Se emplearon las siguientes cepas BAL (Fructobacillus fructosus SS66, Lactococcus garvieae SS79, Fructobacillus fructosus SS72, Lactobacillus kunkeei SS70, Lactobacillus rhamnosus SS73), aisladas previamente del tracto digestivo de abejas adultas (Apis mellifera) (2323. Hernández García JE, Rodríguez Díaz JA, Sebastián Frizzo L, Fernández León KJ, Solenzal Y, Paola Soto L, et al. Aislamiento e identificación de bacterias ácido lácticas del tracto digestivo de abejas adultas Apis mellifera. Rev Salud Anim. 2020;42(2):9.) y mantenidas en el cepario del Laboratorio de Referencia para Investigaciones y Salud Apícola (LARISA) y el Departamento de Medicina Veterinaria de la Universidad de Sancti Spíritus “José Martí Pérez”, provincia Sancti Spíritus, Cuba. Las cepas fueron sometidas a diferentes ensayos in vitro (2020. FAO/WHO. WHO works group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food London. Ontario, Canada, April. 2002;30.) para evaluar y seleccionar aquellas que pudieran ser las mejores candidatas para ser utilizadas como probióticas en la alimentación de las abejas. Los ensayos se describen a continuación.

Se utilizaron tubos de ensayo de 15 mL de capacidad, con 9 mL del medio De Man, Rogosa and Sharpe (MRS), a pH 6,5 a los que se le inoculó un cultivo fresco de 16 h (10 % del volumen final) y se incubaron a diferentes temperaturas (37 y 45°C) durante 24 h, se observó el crecimiento mediante cambios de turbidez en el medio de cultivo. Se utilizaron los siguientes criterios: Ausencia de crecimiento (-); Crecimiento muy débil (+); Crecimiento débil (++); Crecimiento abundante (+++).

Se prepararon tubos Falcon ^TM de 20 mL de capacidad con 10 mL de medio caldo MRS; se ajustó el pH con ácido fosfórico a 6,5; 5,5; 4,5 y 3,5. La esterilización de los medios de cultivo se realizó en autoclave (VK-75-01, Rusia) a 121°C durante 15 min. El ensayo de la cinética de crecimiento se realizó en microplacas de 96 pocillos (Costar 3599, Corning, EUA). Para esto, se depositaron en cada pocillo 240 µL de los medios y 30 µL de inóculo de un cultivo de 18 h de cada cepa en estudio. El crecimiento microbiano se realizó a 37°C durante 24 h, bajo condiciones aeróbicas en incubadora (Binder, Alemania). Las lecturas de la absorbancia se realizaron cada 30 min a 630 nm mediante el Lector multimodal de microplacas Sinergy HT BioTEK (BioTEK Instrumentos-EUA). Los medios no inoculados se utilizaron como controles. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.

Para examinar la actividad proteolítica se siguió la metodología descrita por Harrigan (2424. Harrigan WF. Laboratory methods in food microbiology: Gulf professional publishing; 1998.), con algunas modificaciones. Se prepararon dos medios de cultivo: 1) agar leche descremada que consistió en leche en polvo descremada (Loba Chemie PVT.LTD, India) al 5 % y agar (Britania, Argentina) al 1,3 %; medio 2) agar-leche descremada al 2 % en agua de peptona y agar a una concentración de 1,3 %; ambos medios se ajustaron a pH 6,5; se esterilizaron por separado la leche y el medio peptonado, se dejaron enfriar a 60°C y luego se mezclaron y repartieron en placas Petri. Se prepararon placas con perforaciones de 6 mm de diámetro, que se rellenaron con 20 µL de los cultivos de las cepas BAL en estudio, y placas sin perforaciones que se sembraron por estrías. Se utilizó Staphylococcus aureus ATCC 25923 como control. Las placas se incubaron a 37°C durante 48 a 72 h. La presencia de un halo transparente alrededor de las colonias y en las perforaciones se consideró como reacción positiva de proteólisis de la caseína. El ensayo se realizó por triplicado y en dos momentos diferentes.

La capacidad de las cepas para producir H₂O₂ se determinó según la metodología descrita por McLean y Rosentein (2525. Mclean NW, Rosenstein IJ. Characterisation and selection of a Lactobacillus species to re-colonise the vagina of women with recurrent bacterial vaginosis. Journal of medical microbiology. 2000; 49(6):543-552.). Los cultivos bacterianos se sembraron en duplicado por estría sobre agar MRS suplementado con 2,5 mg/mL de Tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) y 0,01 mg/mL de Peroxidasa de rábano (HRP) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Las placas fueron incubadas a 37°C durante 48 h en condiciones de anaerobiosis. En presencia de H₂O₂, la enzima HRP oxida al TMB (incoloro) para dar lugar a la formación de un pigmento azul. La tonalidad de la coloración azul se consideró una medida semicuantitativa de la cantidad de H₂O₂ producido y liberado al medio por la cepa (1616. Alberoni D, Baffoni L, Gaggìa F, Ryan P, Murphy K, Ross P, et al. Impact of beneficial bacteria supplementation on the gut microbiota, colony development and productivity of Apis mellifera L. Beneficial microbes. 2018;9(2):269-278.). La intensidad de la coloración azul fue incluida dentro de una de las siguientes categorías: azul claro o azul oscuro y, por la rapidez en la aparición, en Rápido (+++), Intermedio (++), Lento (+) y Negativo (-).

