Se emplearon las cepas: S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC14028 y S. enterica subsp. enterica resistente a ampicilina, cefazolina y cefoxitina (datos no publicados). Ambas forman parte del cepario del CENLAC (Laboratorio de Ensayos para el Control de la Calidad e Inocuidad de los Alimentos) del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA).

El aceite esencial de T. vulgaris se obtuvo por el método de hidrodestilación durante tres horas, empleando un equipo Clevenger (1313. Pino O, Sánchez Y, Rojas MM, Abreu Y, Correa TM. Composición química y actividad antibacteriana del aceite esencial de Pimpinella anisum L. Rev Protección Veg. 2012;27(3):181-187.). Este aceite se utilizó a la concentración mínima inhibitoria (CMI) 1 mg/mL que coincide con la concentración mínima bactericida (CMB) para las cepas de Salmonella spp. estudiadas a partir de previa determinación (1111. Rubio-Ortega A, Travieso-Novelles M, Riverón- Alemán Y, Peña-Rodríguez J, Espinosa-Castaño I, Pino-Pérez O. Actividad antibacteriana de aceites esenciales de plantas cultivadas en Cuba sobre cepas de Salmonella enterica. Rev Salud Anim. 2018;40(3):1-10.).

Los cambios en la viabilidad de las cepas de S. enterica, en dependencia del tiempo de exposición al aceite esencial de T. vulgaris, se determinaron usando una modificación del método de Miles y Misra (1414. Miles AA, Misra SS, Irwin JO. The estimation of the bactericidal power of the blood. Epidemiol Infect. 1938;38(6):732-749.). Una suspensión de células de concentración 15 x 10⁶ UFC/mL de cada cepa fue preparada en solución salina al 0,85 % (SS) según escala de McFarland a partir de un cultivo en el medio caldo nutriente (CN, Biocen, Cuba) de 24 h de incubación a 36°C. Se mezcló 1:1 con CN que contenía el aceite esencial de T. vulgaris a 2xCMI, en tubos eppendorff de 1,5 mL para una concentración final de 5 × 10⁵ UFC/mL. La concentración final del aceite en los tratamientos fue de 1 mg/mL. Por la poca solubilidad del aceite en el medio, se empleó como disolvente Tween 80 (Sigma Aldrich, Alamania) (0,1 %). Como control se usó la suspensión de células bacteriana de ambas cepas en CN con el disolvente empleado. Las muestras se incubaron a 36°C con agitación a 17,8 rad/s (incubadora con zaranda IKA® KS 4000 i control). Se tomaron muestras a tiempo 0, 1, 2, 4 y 8 horas de incubación. Las muestras se centrifugaron a 5236 rad/s durante 10 minutos; se eliminó el sobrenadante, se realizó lavado con 100 µL de SS y posterior centrifugación. Las células se resuspendieron en 100 µL de solución salina, se realizaron las diluciones seriadas en base 10 de cada muestra y 20 µL se sembraron en dos placas de agar nutriente (AN, BioCen, Cuba) y se incubaron a 36°C por 24 h. Se realizaron tres determinaciones independientes. Los valores de UFC se estimaron multiplicando el número de UFC obtenido por placa por el factor de la dilución seriada correspondiente. Los datos se expresaron como la media del logaritmo en base 10 de las UFC (log₁₀ UFC /mL) (media ± DS).

