pueden ser también una fuente posible de contaminación (7).
Otras fuentes de contaminación se relacionan con los animales de laboratorio (8), con embriones de pollos (9) y con los tejidos que se utilizan para la elaboración de cultivos primarios; de igual manera, las líneas celulares ya contaminadas pueden propagar la contaminación de micoplasmas (10).
Dada la importancia de la detección de las especies de micoplasmas más frecuentes en los cultivos celulares y la posibilidad de identificar la probable fuente de contaminación, el estudio tuvo como objetivo desarrollar ensayos PCR especie-específicos para la identificación de las especies más frecuentes de micoplasmas en cultivos celulares.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas de micoplasma
Se emplearon cepas de referencia pertenecientes a la Colección de Cultivos tipo Americana (ATCC, de sus siglas en inglés American Type Culture Collection) de Mycoplasma orale (ATCC15544), Mycoplasma fermentans (ATCC 19989), Mycoplasma salivarium (ATCC 23064) y de la Colección Nacional de Cultivos tipo Inglaterra (NCTC del inglés National Collection Type Culture) Mycoplasma arginini (NCTC 10129), Mycoplasma hyorhinis (NCTC 10130) y de la Farmacopea Europea (Ph. Eur., de sus siglas en inglés European Pharmacopoiea) Acholeplasma laidlawii, pertenecientes todas a la colección de cepas del laboratorio MYCOLAB, CENSA, Cuba.
Siembra de las cepas
El cultivo de las cepas se realizó según lo descrito por Poveda (10). Se incubó durante 15 días en condición demicroarofilia y se realizaron lecturas cada 48 horas en el microscopio óptico marca Epson.
Extracción de ADN
De cada cultivo positivo a micoplasmas se tomó 1mL y se transfirió estérilmente a un tubo (Eppendorf de 1,5mL; se centrifugó a 12 000 rpm por 10 min; el sobrenadante se desechó y el sedimento se resuspendió en 1mL de tampón fosfato salino (PBS) estéril y se homogenizó con agitación durante 2 minutos; luego, se repitió la centrifugación. Nuevamente el sobrenadante se desechó y el sedimento se resuspendió en 0,1 mL de agua destilada estéril. Se homogenizó durante 1 minuto y se colocó la suspensión en bloque térmico (Labnet, E.U.A.) a 100ºC durante 10 minutos e inmediatamente se colocó en un recipiente con hielo. Cada vial se conservó a -20ºC hasta posterior utilización, según lo descrito por Hernández et al. (11). La calidad y concentración del ADN se determinaron en el equipo ThermoScientific Nanodrop 2000 Spectrophotometer.
Cebadores
Los cebadores utilizados (Tabla 1) amplifican una región correspondiente al ARNr 16S de cada una de las especies de micoplasmas a diagnosticar mediante los ensayos de PCR especie-específicos.
Tabla 1.
Secuencia nucleotídica de los cebadores utilizada para la amplificación del ADN de micoplasmas./ Nucleotide sequence of primers used for mycoplasma DNA amplification.