La capacidad de coagulación de las cepas BAL se determinó según la metodología descrita por Hernández-García et al. (2626. Hernández-García JE, Sebastián-Frizzo L, Rodríguez-Fernández JC, Valdez-Paneca G, Virginia-Zbrun M, Calero-Herrera I. Evaluación in vitro del potencial probiótico de Lactobacillus acidophilus SS80 y Streptococcus thermophilus SS77. Rev Salud Anim. 2019;41(1).); se utilizó leche descremada en polvo (LDP) con una concentración final de sólidos de 12,5 % p/v. Posteriormente se dispensó en tubos de ensayos de 15 mL de capacidad, a razón de 9 mL, los cuales fueron esterilizados en vapor fluyente durante 20 min. Después de enfriar a 45°C, se le añadió 1 mL (10 % vol final) del inóculo inicial (crecido de 16-18 h en MRS, pH 6,5). Los tubos se incubaron a 37°C durante 12 h. La coagulación de la leche se consideró positiva cuando apareció la presencia de un coágulo adherido al fondo del tubo que no se desplazaba al invertir el mismo. Se utilizó Lactobacillus acidophilus como cepa indicadora (control positivo).

La actividad hemolítica de las cepas BAL se realizó sobre el medio Agar Columbia con 5 % de sangre de caballo (Biomérieux, Marcy l’Etoile, Francia), pH 6,5, según el método estándar con ligeras modificaciones descrito por Balamurugan et al. (2727. Balamurugan R, Chandragunasekaran AS, Chellappan G, Rajaram K, Ramamoorthi G, Ramakrishna BS. Probiotic potential of lactic acid bacteria present in homemade curd in southern India. The Indian journal of medical research. 2014;140(3):345.). La incubación se realizó a 37°C por 48 h en aerobiosis. Las cepas fueron evaluadas según la zona de hemólisis alrededor de la colonia, como positivas o negativas y de acuerdo al tipo de hemólisis: β-hemólisis, cuando apareció una zona clara de hemólisis alrededor de la colonia, α-hemólisis, una zona verde alrededor de la colonia y gamma (γ) si la zona alrededor de la colonia no era clara. Se utilizó como control positivo Staphylococcus aureus ATCC 25923.

La actividad amino-descarboxilasa de las cepas BAL se realizó mediante un método cualitativo descrito por Mete et al. (2828. Mete A, Cosansu S, Demirkol O, Ayhan K. Amino acid decarboxylase activities and biogenic amine formation abilities of lactic acid bacteria isolated from shalgam. International Journal of Food Properties. 2017;20(1):171-178.), que consistió en un medio líquido base con la siguiente composición: Peptona de caseína 0,5 %, Extracto de levadura 0,3 %, D (+) Glucosa 0,1 %, Púrpura de bromocresol 0,0016 % (Mallinckrodt Baker, Inc, EUA). A 0,9 % del medio de cultivo base se le agregó 0,5 % del aminoácido a testar: L Arginina, L Histidina, L Lisina, L Tirosina y L Triptófano (Biopack, Argentina). Luego se ajustó el pH del medio a 6,7±0,1 a 25°C. Los tubos duplicados se inocularon con 10 µL de cultivo y se incubaron 72 h a 37°C. El color del medio al momento de la siembra era de color púrpura. El medio inicialmente pasa a amarillo al acidificarse y retorna a púrpura si la cepa descarboxila los aminoácidos; el pH del medio de cultivo aumenta. Prueba positiva: color del medio púrpura, la cepa es productora de aminas biógenas. Prueba negativa: color del medio amarillo, la cepa no produce aminas biógenas con el aminoácido probado.

La tolerancia a sales biliares se llevó a cabo de acuerdo con la metodología utilizada por Uriot et al. (2929. Uriot O, Denis S, Junjua M, Roussel Y, Dary-Mourot A, Blanquet-Diot S. Streptococcus thermophilus: From yogurt starter to a new promising probiotic candidate? Journal of Functional Foods. 2017;37:74-89.), en microplacas de 96 pocillos. Las cepas se multiplicaron en caldo MRS en presencia de 0,3 %, 0,5 % y 1 % de bilis bovina (Britania, Argentina); se adicionaron 240 µL en cada pocillo y 30 µL del cultivo de 18 h de las cepas en estudio. Los cultivos se incubaron a 37°C durante 24 h y las lecturas de absorbancia se realizaron cada 30 min a 630 nm mediante el Lector multimodal de microplacas Sinergy HT BioTEK (BioTEK Instrumentos-EUA). Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.

El ensayo de tolerancia al jugo gástrico se realizó con ajustes a la metodología descrita por Bao et al. (3030. Bao Y, Zhang Y, Zhang Y, Liu Y, Wang S, Dong X, et al. Screening of potential probiotic properties of Lactobacillus fermentum isolated from traditional dairy products. Food Control. 2010;21(5):695-701.). El JGA consistió en una solución de pepsina (Riedel-deHaën, Alemania) (0,35 % p/v) y NaCl (Emsure®, Dinamarca) (0,2 % p/v); una mitad (50 %) ajustada a pH 3 con ácido clorhídrico y la otra restante a pH 6,5. La esterilización se realizó por filtración (0,22 µM). Las suspensiones de JGA se inocularon a 1 % con cultivos de 18 h de cada una de las cepas BAL y mezclados durante 10 s. El JGA con pH 3 se incubó durante 3h a 37°C. Posteriormente se evaluó la cinética de crecimiento de cada cepa en microplacas de 96 pocillos. Para esto, se depositaron en cada pocillo 240 µL del medio MRS, pH 7 y transferido 30 µL de inóculo de JGA (JGA con pH 3 durante 3 h a 37°C) de cada cepa en estudio. El crecimiento microbiano se realizó a 37°C durante 24 h. Las lecturas de absorbancia se realizaron cada 30 min a 630 nm mediante el Lector multimodal de microplacas Sinergy HT BioTEK (BioTEK Instrumentos EUA). Todas las determinaciones se realizaron por triplicado. Se utilizaron como controles los medios no inoculados.