El ensayo de bacteriólisis se realizó acorde con el método estándar descrito por Carson et al. (1515. Carson CF, Mee BJ, Riley TV. Mechanism of action of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil on Staphylococcus aureus determined by time-kill, lysis, leakage, and salt tolerance assays and electron microscopy. Antimicrob Agents Chemother. 2002;46(6):1914-1920.), con algunas modificaciones. De cada cepa a evaluar se preparó una suspensión bacteriana en solución salina de 1,2 x 10⁹ UFC/mL equivalente a una densidad óptica (DO), según la escala de McFarland, a partir de un cultivo de 24 h de incubación en AN a 36°C. Luego, este inóculo se centrifugó a 3750 g por 10 minutos y se lavó dos veces con SS y, finalmente, se resuspendió en SS con Tween 80 (0,1 %, v/v). La suspensión bacteriana se ajustó a 9 x 10⁸ UFC/mL (McFarland) y se mezcló 1:1 con SS que contenía el aceite esencial de T. vulgaris a 2xCMI, en tubos eppendorff de 1,5 mL, para una densidad de células final de 5 × 10⁸ UFC/mL. Se empleó como disolvente Tween 80 (0,1 %, v/v). Se utilizaron como controles las suspensiones de las células bacterianas de cada cepa en SS con el disolvente. Los tratamientos se incubaron a 36°C con agitación a 17,8 rad/s durante cuatro horas. Se tomaron muestras de 1 mL a tiempo 0, 1, 2 y 4 horas de incubación. Las muestras se centrifugaron a 5236 rad/s por 10 minutos, se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en SS. Luego se determinó la densidad óptica (DO) a 620 nm. Cada muestra se preparó por triplicado y se realizaron tres experimentos independientes. Los resultados se mostraron como la relación de la DO₆₂₀ de cada tiempo entre la DO₆₂₀ en tiempo 0, expresados en porciento.

La pérdida de contenido celular se determinó por medición de DO a 260 nm. La preparación del inóculo y de las muestras se realizó igual que en el ensayo anterior para cada cepa. Las muestras se incubaron a 36°C con agitación a 17,8 rad/s. Se tomaron muestras a tiempo 0, 1, 2 y 4 horas de incubación. Las muestras se centrifugaron a 5236 rad/s por 10 minutos, se tomó el sobrenadante y se midió DO a 260 nm. Cada muestra se preparó por triplicado y se realizaron tres experimentos independientes. Los resultados se expresaron como sustracción de la DO₂₆₀ de cada tiempo menos la DO₂₆₀ en tiempo 0.

La pérdida de proteína totales liberadas por acción del aceite esencial de T. vulgaris se determinaron por el método de Lowry (1616. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951;193(1):265-275.). La preparación del inóculo y de las muestras se realizó igual que en el ensayo anterior. Se incubaron durante 1 h a 36°C con agitación a 17,8 rad/s. Las muestras se centrifugaron a 5236 rad/s por 10 minutos, se tomó el sobrenadante y se agitó por 20 s en agitador de tubos Vortex mixer. Una alícuota de 100 µl de cada muestra se diluyó en 100 µL de agua destilada (1:1) y se añadió 1 mL de solución de Lowry (Sigma, Alemania). Se incubó por 15 minutos a temperatura ambiente y se añadieron 100 µL del reactivo de Folin (Sigma), con posterior incubación por 30 minutos. Se midió la DO a 730 nm. Se utilizó el SDS al 1 % y se empleó Albúmina de suero bovino como patrón. Cada muestra se preparó por triplicado y se realizaron tres experimentos independientes. Los resultados se expresaron como la media de concentración ± error estándar.

Los datos experimentales obtenidos se procesaron estadísticamente mediante un análisis de varianza simple, y las medias se compararon mediante la prueba de comparación de rangos múltiples de Duncan a una probabilidad de error al 5 % (p<0,05), usando el paquete estadístico InfoStat/L versión de 2018 (1717. Di Rienzo JA, Casanoves F, Balzarini MG, Gonzalez L, Tablada M, Robledo CW. InfoStat. Grupo InfoStat. FCA, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. 2018.). Para los resultados del ensayo de pérdida de contenido celular, las medias se analizaron por intervalos de confianza.

La cinética de muerte celular de las cepas S. enterica (ATCC) y S. enterica por acción del aceite esencial de T. vulgaris a la CMI se muestra en la Figura 1. Para ambas cepas, el tratamiento control se mantuvo con una cinética de pendiente positiva indicando el crecimiento celular y alcanzó valores en un rango 9-10 log₁₀ UFC/mL. Mientras que, en presencia del aceite esencial de T. vulgaris a la CMI, se muestra una pendiente negativa, que demuestra la acción bacteriolítica de la esencia. La muerte celular para más del 98 % de la carga inicial de células se observó en la primera hora de tratamiento para ambas cepas. Este efecto se acentúa a las 2 horas, sin recuperación en 24 horas (datos no mostrados). Estos resultados demuestran la potencialidad de la esencia del tomillo de origen cubana sobre este patógeno, incluso frente a una cepa que evidenció resistencia a diferentes familias de antibióticos.