| Especie | Secuencia nucleotídica (5´-3´) | Talla del fragmento (pb) | Referencia |
|---|---|---|---|
| M. arginini | S: TGA TCA TTA GTC GCT GGA GAG TC | 326 | Kazemiha et al.(12). |
| AS: TAT CTC TAG AGT GCT CGA CA TGA CTC | |||
| M. orale | S: TGA TCA TTA GTC GGT GGA AAA CTA | 325 | |
| AS: TAT CTC TAG AGT CCT CGA CA TGA CTC | |||
| M. fermentans | S: TGA TCA TTA GCT GAT GGG GAA CT | 324 | |
| AS: TCT CTT AGA GTC CTC AAC TAA ATG | |||
| Acholeplasma laidlawii | S GAT GAG AAC TAA GTG TTG GCC ATA A | 300 | |
| AS: CGC TAG AGT CCC CAA CTT AAT GA | |||
| M. salivarium | S: ATGGATTGTAAAGTGCTGTTGCTAG | 434 | Timenetsky et al. (19). |
| AS: GCGTCAACAGTTCTCTGCCG | |||
| M. hyorhinis | S: GTA GTC AAG CAA GAG GAT GT | 346 | Assunçâo et al. (18). |
| AS: GCT GGA GTT ATT ATA CCA GGA |
Leyenda: S: sentido; AS: antisentido
Realización de la PCR
Para lograr la identificación de las especies de micoplasmas más frecuentes se realizó la amplificación a partir del ADN extraído del cultivo de cada una de las cepas descritas con anterioridad. La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 25 μL, que contenía1X solución tapón II (Promega), 200 µM de cada dNTPs (Promega); 15 pmoles de cada cebador, 1,5 mM de MgCl2 (Promega), 1 U de Taq polimerasa (Promega) y 3 µL de muestra de ADN de cepa de referencia. Se empleó agua libre de nucleasas como control negativo de la reacción. La reacción de PCR se desarrolló en un Termociclador (Eppendorf Mastercycler Gradient) con el siguiente programa de amplificación:1 ciclo de a 94ºC por 3 minutos, 32 ciclos de 94ºC por 60 segundos, 60ºC por 30 segundos y 72ºC por 60 segundos, seguidos de un ciclo de 72 por 5 minutos. La corrida se realizó en gel de agarosa (Sigma) al 1 % con TBE 0,5X, en cámara de electroforesis 2012 Maxiphor (LKB Bromma) con fuente (ShandonSouthern), a 100 Volts y 50 mA, durante 30 minutos. Los geles se tiñeron n bromuro de etidio con 0,5 μg/mL y los resultados se visualizaron en un transluminador de luz ultravioleta MacroVue (Pharmacia). Se utilizó un marcador de peso molecular de 100 pb (Promega).
Optimización de los parámetros críticos
La temperatura de hibridación del ensayo se evaluó entre el rango de 50ºC a 60ºC y se mantuvieron constantes el resto de los parámetros de la reacción.
Para la determinación de la concentración óptima de MgCl2 se realizó una curva partiendo desde 0,5 mM hasta 4,5 mM, con incrementos de 0,5 mM (13,14). Para determinar este parámetro se trabajó con la temperatura de hibridación obtenida anteriormente. En la determinación de la concentración óptima de cebadores se emplearon concentraciones desde 0,1 uM hasta 0,6 uM, con incrementos de 0,1 uM, según lo descrito por Bolivar et al. (15). La PCR se realizó con la temperatura de unión y concentración de MgCl2 óptimas seleccionadas previamente.
Determinación de la sensibilidad y la especificidad analítica
Se realizaron diluciones seriadas del ADN de cada una de las cepas (10 ng/μL- 1fg/μL), según lo recomienda Santos et al. (16). En el caso de la especificidad, el ensayo se realizó según lo recomienda la Farmacopea Europea (17) para la evaluación de la especificidad en los ensayos de PCR para la detección de micoplasmas contaminantes en cultivos celulares.
Evaluación del ensayo en muestras
Se estudiaron 58 cultivos celulares positivos a Mollicutes, según lo reportado por Lobo et al. (18).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los estudios de factibilidad se consideran como una etapa preliminar antes de la optimización (19). Esta fase nos indica si podemos o no continuar con el proceso de estandarización, lo cual depende de la correcta elección de los cebadores y del ADN blanco, parámetros críticos a tener en cuenta para el desarrollo de un sistema de PCR (20).
En la Figura 1 se puede observar la amplificación del ADN diana para cada una de las especies estudiadas, según lo descrito por Kazemiha et al. (12).
Figura 1.