Se realizó el ensayo de agregación de acuerdo a la técnica utilizada por Reniero et al. y Maldonado et al. (3131. Reniero R, Coocconcelli P, Bottazzi V, MorellI L. High frequency of conjugation in Lactobacillus mediated by an aggregation-promoting factor. Journal of General Microbiology 1992;138:763-768., 3232. Maldonado NC, Ficoseco CA, Mansilla FI, Melián C, Hébert EM, Vignolo GM, et al. Identification, characterization and selection of autochthonous lactic acid bacteria as probiotic for feedlot cattle. Livestock science. 2018;212:99-110.). Los cultivos, incubados 18 h a 37°C en MRS, se centrifugaron y se lavaron tres veces con agua destilada y se resuspendieron en el volumen inicial con una solución de Ringer- lactato y se llevaron a una DO de 0,7. Los sobrenadantes de cada una de las cepas se filtraron y se agregaron a la suspensión a una concentración final del 10 % (v/v). Posteriormente, se incubaron a temperatura ambiente. La agregación se considera positiva cuando las partículas visibles, similares a la arena y formadas por las células agregadas, se depositan en el fondo del tubo y dejan el sobrenadante limpio en un período máximo de 2 h a temperatura ambiente.

El ensayo de coagregación se basó en métodos reportados por Maldonado et al. y Reid (3232. Maldonado NC, Ficoseco CA, Mansilla FI, Melián C, Hébert EM, Vignolo GM, et al. Identification, characterization and selection of autochthonous lactic acid bacteria as probiotic for feedlot cattle. Livestock science. 2018;212:99-110., 3333. Reid G, Bruce AW. Probiotics to prevent urinary tract infections: the rationale and evidence. World journal of urology. 2006;24(1):28-32.). Las suspensiones de microorganismos ajustaron a una densidad óptica de 0,7 en PBS. Una alícuota de 500 µL de los cultivos de las cepas seleccionadas de Lactobacillus ssp. se centrifugaron, filtraron y mezclaron con la 500 µL de Escherichia coli y Salmonella entérica serotipo Dublin; las suspensiones se incubaron por 2 h a temperatura ambiente. Las suspensiones se observaron macroscópicamente y bajo microscopio óptico (con un lente de 100 X). La prueba se consideró positiva cuando se hizo visible la sedimentación de las células sobre el fondo del tubo en un periodo máximo de 2 h a temperatura ambiente. Se desarrollaron controles con suspensiones en PBS de las BAL y los patógenos utilizados.

Para evaluar la hidrofobicidad en la superficie bacteriana, se realizó un ensayo según las indicaciones reportados por Frizzo et al. (3434. Frizzo LS, Soto LP, Bertozz I, Sequeira G, Marti LE, Rosmini MR. Evaluación in vitro de las capacidades probióticas microbianas orientadas al diseño de inóculos probióticos multiespecie para ser utilizados en la crianza de terneros. Revista FAVE-Ciencias Veterinarias. 2006;5.), para determinar, a través de porcentajes de hidrofobicidad, la tendencia a la adhesión epitelial (mayor porcentaje de hidrofobicidad, mayor adherencia). Cada una de estas cepas crecidas de cultivo fresco en caldo MRS a 37°C se lavaron con solución tampón fosfato salino (PBS), se ajustaron a una densidad óptica de 0,6-0,7 a 560 nm (DO_560nm) y se mezclaron con la misma cantidad de n-hexadecano a temperatura ambiente. Después de un tiempo de separación de 60 min, se midió la DO_560nm de la fase acuosa. El porcentaje de hidrofobicidad se calculó mediante la siguiente ecuación:

La actividad de hidrofobicidad de las cepas evaluadas se clasificó como alta (51-100 %), media (30-50 %) y baja (0-29 %), según lo propuesto por Nader-Macías et al. (3535. Nader-Macías MEF, Otero MC, Espeche MC, Maldonado NC. Advances in the design of probiotic products for the prevention of major diseases in dairy cattle. Journal of industrial microbiology and biotechnology. 2008;35(11):1387-1395.).

La capacidad de las BAL evaluadas para inhibir el crecimiento de determinados microorganismos patógenos se valoró mediante el método denominado "mota en césped" (3636. Kajal A, Ankur G, Jagriti S. Isolation and identification of Lactobacilli bacteria from raw cow milk in local region of Agra. Int J Adv Res Biol Sci. 2017;4(11):98-102., 3737. Fleming H, Etchells J, Costilow R. Microbial inhibition by an isolate of Pediococcus from cucumber brines. Applied Microbiology. 1975;30(6):1040-1042.). Se emplearon como indicadoras las siguientes cepas patógenas del cepario de Laboratorio de Alimentos del Departamento de Salud Pública, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Litoral, Argentina: Salmonella enterica serotipo Dublin 595, Listeria monocytogenes, Escherichia coli 289, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus; y también se enfrentaron a uno de los patógenos más importantes de las abejas, Paenibacillus larvae, del cepario del Laboratorio de Referencia para Investigaciones y Salud Apícola (LARISA), Sancti Spíritus, Cuba.

Las cepas BAL se multiplicaron en caldo MRS por 18 a 24 h a 37°C. Transcurrido este tiempo, se transfirieron 10 µL del cultivo de cada cepa a tres pocillos en una placa de agar MRS. Las placas fueron dispuestas bajo flujo laminar durante 30 min para permitir la absorción del cultivo y posteriormente se incubaron a 37°C durante 24 h en jarra de anaerobiosis. Simultáneamente, se prepararon los cultivos de cada uno de los microorganismos indicadores, inoculando 3-4 colonias en 50 mL de caldo BHI (por sus siglas en inglés, Brain Heart Infusion, Merck, EUA) e incubados 12 a 16 h.