Para deducir de forma preliminar el posible daño en la membrana de ambas cepas de S. enterica, debido a la acción del aceite esencial de T. vulgaris, se compararon los porcientos de DO del tratamiento sobre cada cepa durante el periodo del tiempo evaluado con respecto al obtenido en el tiempo inicial (Fig. 2). En ambas cepas, en ausencia del aceite esencial, el tratamiento control se mantuvo sin mostrar diferencias; aunque, como se observa en el gráfico, existe una leve disminución de sus proporciones en el tiempo, que se ajusta a la etapa de latencia de la bacteria. En presencia del aceite esencial se observó la disminución de la DO en el tiempo para ambas cepas, lo que evidencia el efecto inhibidor del aceite sobre la multiplicación celular.

En las suspensiones bacterianas de S. enterica de ambas cepas, con una hora de tratamiento con el aceite esencial de T. vulgaris, a la CMI, se detectó una disminución de la densidad óptica, con cambios significativos estadísticamente solo para las células de la cepa ATCC. Sin embargo, durante las dos primeras horas de tratamiento a la CMI, no se induce cambios significativos de lisis celular para ambas cepas. Los comportamientos observados con valores por encima del 80 % sugirieren que no existe daño aparente en la membrana celular durante este tiempo, aunque transcurridas 2 h de evaluación ya se había cumplido el tiempo de muerte celular demostrado anteriormente.

En la cepa de S. enterica (resistente), solo se muestran diferencias significativas en cuanto a los valores de % de DO, debido a la acción del aceite esencial con respecto al control, a las cuatro horas de tratamiento, lo que coincide con un efecto de lisis celular en la población bacteriana de esta cepa; mientras que la esencia de T. vulgaris provoca la lisis de las células de la cepa ATCC a las cuatro horas de tratamiento, con valores inferiores al 50 %.

Estos resultados sugieren que la esencia de T. vulgaris a la CMI afecta la permeabilidad celular de cepas de Salmonella enterica en una hora de tratamiento. Efecto similar a este se obtuvieron por Guinoiseau et al. (1818. Guinoiseau E, Luciani A, De Rocca Serra D, Quilichini Y, Berti L, Lorenzi V, et al. Primary mode of action of Cistus ladaniferus L. essential oil active fractions on Staphylococcus aureus strain. Adv Microbiol. 2015;5(5):881-890.) con la fracción oxigenada del aceite esencial de Cistus ladaniferus sobre Staphylococcus aureus, transcurrido 30 minutos de tratamiento. La acción de los aceites esenciales se les atribuye, en gran medida, a los compuestos oxigenados como los fenólicos (1919. Swamy MK, Sayeed Akhtar M, Sinniah UR, Akhtar MS, Sinniah UR. Antimicrobial properties of plant essential oils against human pathogens and their mode of action: an updated review. Evidence-Based Complement Altern Med. 2016;1-21.). Las esencias de T. vulgaris se caracterizan por la presencia de compuestos fenólicos como componentes mayoritarios, como el timol (88. Preedy VR. Essential oils in food preservation, flavor and safety. Academic Press; 2015.).

La pérdida de componentes celulares ante la acción de agentes bacterianos es un indicador de posible daño en la membrana celular. El aceite esencial de T. vulgaris a la CMI provocó la pérdida de contenido celular, específicamente de material que absorbe a 260 nm de S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 transcurrida 1 h de tratamiento (Fig. 3). Esto se corresponde con el resultado obtenido en el ensayo de integridad celular, donde el aceite de T. vulgaris provoca disminución de la población bacteriana en la cepa ATCC desde la hora de tratamiento. El control se mantuvo sin salida de material celular, lo que sugiere un buen estado de la integridad de la membrana.