Electroforesis en gel de agarosa al 1 % de los productos amplificados por PCR. PPM: Patrón de peso molecular de 100 pb (Promega); Línea 1: M. hyorhinis (346 pb); Línea 2: M. fermentans (324 pb); Línea 3: A. laidlawii (300 pb); Línea 4: M. salivarium (434 pb); Línea 5: M. orale (325 pb); Línea 6: M. arginini (326 pb); Línea 7: control negativo de la reacción, agua libre de nucleasas. / Agarose gel electrophoresis at 1 % of PCR-amplified products PPM: 100 bp molecular weight marker (Promega); Line 1: M. hyorhinis (346 bp); Line 2: M. fermentans (324 bp); Line 3: A. laidlawii (300 bp); Line 4: M. salivarium (434 bp); Line 5: M. orale (325 bp); Line 6: M. arginini (326 bp); Line 7: negative reaction control, nuclease-free water.
El sistema de PCR es reproducible en estas condiciones, pues se observa la amplificación de los ADN diana de las cepas utilizadas y los amplicones de cada una de ellas se corresponde con lo descrito por Kazemiha et al. (12) y Timenetsky et al. (21). La temperatura de alineamiento (Ta) es un parámetro crítico que necesita optimizarse en el PCR. Generalmente, la Ta adecuada comprende un rango de ±5ºC del cebador con la menor temperatura de fusión (22). Como resultado de este trabajo se evidencia, en todas las especies estudiadas, amplificaciones con Ta de 60ºC y 60,5ºC, aunque se observan pequeñas diferencias en la intensidad de las bandas amplificadas con respecto al resto de las temperaturas empleadas (Fig. 1). Estos resultados pueden estar dados porque las Ta muy elevadas tienden a disminuir la sensibilidad del método, pues los cebadores se unirán a la banda específica, pero con una fuerza y probabilidad de unión muy pequeñas. Por otra parte, la obtención de bandas de menor intensidad en las Ta cercana a 50ºC, para la mayoría de las especies trabajadas, puede estar dado porque a temperaturas bajas de alineamiento se obtienen productos inespecíficos (23).
Figura 2.
Electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Determinación de la temperatura de hibridación óptima para cada especie. PPM: Patrón de peso molecular de 100 pb (Promega); Línea 1-12: temperaturas (50ºC; 50,2ºC; 50,7ºC; 51,6ºC; 52,8ºC; 54,1ºC; 55,4ºC; 56,9ºC; 57,1ºC; 59,2ºC; 60ºC; 60,5ºC), Línea 13: control negativo de la reacción, agua libre de nucleasas. / Agarose gel electrophoresis at 1 %. Determination of the optimal hybridization temperature for each species. PPM: 100 bp molecular weight marker (Promega); Line 1-12: temperatures (50ºC; 50.2ºC; 50.7ºC; 51.6ºC; 52.8ºC; 54.1ºC; 55.4ºC; 56.9ºC; 57.1ºC; 59.2ºC; 60ºC; 60.5ºC), Line 13: negative reaction control, nuclease-free water.
A partir de estos resultados, se seleccionó 55ºC como la temperatura óptima de alineamiento para los PCR especie-específicos que se optimizan, lo cual coincide con Sung et al. (24), Guevara (25) y Espinosa (26), quienes recomiendan utilizar Ta entre 50ºC y 58ºC. No obstante, es importante señalar que la selección de la Ta está en correspondencia con la Tm de los cebadores que se utilizan en cada ensayo y siempre debe tenerse presente, en la selección de la misma, la no formación de dímeros o que no afecte la especificidad y la sensibilidad del mismo.
Figura 3.
Electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Determinación de la concentración óptima de MgCl2. PPM: Patrón de peso molecular de 100 pb (Promega); Línea 1-9: concentraciones de MgCl2 (0,5 mM 1 mM;1,5 mM;2,0 mM; 2,5 mM; 3,0 mM; 3,5 mM; 4,0 mM; 4,5 mM). Línea 10: control negativo de la reacción, agua libre de nucleasas, amplificación con 1.5 mM de MgCl2. / Agarose gel electrophoresis at 1 %. Determination of the optimum MgCl2 concentration. PPM: 100 bp molecular weight marker (Promega); Line 1-9: MgCl2 concentrations (0.5 mM 1 mM; 1.5 mM ; 2.0 mM; 2.5 mM; 3.0 mM; 3.5 mM; 4.0 mM; 4.5 mM), Line 10: negative reaction control, nuclease-free water, amplification with 1.5 mM of MgCl 2.