Al completarse el tiempo de incubación, se observaron las motas de BAL en la superficie de las placas, se vertieron 7 mL de agar BHI semisólido al 0,7 %, atemperado a 40°C sobre las placas de MRS y suplementado a 1 % con el cultivo líquido de cada uno de los microorganismos indicadores. Las placas se incubaron a 37°C durante 24 h en condiciones de aerobiosis. En las placas se observaron la presencia o ausencia de zonas de inhibición de crecimiento bacteriano. La inhibición se evaluó por medición del diámetro (mm) de la zona clara alrededor de las colonias de las cepas patógenas, con una regla graduada (3838. Iorizzo M, Testa B, Lombardi SJ, Ganassi S, Ianiro MFL, et al. Antimicrobial activity against Paenibacillus larvae and functional properties of Lactiplantibacillus plantarum strains: Potential benefits for honeybee health. Antibiotics. 2020;9(442):2-18.).

A las cepas de Lactobacillus ssp. con mejores resultados en los ensayos in vitro se les realizó el ensayo de susceptibilidad antimicrobiana; para ello se utilizó el método modificado de difusión en disco impregnado y se sustituyó el agar Müeller Hilton por agar MRS, descrito por Schillinger y Lucke (3939. Schillinger U. Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat. Applied and environmental microbiology. 1989;55(8):1901-1906.). Los antimicrobianos probados fueron: ceftriaxona (30 μg), ciprofloxacina (5 μg), eritromicina (15 μg), gentamicina (10 μg), meropenem (10 μg), oxacilina (1 μg), penicilina G (10 μg), sulfonamidas (300 μg), vancomicina (30 μg), amikacina (30 μg), amoxicilina (10 μg), ampicilina (10 μg), cefalexina (30 μg), cefalotina (30 μg) y clorafenicol (30 μg) (Sensidisc DME®, Sao Paulo, Brasil). Como control se utilizó una cepa de Staphylococcus aureus (ATCC 25923). Una alícuota de 0,1- 0,2 mL de cada cepa, correspondiente a una concentración celular de 10⁸ -10⁹ UFC/mL, se distribuyó en placas Petri que contenían agar MRS para Lactobacillus ssp. y, en BHI para la cepa utilizada como control, Staphylococcus aureus. Para ello se empleó la técnica de esparcimiento superficial del inóculo y después se colocaron los discos de antibióticos en la superficie. Se incubaron por 48 h bajo condiciones de anaerobiosis y se midieron los halos de inhibición. Los aislados fueron clasificados para cada uno de los antibióticos como sensibles (S), moderadamente sensible (MS) y resistentes (R), de acuerdo con Charteris et al. (4040. Charteris WP, Kelly PM, Morelli L, Collins JK. Antibiotic susceptibility of potentially probiotic Lactobacillus species. Journal of Food Protection. 1998;6(12):1636-1643.).

Las cepas evaluadas fueron capaces de crecer a 37°C, con crecimiento abundante Fructobacillus fructosus SS72, Lactobacillus rhamnosus SS73 y Lactococcus garvieae SS79; mientras que, a 45°C, únicamente mostraron crecimiento abundante Fructobacillus fructosus SS72 y Lactobacillus rhamnosus SS73 (Tabla 1). Estos resultados son similares a los encontrados por Sánchez et al. (1818. Sánchez L, Omura M, Lucas A, Pérez T, Llanes M, Ferreira C. Cepas de Lactobacillus spp. con capacidades probióticas aisladas del tracto intestinal de terneros neonatos. Rev Salud Anim. 2015;32(2):11.) en su estudio, donde crecieron 17 cepas del género Lactobacillus ssp. a diferentes temperaturas (30, 37 y 45°C), pero los mayores rendimientos de células viables (9,3-10 log UFC/mL) fueron a 37°C. También Laurencio-Silva et al., en la evaluación de cepas BAL para su uso como probióticos (4141. Laurencio-Silva M, Arteaga F, Rondón-Castillo AJ, Ormaza J, Pinto J, Pazmiño D, et al. Potencial probiótico in vitro de cepas de Lactobacillus spp. procedentes de la vagina de vacas lecheras. Pastos y Forrajes. 2017;40(3):206-215.), encontraron que todas crecían a las temperaturas de incubación, muy similares a las empleadas en este estudio (38°C, 39°C y 40°C). Ello indica que la adaptabilidad de Lactobacillus ssp., a diferentes temperaturas, es una característica esencial para la supervivencia de tales microorganismos a las condiciones del ecosistema donde es posible su aplicación.

Solo se apreció hidrólisis de la caseína a las 48 h en Fructobacillus fructosus SS72 (Tabla 1). La mayoría de las cepas (80 %) no mostraron actividad proteolítica, lo que coincide con Peres et al. (4242. Peres CM, Alves M, Hernandez-Mendoza A, Moreira L, Silva S, Bronze MR, et al. Novel isolates of lactobacilli from fermented Portuguese olive as potential probiotics. LWT-Food Science and Technology. 2014;59(1):234-246.), quienes reportaron cepas que exhibían baja actividad de la enzima. La variación encontrada entre cepas puede estar dada por componentes de la pared celular o del medio en que se desarrollan las cepas (4343. Matthews A, Grimaldi A, Walker M, Bartowsky E, Grbin P, Jiranek V. Lactic acid bacteria as a potential source of enzymes for use in vinification. Appl Environ Microbiol. 2004;70(10):5715-5731.). La actividad proteolítica de las cepas es un indicador a tener en cuenta para evaluar la actividad probiótica de las cepas, específicamente referente a la liberación de péptidos bioactivos, los cuales se generan durante la fermentación del alimento o en el proceso de la digestión; estos incluyen algunas secuencias de aminoácidos que ejercen una actividad biológica específica en el huésped (4444. Aimutis WR. Bioactive properties of milk proteins with particular focus on anticariogenesis. The Journal of nutrition. 2004;134(4):989S-995S.).

