Seguridad biológica de Lactobacillus plantarum 22 LMC con potencialidad probiótica

Se conformaron tres grupos experimentales de cinco animales, separados según el sexo, mantenidas en las condiciones de tenencia, manejo y alimentación descritas previamente hasta finalizar el experimento. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo a la Guía para el uso y cuidado de animales de laboratorio (7) y la aprobación del Comité de Ética del CENSA (Tabla 2).

La suspensión bacteriana se obtuvo a partir colonias de L. plantarum 22 LMC cultivadas en medio Mann Rogosa Sharp (MRS, Difco^TM EUA) bajo condiciones de anaerobiosis, según lo descrito por Vera et al. (4). Se inocularon en dos frascos con tapas de roscas con 400 mL de caldo MRS y se incubaron a 37°C durante 24 horas. Posteriormente, se centrifugaron a 7500 g y la biomasa resultante se resuspendió en solución salina a 0,8 %; se ajustó la concentración mediante el conteo de colonias correspondiente a 10¹² UFC mL^-1. La dosis 10¹² UFC mL^-1 se seleccionó según lo referido por Jin et al. (8), como la máxima que se le suministra como probiótico a los animales.

El preparado bacteriano se recepcionó 48 horas antes del experimento, de tal manera que se garantizó su poder germinativo y capacidad de infección al conservarlo a 4-8°C. Para el control de la viabilidad y de la inactivación por calor de las suspensiones, se sembró 0,2 mL de las suspensiones bacterianas (10¹² UFC mL^-1) en placas de agar MRS durante 24 a 48 horas, para corroborar el crecimiento en las placas. Una vez liberadas las suspensiones bacterianas, antes de la inoculación en las ratas se tuvieron en cuenta los siguientes aspectos:

Concluido el tiempo de evaluación (14 días), se sacrificaron todos los animales según los procedimientos descritos por Close et al. (9).

Se evaluaron los siguientes parámetros:

Los diferentes sistemas evaluados incluyeron ojos, mucosas visibles, piel y pelos, sistema circulatorio, sistema respiratorio, así como patronas de conducta, actividad motora, signos de incoordinación, convulsiones, salivación, sedación, estado de síndrome diarreico, muerte u otras alteraciones clínicas.

Posterior al sacrifico, se desarrolló el estudio de infectividad en los órganos mediante la siembra y la identificación bacteriológica de las muestras tomadas de animales inoculados con el probiótico de ensayo.

Se tomaron muestras de todos los animales del estudio, de los cuales se analizaron por examen bacteriológico los siguientes órganos y tejidos: corazón, riñón, bazo, hígado, pulmón, nódulos linfáticos y sangre. Las muestras se colocaron en placas de Petri estériles y se flameó la superficie; luego, con tijeras y pinzas estériles, se realizó un corte para efectuar la impronta en los medios de cultivo.

Las muestras se sembraron en agar sangre, agar Sabouraud y agar MRS líquido. Se realizaron dos réplicas. Las placas se incubaron en condiciones aeróbicas y para la anaeróbica se empleó una incubadora (ESCO CelCulture®, EUA) con una atmósfera de CO₂ de 10 % a 37°C.

Se realizó el examen de los cultivos a las 24, 48, 72, 96 horas para describir las características culturales del crecimiento, pruebas tintoriales y bioquímicas y para crecimiento de lactobacilos, como se describe por Sánchez et al. (10).

Se realizó el análisis macroscópico de los órganos corazón, riñón, bazo, hígado y pulmón para todos los animales. Posteriormente, se tomaron muestras para el estudio histopatológico, las que se procesaron por la técnica clásica de inclusión y cortes en bloques de parafina, previa fijación en formol neutro a 10 %; se colorearon con hematoxilina y eosina (Merck KGaA, Alemania).

Se analizaron 266 bloques de parafinas. Los fragmentos de pulmón, hígado, riñón, corazón y bazo, embebidos en parafina, se cortaron con el micrótomo (Leica RM2255, Alemania). Los cortes se extendieron en láminas y a continuación se procedió a la tinción con hematoxilina-eosina (11).

El estudio histológico incluyó el 100 % de los animales investigados. La identificación de las muestras fue única para cada animal y en todos los casos se mantuvo la identificación inicial de los bloques.

Los animales se anestesiaron con éter dietílico y las muestras de sangre se extrajeron de la comisura interna del ojo (seno orbital) mediante pipetas Pasteur. La sangre se colectó en viales con EDTA (10 μL de EDTA/mL de sangre) para su posterior procesamiento hematológico. Para la determinación de los parámetros bioquímicos se colectó sangre sin anticoagulante en viales de 2 mL; se dejó coagular a temperatura ambiente y se centrifugó a 6000 g en una centrífuga Eppendorf durante 10 minutos; posteriormente se colectó el suero.

Mediante el empleo del Contador electrónico de células Micros ABX de la firma ABX Diagnostic Systems, en el hemograma completo se determinaron la concentración de hemoglobina (HB), el conteo de eritrocitos (ETO), hematocrito (HCT), conteo de plaquetas (PLT), el volumen corpuscular medio (VCM), la hemoglobina corpuscular media (HCM), la concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM) y los leucocitos totales (LEUC).

El conteo diferencial de leucocitos incluyó conteo de neutrófilos (N), linfocitos (L), monocitos (M), eosinófilos (E) y basófilos (B); se determinó mediante técnica tradicional de extensión de sangre periférica; los resultados se expresan en valores relativos y absolutos.

Mediante el empleo de un analizador Automático Hitachi 704 de la Boehringer Mannheim con juego comercial de la misma firma, se determinaron los siguientes indicadores bioquímicos: Albúmina (Alb), Proteínas totales (PT), Glucosa (Gluc), Colesterol total (Chol-T), Triglicéridos (TG).