La absorción a 260 nm se emplea para determinar la presencia de ácidos nucleicos. Las estructuras purificadas de la membrana plasmática, la membrana externa, el peptidoglicano y la cápsula polisacarídica de las bacterias no contienen bases de ácidos nucleicos y no tienen absorción a 260 nm. La presencia de ácidos nucleicos en el contenido extracelular sugiere que ha ocurrido daño en la barrera selectiva al intercambio con el medio y puede reflejarse con mayor proporción ante la muerte celular (2020. Barton LL. Structural and functional relationships in prokaryotes. United States of America. 2005. pp.40-42.).

La porción de componentes liberados depende del microorganismo (según su fisiología y composición de sus membranas), del tipo agente antibacteriano (aceites esenciales como mezclas de compuestos) y factores que afectan la eficacia de la actividad bactericida (concentración y temperatura) (2121. Maillard JY. Bacterial target sites for biocide action. J Appl Microbiol Symp Suppl. 2002;92:16S-27S.). Bajpai et al. (2222. Bajpai VK, Sharma A, Moon B, Baek KH. Chemical composition analysis and antibacterial mode of action of Taxus cuspidata leaf essential oil against foodborne pathogens. J Food Saf. 2014;34:9-20.) demostraron la salida de componentes celulares de Escherichia coli a partir de la acción del aceite esencial de Taxus cuspidata. Estos resultados fueron similares a los alcanzados con el aceite esencial de T. vulgaris de origen cubano sobre ambas cepas de Salmonella spp.

En correspondencia con la salida de material citoplasmático absorbente a 260, la esencia de T. vulgaris a la CMI promueve la salida de proteínas totales del material citoplasmático de las cepas de S. enterica estudiadas, transcurrida 1 h de tratamiento (Fig. 4). La mayor salida de proteínas se detectó en la cepa S. enterica, lo que sugiere mayor sensibilidad de esta ante la acción de la esencia.

La salida de componentes celulares ratifica el daño a la integridad celular, ya sea por ruptura o por modificaciones estructurales de la membrana, que conllevan a un aumento de la permeabilidad y, con ella, a la salida de los componentes internos. Según los resultados obtenidos en la evaluación de la integridad celular y la salida de componentes por acción del aceite esencial de T. vulgaris, es posible la inducción de cambios estructurales en la pared y la membrana celular que conllevan a la muerte sin ocasionar aparente ruptura de la membrana transcurrida una hora de tratados. Estos resultados sugieren la membrana bacteriana de S. enterica como uno de los sitios de acción en ambas cepas. Se necesitan investigaciones con métodos más sensibles para determinar las moléculas dianas ante la acción del aceite sobre la membrana externa de S. Typhimurium e identificar el daño en la estructura del lipopolisacárido o en las proteínas de membrana.

La membrana citoplasmática es el primer sitio diana para iniciar los estudios de modo de acción de una sustancia con potencial antibiótico. Esta estructura interviene en varios procesos de conversión de energía, procesamiento de nutrientes, síntesis de macromoléculas estructurales, secreción de señales reguladoras, homeóstasis intracelular de componentes citosólicos y, por ende, del pH intracelular (1919. Swamy MK, Sayeed Akhtar M, Sinniah UR, Akhtar MS, Sinniah UR. Antimicrobial properties of plant essential oils against human pathogens and their mode of action: an updated review. Evidence-Based Complement Altern Med. 2016;1-21.).

Las bacterias Gram negativas poseen dos membranas, la membrana celular citoplasmática y la membrana externa. La pared celular en Gram negativas contiene la membrana externa y una fina capa de peptidoglicano (10-20 %). La superficie interna de la pared está separada de la membrana celular por un espacio periplásmico amplio, que permite la estancia de toxinas y enzimas en concentraciones suficientes para la defensa bacteriana (2323. Black J. Microbiology: principles and explorations. 8th ed. United States of America: John Wiley & Sons, Inc. 2012. pp. 60-67.).