Las cinco cepas evaluadas fueron capaces de crecer a pH 6,5; mientras que a pH 5,5 solo F. fructosus SS66, L. kunkeei SS70 y L. rhamnosus SS73 mostraron crecimiento abundante (Figura 1). A pH de 4,5 y 3,5 ninguna cepa fue capaz de crecer, lo cual resulta similar a los valores característicos del género Lactobacillus ssp. Las BAL tienen la capacidad de producir ácido láctico y disminuir el pH del sustrato, aspecto primordial dentro del grupo de los lactobacilos con capacidad probiótica (4141. Laurencio-Silva M, Arteaga F, Rondón-Castillo AJ, Ormaza J, Pinto J, Pazmiño D, et al. Potencial probiótico in vitro de cepas de Lactobacillus spp. procedentes de la vagina de vacas lecheras. Pastos y Forrajes. 2017;40(3):206-215.). L. kunkeei SS70 y L. rhamnosus SS73 tienen resultados comparables con el obtenido por Ávila et al. (4545. Ávila J, Ávila M, Tovar B, Brizuela M, Perazzo Y, Hernández H. Capacidad probiótica de cepas del género Lactobacillus extraídas del tracto intestinal de animales de granja. Revista Científica. 2010;20(2):161-169.). Landa-Salgado et al. (4646. Landa-Salgado P, Caballero-Cervantes Y, Ramírez-Bribiesca E, Hernández-Anguiano AM, Ramírez-Hernández LM, Espinosa-Victoria D, et al. Aislamiento e identificación de bacterias ácido lácticas con potencial probiótico para becerros del altiplano mexicano. Revista mexicana de ciencias pecuarias. 2019;10(1):68-83.), al evaluar cepas de Lactobacillus spp. bajo condiciones acidas similares (4; 4,5; 6,5), reportaron mejores crecimientos en el medio MRS cuando ajustaron el pH 6,5 (9,07 Log₁₀ UFC/mL), mientras que a pH 4,0 el crecimiento disminuyó a 5,09 Log₁₀ UFC/mL.

Las cepas resultaron positivas a la prueba de producción de peróxido de hidrógeno con crecimiento abundante y tonalidad azul oscura; resultado similar al reportado por Elenany y Sharaf (4747. Elenany Y, Sharaf El-Din H. Detection and Identification of novel bacterial strains isolated from fresh clover bee honey. Journal of Plant Protection and Pathology. 2019;10(1):49-52.). Dentro de los criterios a tener en cuenta en la evaluación de los probióticos, se incluye la producción de H₂O₂, por constituir factor inhibidor del crecimiento o colonización del intestino por agentes patógenos potenciales (4848. Iranmanesh M, Ezzatpanah H, Mojgani N. Antibacterial activity and cholesterol assimilation of lactic acid bacteria isolated from traditional Iranian dairy products. LWT-food Science and Technology. 2014;58(2):355-359.).

De las cinco cepas objeto de evaluación (Tabla 2), solo Fructobacillus fructosus SS66 (20 %) fue negativa a la prueba de coagulación en todos los tiempos, al compararlas con la cepa patrón L. acidophilus. La coagulación láctica o ácida se realiza por las bacterias lácticas presentes en la leche cruda o procedente de diferentes ambientes, que transforman la lactosa en ácido láctico y desciende el pH de la leche, lo que produce la alteración de la caseína hasta la formación de un coágulo; este constituye un importante indicador para nuestras condiciones al permitir mantener las cepas en un medio natural y obtener masa bacteriana (2626. Hernández-García JE, Sebastián-Frizzo L, Rodríguez-Fernández JC, Valdez-Paneca G, Virginia-Zbrun M, Calero-Herrera I. Evaluación in vitro del potencial probiótico de Lactobacillus acidophilus SS80 y Streptococcus thermophilus SS77. Rev Salud Anim. 2019;41(1).).

En el presente trabajo no hubo cepas evaluadas que revelaran actividad hemolítica, con excepción de Fructobacillus fructosus SS66 (Tabla 2). Dentro de los indicadores recomendados para evaluar los probióticos, la actividad hemolítica es uno de los criterios de selección dada su relación con la virulencia de las cepas (2020. FAO/WHO. WHO works group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food London. Ontario, Canada, April. 2002;30., 4949. De Vuyst L, Moreno MF, Revets H. Screening for enterocins and detection of hemolysin and vancomycin resistance in enterococci of different origins. Int J Food Microbiol. 2003;84(3):299-318.). Estos resultados se corresponden con los encontrados por Gutiérrez et al. (5050. Gutiérrez RLA, David RCA, Montoya COI, Betancur GE. Efecto de la inclusión en la dieta de probióticos microencapsulados sobre algunos parámetros zootécnicos en alevinos de tilapia roja (Oreochromis sp.). Rev Salud Anim. 2016;38(2):8.), ya que, de las 14 cepas seleccionadas, 10 resultaron ser no hemolíticas. Las bacterias pertenecientes al grupo de las ácido lácticas generalmente no son patógenas (GRAS) (1515. Yao W, Yang L, Shao Z, Xie L, Chen L. Identification of salt tolerance-related genes of Lactobacillus plantarum D31 and T9 strains by genomic analysis. Annals of Microbiology. 2020;70(1):1-14.) y, por consiguiente, no poseen hemolisinas que destruyan las células rojas, y al ser administradas como posibles probióticos en abejas, no deben presentar ningún problema. No obstante, se reportan cepas de L. casei con hemólisis positiva (5151. Ruiz-Moyano S, Martín A, Benito MJ, Casquete R, Serradilla MJ, de Guía Córdoba M. Safety and functional aspects of pre-selected lactobacilli for probiotic use in Iberian dry-fermented sausages. Meat science. 2009;83(3):460-467.).