Los datos se procesaron mediante el paquete estadístico IBM® SPSS versión 21 (12). Como prueba de bondad de ajuste, para comprobar la normalidad de los datos, se empleó la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (DE) y se analizaron por ANOVA (análisis de varianza de una vía), seguido de la prueba de Dunnett para determinar las diferencias significativas entre los grupos tratados y el control negativo. Un valor de p≤0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Al analizar el peso de los órganos de los animales en estudio, no se observaron diferencias significativas entre el grupo control y los grupos tratados para el mismo sexo (Figs. 2 y 3).

En el examen macroscópico del corazón, pulmones, bazo, hígado y riñones, no se evidenciaron lesiones indicativas de toxicidad debido a la administración oral del producto.

En el examen histopatológico del pulmón, en todos los casos se observó una morfología normal. En la porción respiratoria se observaron apropiadas formaciones infundibuliformes que se resuelven en conductos alveolares, atrios, sacos alveolares y alvéolos. Todas estas estructuras desde el bronquiolo respiratorio hasta el alvéolo, conjuntamente con los vasos sanguíneos y nervios, no presentaron alteraciones. Tal estado califica a la unidad respiratoria del pulmón desde el punto de vista histológico y funcional estereotipado.

En el hígado de los animales evaluados se observó integridad estructural en la unidad histológica de este órgano (acino de Rappaport), con adecuados forma, tamaño y armonización de los hepatocitos (formación de cordones celulares alrededor de la vena central), morfología normal del sinusoide, así como de los canales que forman el espacio porta (arteria hepática, rama porta y conductos biliares).

En el bazo de cinco animales del ensayo, que pertenecen a los tres grupos de animales tratados, se observó ausencia de los centros germinativos, que no fue atribuible al producto de ensayo. En el resto de los órganos evaluados (riñón y corazón) no se mostraron cambios, por lo que en los animales estudiados no se mostraron alteraciones a nivel histológico asociadas al candidato probiótico de L. plantarum 22 MLC.

La toxicidad oral es una de las pruebas más utilizadas para determinar la inocuidad de cepas probióticas; a su vez, la translocación bacteriana es un indicador importante de la toxicidad, debido a que constituye el primer paso en el proceso de patogénesis de muchos microorganismos oportunistas habitantes del intestino (5). En los órganos evaluados no se observó crecimiento de bacterias, lo que permite plantear que los animales estudiados resultaron negativos a la translocación microbiana.

Los resultados coinciden con estudios previos, en los cuales varias dosis de diferentes cepas de lactobacilos, potencialmente probióticos, se administraron a ratones BALB/c durante semanas o meses (14) y no se observó translocación bacteriana en estos órganos de los ratones. En contraste, otros estudios reportan que las bacterias ácido lácticas pueden inducir la translocación de microbiota normal al hígado y bazo solo en dosis altas (15).

Sobre la base de los resultados del presente estudio, se considera inocua la cepa de L. plantarum 22 LMC para las ratas, teniendo en cuenta los criterios previamente expuestos sobre los estudios anatomopatológicos e histológicos, así como la ausencia de colonización de bacterias intestinales a nivel extraintestinal en el modelo in vivo evaluado.

En la Tabla 3 se muestra que no se observaron diferencias significativas entre los grupos; cuando se comparan los valores hematológicos con los referenciados para la especie, estos están dentro de lo reportado por León et al. (16) para ratas Sprague Dawley.

En la Tabla 4 se presentan los estudios de la bioquímica sanguínea de ratas Sprague Dawley inoculadas por vía oral con el candidato a probiótico de L. plantarum 22 LMC seleccionado. Existen diferencias significativas entre los grupos tratados y controles. Hay que destacar los resultados encontrados en los valores del colesterol de los grupos tratados, los cuales fueron inferiores con respecto al grupo control; sin embargo, están dentro de los valores normales referenciados para la especie.

La adición de probióticos en la alimentación animal puede reducir el colesterol. Algunos autores, como Jurado et al. (18) y Dlamini et al. (19), propusieron que ciertos lactobacilos probióticos, con actividad de sal biliar hidrolasa, pueden disminuir los niveles de colesterol en sangre al desconjugar enzimáticamente los ácidos biliares, pues aumenta su tasa de excreción y con ello disminuyen la solubilidad y la absorción de los lípidos en el intestino.

Diferentes autores refieren que las pruebas realizadas de toxicidad dependen de la utilización final del probiótico (20). La estandarización de los criterios de evaluación de la funcionalidad y la seguridad de los probióticos, así como el establecimiento de correlaciones entre los ensayos de evaluación in vivo e in vitro, constituyen hasta el momento un gran reto para la comunidad científica, los productores y los órganos reguladores. Las medidas adoptadas armonizaron los criterios de comercialización de los alimentos funcionales y, entre ellos, los que contienen probióticos (21). El uso de modelos de experimentación animal resulta muy útil para evaluar in vivo la seguridad y los efectos de la administración de altas dosis (22).

En el presente trabajo se evaluó la dosis propuesta de 10¹² UFC/ animal de la cepa de L. plantarum 22 LMC, aislada del intestino de cerdos, sobre la base de los estudios de translocación bacteriana, comportamiento de los indicadores anatomopatológicos (macroscópicos y microscópico de los órganos), hemáticos y bioquímicos, los que no evidenciaron efecto tóxico asociado a la aplicación del probiótico en los grupos evaluados. Estos resultados avalan la continuidad de las investigaciones relacionadas con el efecto del probiótico en indicadores productivos y de salud en la especie diana. Se concluye que la cepa de L. plantarum 22 LMC es segura en el modelo animal evaluado.