Debido a que los iones magnesio (Mg2+) actúan como cofactores de la Taq polimerasa, su concentración en la reacción puede modificar el rendimiento de la misma en el ensayo, pues en ausencia o en baja concentración de Mg2+ libre, se afecta la actividad de la enzima, mientras que un exceso de dichos iones reduce su fidelidad y se promueven amplificaciones inespecíficas (27).
Los resultados, a partir de la amplificación con diferentes concentraciones de MgCl2, se muestran en la Figura 3. Como se observa, no se obtuvo amplificación cuando se utilizó 0,5 mM de MgCl2. La amplificación del ADN diana se evidenció a partir de 1 mM y las bandas más intensas se observaron para 1,5 mM y 2 mM de MgCl2 en las especies Mycoplasma arginini, Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma fermentans y Mycoplasma hyorhinis.
Estos resultados coinciden con Hernández et al. (28) y lo que refiriere Promega Protocols (23) sobre la concentración adecuada de MgCl2, la cual usualmente se encuentra entre 1,5 mM a 3,0 mM. Como se menciona anteriormente, este es un factor crucial, pues puede afectar el funcionamiento del ensayo de PCR (27). Se seleccionó el valor de 1,5 mM como concentración óptima de MgCl2, donde se observó una banda intensa de amplificación para todas las especies. El empleo de esta concentración (1,5 mM) como óptima coincide con lo descrito por Sung et al. (24), quienes señalan que es importante emplear la mínima concentración requerida para que el sistema funcione, ya que un exceso de MgCl2 reduce la fidelidad de la enzima y puede incrementar las uniones inespecíficas, tal y como se expresó anteriormente.
De igual manera, la concentración de los cebadores constituye otro de los puntos críticos a evaluar cuando se optimiza un ensayo de PCR. A partir de la evaluación de este parámetro, en un rango de concentraciones desde 0,1 µM hasta 0,6 µM, se seleccionó el valor de concentración óptima para cada uno de los cebadores. Esto permitió la visualización, de forma consistente, de la amplificación de una banda de intensidad para cada una de las especies.
En el caso de Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma hyorhinis y Mycoplasma fermentans, se seleccionó la concentración óptima de cebadores de 0,3 µM; para Acholeplasma laidlawii y Mycoplasma salivarium se seleccionaron las concentraciones óptimas de 0,4 µM y 0,5 µM, respectivamente.
Estos resultados coinciden con Bolívar et al. (15), pues refieren que la concentración de cebadores a emplearse en un ensayo de PCR oscila, generalmente, en el intervalo de 0,1 µM-0,5 μM. Sin embargo, no coinciden con Pérez (27) y Burgher (19), quienes señalan la concentración óptima de cebadores de 1,0 μM y 0,4 μM, respectivamente. La selección de la concentración de cebadores, para cada ensayo de PCR, se relacionó con la mínima concentración requerida para que el ensayo funcione y sea capaz de detectar cada diana en estudio, ya que se conoce que un exceso de cebadores puede favorecer la aparición de productos inespecíficos, tal y como lo señala Hernández (23).
Tanto la especificidad como el límite de detección o la sensibilidad analítica son parámetros determinantes cuando se optimiza o valida un ensayo analítico (29). Este último parámetro es una de las mayores ventajas del PCR, lo que justifica su empleo en innumerables investigaciones (30). Se conoce el límite de detección como la mínima cantidad que es capaz de detectar el ensayo y puede representarse como número de copias del genoma, dosis infecciosa y unidades formadoras de colonias (UFC) del agente que se detecta (29).