Las cepas evaluadas no mostraron capacidad para la producción de aminas biógenas (AB): solo la cepa Lactococcus garvieae SS79 utilizó la alanina, de los cinco aminoácidos ensayados, pasadas las 36 h. Este es otro indicador de seguridad en la evaluación de cepas candidatas a probióticos (5252. Hazards EPoB. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ). Scientific opinion on risk based control of biogenic amine formation in fermented foods. Efsa Journal. 2011;9(10):2393-2486.), pues altas concentraciones de aminas en los alimentos, pueden ingresar en la cadena alimentaria y ser responsables de varios problemas toxicológicos en humanos (5353. Ladero Losada VM, Martín MC, Redruello B, Mayo Pérez B, Flórez García AB, Fernández García M, et al. Genetic and functional analysis of biogenic amine production capacity among starter and non-starter lactic acid bacteria isolated from artisanal cheeses. 2015.). No obstante, la formación de AB se asocia a cepas de Lactobacillus ssp., tales como L. plantarum, L. curvatus, L. alimentarius, L. reuteri y L. sakei (5454. Pereira C, Crespo MB, San Romao M. Evidence for proteolytic activity and biogenic amines production in Lactobacillus curvatus and L. homohiochii. Int J Food Microbiol. 2001;68(3):211-216.). Tarrah et al. (5555. Tarrah A, Castilhos J, Rochele Cassanta R R, Da Silva V D, Righetto D Z, Corich V, et al. In vitro probiotic potential and anti-cancer activity of newly isolated folate-producing Streptococcus thermophilus strains. Frontiers in Microbiology. 2018;9:1-11.) realizaron un estudio in vitro de cepas de S. thermophilus y estas manifestaron diferencias en la producción de AB, por lo que los autores concluyeron que es una característica dependiente de la cepa. En estudios de caracterización de cepas de BAL, otros autores reportan que S. thermophilus SS77 fue capaz de utilizar la alanina a partir de las 36 h, mientras que la cepa de L acidophilus SS80, solo lo hizo con la histidina a partir de las 72 h (2626. Hernández-García JE, Sebastián-Frizzo L, Rodríguez-Fernández JC, Valdez-Paneca G, Virginia-Zbrun M, Calero-Herrera I. Evaluación in vitro del potencial probiótico de Lactobacillus acidophilus SS80 y Streptococcus thermophilus SS77. Rev Salud Anim. 2019;41(1).).

En la cinética de crecimiento de las diferentes cepas se pudo observar que todas las cepas son capaces de crecer en presencia de bilis al 1 %, aunque se destacan L. kunkeei SS70 y L. rhamnosus SS73 con los mayores valores de crecimiento (Figura 2).

Gilliland et al. (5656. Gilliland S, Staley T, Bush L. Importance of bile tolerance of Lactobacillus acidophilus used as a dietary adjunct. Journal of dairy science. 1984;67(12):3045-3051.) encontraron que 0,3 % de sales biliares era un punto crítico de resistencia para cepas de Lactobacillus ssp., al tener una alta correlación con la supervivencia en los intestinos de los animales incluidos en el ensayo. En pruebas de selección de bacterias lácticas (5757. Jurado-Gámez H, Martínez BJA, Chaspuengal TA, Calpa FY. Evaluation in vitro of the action of Lactobacillus plantarum with probiotic characteristics on Yersinia pseudotuberculos. Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial. 2014;12(2):49-59.), se encontraron cepas de Lactobacillus ssp. resistentes a sales biliares (0,5 %, 1 %, 2 % y 3 %).

En otros estudios con otras cepas BAL, se reportan cepas de Streptococcus ssp. capaces de crecer en todas las concentraciones de bilis evaluadas (0,3 %, 0,5 % y 1 %) y cepas de Lactobacillus ssp. que solo lo hicieron a la concentración de 0,3 % (2626. Hernández-García JE, Sebastián-Frizzo L, Rodríguez-Fernández JC, Valdez-Paneca G, Virginia-Zbrun M, Calero-Herrera I. Evaluación in vitro del potencial probiótico de Lactobacillus acidophilus SS80 y Streptococcus thermophilus SS77. Rev Salud Anim. 2019;41(1).), lo que evidencia que los resultados de las bacterias lácteas son variables.

Las cepas estudiadas mostraron una alta capacidad de resistencia ante condiciones extremas del JGA; excepto la cepa Lactococcus garvieae SS79, el resto de las cepas mostraron una cinética de crecimiento similar al control (Figura 3) y cumplen con esta condición de exposición, simulándose el paso del alimento a través del tracto gastrointestinal (TGI), después de la permanencia de las bacterias en caldo MRS a pH 3 durante 3 h a 37°C. Para que sean efectivas, las cepas probióticas deben conservar las características de salud funcional para las cuales fueron seleccionadas originalmente. Tales características incluyen la capacidad de sobrevivir el tránsito a través del estómago y el intestino delgado y colonizar el TGI del huésped (5858. Kenfack CHM, Kaktcham PM, Ngoufack FZ, Wang YR, Yin L, Zhu T. Screening and characterization of putative probiotic Lactobacillus strains from honey bee gut (Apis mellifera). J Advances in Microbiology. 2018:1-18.). La sobrevivencia de BAL en el jugo gástrico puede ser independiente del pH. Si bien en el presente trabajo las mediciones con espectrofotómetro no diferencian entre bacterias vivas y muertas, es de suponer que aquellos aislados que muestren incremento en sus lecturas, luego del cese de las condiciones estresantes, pueden ser considerados como tolerantes ya que consiguieron multiplicarse. Los resultados en este estudio, mediante mediciones positivas de la curva de crecimiento realizada durante 24 horas, indican la capacidad de recuperación de las cinco cepas sometidas a los mismos desafíos, respecto a la capacidad de sobrevivir a estas condiciones hostiles.