La monocapa externa de la membrana contiene lipopolisacáridos (LPS) hidrofílicos como el principal componente lipídico. Estos constituyen una barrera contra macromoléculas y compuestos hidrofóbicos, lo que otorga mayor tolerancia a compuestos antimicrobianos hidrofóbicos como los componentes de aceites esenciales (1212. Hyldgaard M, Mygind T, Meyer RL. Essential oils in food preservation: mode of action, synergies, and interactions with food matrix components. Front Microbiol. 2012;312. doi: 10.3389/fmicb.2012.00012. e.). La monocapa de LPS, está compuesta por lípidos aniónicos expuestos en la superficie de las membranas bacterianas y son una especie lipídica exclusiva de las bacterias Gram negativas (2424. Epand RM, Walker C, Epand RF, Magarvey NA. Molecular mechanisms of membrane targeting antibiotics. Biochim Biophys Acta - Biomembr. 1 de mayo de 2016;1858(5):980-987.). Esta propiedad es utilizada por agentes antimicrobianos catiónicos (DPK-060, LTX-109, brilacidina, XF-73 exhibits), por lo que tienen una mayor selectividad para las membranas bacterianas (2525. Kintz E, Heiss C, Black I, Donohue N, Brown N, Davies MR, et al. Salmonella enterica serovar Typhi lipopolysaccharide O-antigen modification impact on serum resistance and antibody recognition. Infect Immun. 2017;85:e01021-16. https://doi.org/10.1128/IAI.01021-16.).

Los resultados sugieren la posible acción del aceite esencial sobre la membrana bacteriana, con cambios en la permeabilidad y salida de componentes celulares, aunque el modo de acción de la esencia T. vulgaris sobre S. enterica puede abarcar más de un mecanismo de acción de los descritos para antibióticos sintéticos dirigidos a esta estructura. Entre los mecanismos de acción de los antibióticos sintéticos sobre la membrana se incluyen los que provocan pérdida de la permeabilidad de la membrana externa como las polimixinas y los que generan cambios en las propiedades o modificaciones de la curvatura o por agrupamiento de fosfolípidos específicos (daptomicina, telomicina, duramicina, cinnamicina, lisocina E). Sin embargo, la efectividad de los agentes sintéticos es limitada, pues estos también se ven afectados por el aumento de los mecanismos de resistencia como incremento en la expresión de β-lactamasas bacterianas que inactivan los β-lactámicos o disminución de la absorción de medicamentos y la inactivación de antibióticos (2323. Black J. Microbiology: principles and explorations. 8th ed. United States of America: John Wiley & Sons, Inc. 2012. pp. 60-67.).

Por su naturaleza hidrofóbica, los aceites esenciales difunden a través de las membranas celulares (2626. Reyes-Jurado F, Navarro-Cruz AR, Ochoa-Velasco CE, Palou E, López-Malo A, Ávila-Sosa R. Essential oils in vapor phase as alternative antimicrobials: A review. Crit Rev Food Sci Nutr. 2019;1-10.) y el modo de acción; de forma general no se corresponde con un sitio o mecanismo de acción específico, sino con el daño múltiple en las células que finaliza en la muerte celular (2727. Bakkali F, Averbeck S, Averbeck D, Idaomar M. Biological effects of essential oils - A review. Food Chem Toxicol. 2008;46(2):446-475.,2828. Calo JR, Crandall PG, O'Bryan CA, Ricke SC. Essential oils as antimicrobials in food systems - A review. Food Control. 2015;54:111-119.). El efecto antibacteriano puede deberse a: I) la compleja composición química que presentan, donde cada componente puede actuar por diferentes sitios y mecanismos; II) un mismo componente puede actuar por disímiles vías; y III) la acción aditiva o sinérgica de varios constituyentes sobre uno o múltiples sitios diana, lo que implica que compuestos que se encuentren en concentraciones menores potencien la actividad de otros (2929. Langeveld WT, Veldhuizen EJAA, Burt SA. Synergy between essential oil components and antibiotics: A review. Crit Rev Microbiol. 28 de febrero de 2014;40(1):76-94.,3030. Saad NY, Muller CD, Lobstein A. Major bioactivities and mechanism of action of essential oils and their components. Flavour and Fragrance Journal. 2013.). Esto representa una ventaja para la utilización de T. vulgaris como productos para combatir la salmonelosis, pues la probabilidad de desarrollo de resistencia es menor que con el uso de antibióticos sintéticos, elemento importante para la obtención de antimicrobianos competitivos en el mercado.