Los resultados del límite de detección de los ensayos de PCR desarrollados, con el empleo del ADN de Mycoplasma orale, Mycoplasma hyorinhis, Mycoplasma fermentans, Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma salivarium y Mycoplasma arginini, demostraron que el ensayo fue capaz de detectar 1,1 pg/uL. Estos resultados coinciden con lo reportado por Lozada (30), quien logró un límite de detección similar 4,8 pg/uL en el estudio de validación de PCR para Mollicutes (29).
Es importante señalar que el límite de detección de un ensayo de PCR es variable y puede ser indicativo de la eficacia del método, ya que depende de factores como la temperatura de alineamiento, el número de ciclos, la enzima a utilizar, los métodos de extracción, la cantidad de ADN molde, entre otros (31). Todos estos factores se tuvieron en cuenta durante la optimización de los ensayos y los resultados muestran que poseen una elevada sensibilidad, aspecto muy importante cuando se desea emplear para el diagnóstico de micoplasmas.
Por otra parte, la especificidad analítica es la habilidad de un ensayo de distinguir o detectar el blanco específico de otros agentes infecciosos. Se determina con el empleo de patógenos genéticamente similares que se encuentran comúnmente como contaminantes de las muestras clínicas del agente a detectar, para el cual fue diseñado el ensayo (17,29,32). La Tabla 2 muestra el resumen de los parámetros óptimos obtenidos durante la optimización de los ensayos de PCR especia-específicos.
Tabla 2.
Resumen de los parámetros óptimos obtenidos durante la optimización de los ensayos de PCR especie-específicos. / Summary of the optimal parameters obtained during the optimization of species-specific PCR assays.
Leyenda: Ms: Mycoplasma salivarium, Mf: Mycoplasma fermentans, Mo: Mycoplasma orale, Mh: Mycoplasm ahyorhinis, Al: Acholeplasma laidlawii y Ma: Mycoplasma arginini.
Los ensayos optimizados resultaron ser específicos para la amplificación del ADN de las especies estudiadas, ya que no ocurrió amplificación cuando se realizó el PCR utilizando el ADN de las diferentes especies de micoplasmas y el ADN de bacterianas relacionadas filogenéticamente con los micoplasmas (17).
A las 58 muestras de cultivos celulares, donde se detectó la presencia de Mollicutes, se les realizó los diferentes PCR para identificar las especies contaminantes. Los PCR que se utilizaron permitieron identificar especies de micoplasmas en 56/58 (96,5 %) de las muestras; resultado que coincide con lo descrito por Assunçâo et al. (20); Timenetsky et al. (21) y Kazemiha et al. (12), por lo que se amplificó la banda correspondiente a cada especie. Solo en el caso de dos cultivos celulares no fue posible identificar la especie de micoplasmas que se encuentra presente como contaminante. Este resultado coincide con lo que reporta Nikfarjam y Farzaneh (33), quienes señalan, en el 1,2 % de las muestras investigadas, la presencia de Mollicutes como contaminantes sin que pudieran identificar la especie. Una posible explicación a este resultado es la presencia, en estos cultivos celulares, de alguno de los siguientes Mollicutes: Mycoplasma homini, Mycoplasma pirum, Mycoplasma bovis o Acholeplasma vituli, agentes que provienen de diferentes fuentes de infección y que también se reconocen como potenciales contaminantes de los cultivos celulares (34).
Los cultivos celulares contaminados por micoplasmas representan un hábitat artificial para estos microorganismos. Estudios en varios países demuestran que entre 10 % a 80 % de los cultivos celulares pueden quedar infectados por estos agentes (12). La presencia de una especie o la coinfección con otros agentes, también se reporta como un proceso donde los porcentajes dependen de varios factores (5,20,34).
Realizado este trabajo se concluye que los ensayos PCR especie-específico desarrollados son factibles de emplear para la identificación de especies de micoplasmas a partir de cultivos celulares.