Los resultados de autoagregación de este estudio no coinciden con los reportados por otros autores (5959. Meryandini A, Karyawati AT, Nuraida L, Lestari Y. Lactic Acid Bacteria from Apis dorsata hive possessed probiotic and Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitor Activity. Makara Jof Science. 2020;24(1):7.) que encontraron porcientos de autoagregación en las cepas estudiadas entre 88,4 % y 95,6 %. Este mismo autor encontró altos porcientos de coagregación frente a los patógenos Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella thyphymurium, que pueden ser comparados con las cepas BAL investigadas, L. rhamnosus SS73 y L. kunkeei SS70, que produjeron coagregación contra Escherichia coli (Tabla 3).

Las BAL pueden inhibir la adherencia de bacterias patógenas a la mucosa del intestino, ya sea mediante una barrera por autoagregación o por coagregación directa con los patógenos. En la mayoría de los casos, la capacidad de agregación está relacionada con las propiedades de adherencia celular, lo que también implica su capacidad para sobrevivir y persistir en el tracto gastrointestinal (6060. Tuo Y, Yu H, Ai L, Wu Z, Guo B, Chen W. Aggregation and adhesion properties of 22 Lactobacillus strains. J dairy science. 2013;96(7):4252-4257.).

La hidrofobicidad fue variable entre las cepas, de acuerdo a la clasificación establecida. F. fructosus SS72 exhibió un valor alto, L. rhamnosus SS73 y L. kunkeei SS70 medio y L. garvieae SS79 y F. fructosus SS66 bajo (Tabla 3). Estos resultados solo se comparan con los obtenidos por Goel et al. (6161. Goel A, Halami PM, Tamang JP. Genome Analysis of Lactobacillus plantarum isolated from some Indian fermented foods for Bacteriocin production and probiotic marker genes. Frontiers in microbiology. 2020;11.), quienes encontraron porcientos de hidrofobicidad para las cepas de L. plantarum evaluadas entre 55,57 % y 54,0 % para el xyleno y 42,9 y 40,88 % para el hexadecano. Se describen en dos aislados de L. plantarum altos valores de hidrofobicidad entre 85,26 % a 94,9 % para el xyleno y de 4,3 % a 48,37 % para el cloroformo (6262. TR K. Probiotic potency of Lactobacillus plantarum KX519413 and KX519414 isolated from honey bee gut. FEMS microbiology letters. 2018;365(4):285.).

También se plantea que existe una correlación entre la habilidad por la adhesión y la hidrofobicidad de algunos Lactobacillus. La naturaleza hidrófoba de la superficie más externa de los microorganismos se relaciona con la unión de las bacterias al tejido del huésped; esta propiedad podría conferir una ventaja competitiva, importante para el mantenimiento bacteriano en el sistema gastrointestinal (6060. Tuo Y, Yu H, Ai L, Wu Z, Guo B, Chen W. Aggregation and adhesion properties of 22 Lactobacillus strains. J dairy science. 2013;96(7):4252-4257.).

Por su parte, Dlamini et al. (6363. Dlamini ZC, Langa RL, Aiyegoro OA, Okoh AI. Safety evaluation and colonisation abilities of four lactic acid bacteria as future probiotics. Probiotics and antimicrobial proteins. 2019;11(2):397-402.) observaron altos valores de autoagregación (60 a 70 %) y coagregación (45 a 56 %), en cuatro cepas de BAL, después de 4 h de incubación a 37°C, así como una alta hidrofobicidad para todos los solventes utilizados: xyleno (78-84 %), cloroformo (68-75 %) y etil acetato (52-60 %).

Otra de las características que facilita la selección de cepas que puedan ser consideradas como potenciales probióticos, es su capacidad de inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos. A partir de la escala del halo de inhibición, el 100 % de las cepas evaluadas exhibieron actividad antagónica contra la totalidad de los patógenos estudiados, con variaciones entre ellas (Tabla 4). Se ha reportado la producción de sustancias inhibidoras para todo el género de Lactobacillus, incluyendo a Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc y Pediococcus, así como Enterococcus (4848. Iranmanesh M, Ezzatpanah H, Mojgani N. Antibacterial activity and cholesterol assimilation of lactic acid bacteria isolated from traditional Iranian dairy products. LWT-food Science and Technology. 2014;58(2):355-359.). No obstante, no siempre se dispone de un completo análisis de la naturaleza de las sustancias antagónicas que producen las cepas evaluadas.

Se describe por varios autores que, en esta actividad, pueden estar presentes ácidos orgánicos como son ácido láctico, peróxido de hidrógeno, dióxido de carbono, diacetilo, acetaldehído y sustancias de naturaleza proteica antimicrobiana, llamadas bacteriocinas (4848. Iranmanesh M, Ezzatpanah H, Mojgani N. Antibacterial activity and cholesterol assimilation of lactic acid bacteria isolated from traditional Iranian dairy products. LWT-food Science and Technology. 2014;58(2):355-359.,5757. Jurado-Gámez H, Martínez BJA, Chaspuengal TA, Calpa FY. Evaluation in vitro of the action of Lactobacillus plantarum with probiotic characteristics on Yersinia pseudotuberculos. Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial. 2014;12(2):49-59.,6464. Elshaghabee FM, Rokana N, Gulhane RD, Sharma C, Panwar H. Bacillus as potential probiotics: status, concerns, and future perspectives. Frontiers in microbiology. 2017;8:1490.); mecanismos que podrían sustentar el resultado mostrado por las cepas incluidas en el estudio.

En el ensayo de enfrentamiento a patógenos, las BAL aisladas del intestino de abejas, se observó que solo Lactobacillus AJ5, IG9, A15 y CRL1647 fueron capaces de inhibir S. aureus ATCC29213, B. cereus C1, E. coliO157: H7, L. monocytogenes y P. larvae (6565. Audisio MC, Torres MJ, Sabaté DC, Ibarguren C, Apella MC. Properties of different lactic acid bacteria isolated from Apis mellifera L. bee-gut. Microbiological research. 2011;166(1):1-13.). Lactobacillus kunkeei, aislado de intestino de abejas, fue capaz de inhibir el crecimiento de Listeria monocytogenes, Yersinia pseudotuberculosis, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli (6666. UĞRAŞ S. Isolation, identification and characterization of probiotic properties of bacterium from the honey stomachs of Yigilca honeybees in Turkey. Türkiye Entomoloji Dergisi. 2017;41(3):253-261.). Resultados similares de inhibición se observaron con cepas de BAL (MA3 y MA4) aisladas de Apis mellifera frente a L. monocytogenes y E. coli (6767. Putri I, Jannah SN, Purwantisari S. Isolation and characterization of lactic acid bacteria from Apis mellifera and their potential as antibacterial using in vitro test against growth of Listeria monocytogenes and Escherichia coli. NICHE J of Tropical Biology. 2020;3(1):26-34.). En estudio de aislamientos y caracterización de BAL de origen floral, se encontró que Fructobacillus fructosus, Lactobacillus kunkeei, Enterococcus durans y Lactobacillus brevis exhibieron efecto inhibidor frente a los patógenos Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa (6868. Saleh G. Isolation and characterization of unique fructophilic lactic acid bacteria from different flower sources. Iraqi Journal of Agricultural Science. 2020;51(2):508-518.).

Las cepas BAL se enfrentaron a uno de los patógenos de mayor importancia en la producción apícola: Paenibacillus larvae. Todas las cepas produjeron inhibición en alguna de las técnicas utilizada (Tabla 5), excepto Fructobacillus fructosus SS66, lo que demuestra la interacción de factores con efecto inhibidor sobre P. larvae. Otros autores demuestran que cepas BAL, aisladas del intestino de abejas, fueron capaces de inhibir diferentes patógenos, incluyendo P. larvae (6969. Al-Ghamdi A, Al-Abbadi AA, Khan KA, Ghramh HA, Ahmed AM, Ansari MJ. In vitro antagonistic potential of gut bacteria isolated from indigenous honey bee race of Saudi Arabia against Paenibacillus larvae. Journal of Apicultural Research. 2020:1-9., 7070. Yoshiyama M, Wu M, Sugimura Y, Takaya N, Kimoto-Nira H, Suzuki C. Inhibition of Paenibacillus larvae by lactic acid bacteria isolated from fermented materials. Journal of invertebrate pathology. 2013;112(1):62-67.).

En ensayo a nivel de laboratorio con larvas de abejas se ha comprobado que el suministro del consorcio bacteriano aislado de intestino de abejas: Lactobacillus plantarum Lp39, Lactobacillus rhamnosus GR-1 y Lactobacillus kunkeei BR-1, reduce la carga de patógenos, aumenta la expresión de genes de inmunidad claves y mejora la supervivencia durante la infección por P. larvae (2222. Daisley BA, Pitek AP, Chmiel JA, Al KF, Chernyshova AM, Faragalla KM, et al. Novel probiotic approach to counter Paenibacillus larvae infection in honey bees. The ISME journal. 2020 14(2):476-491.). De igual forma, siete cepas bacterianas aisladas de intestino de abejas melíferas se enfrentaron a la cepa P. larvae ATCC9545 por el método de difusión de disco, donde se incluyó Lactobacillus kunkeei (KY027158), y mostraron fuertes efectos inhibitorios frente al patógeno evaluado (6969. Al-Ghamdi A, Al-Abbadi AA, Khan KA, Ghramh HA, Ahmed AM, Ansari MJ. In vitro antagonistic potential of gut bacteria isolated from indigenous honey bee race of Saudi Arabia against Paenibacillus larvae. Journal of Apicultural Research. 2020:1-9.).

De las cinco cepas de Lactobacillus ssp. caracterizadas, L. kunkeei SS70 y L. rhamnosus SS73 manifestaron un mejor comportamiento en varios de los diferentes parámetros evaluados (crecimiento a temperatura 45°C, crecimiento a pH 5,5, coagregación a patógenos intestinales y antagonismo contra el P. larvae); así mismo, dentro de las principales cepas estudiadas in vitro con fines probióticos en las abejas, se encuentran L. kunkeei (7171. Janashia I, Choiset Y, Jozefiak D, Déniel F, Coton E, Moosavi-Movahedi AA, et al. Beneficial protective role of endogenous lactic acid bacteria against mycotic contamination of honeybee beebread. Probiotics and antimicrobial proteins. 2018;10(4):638-646., 7272. Kačániová M, Kunová S, Ivanišová E, Terentjeva M, Gasper J. Antimicrobial effect of Lactobacillus kunkeei against pathogenic bacteria isolated from bees' gut. Scientific Papers: Animal Science & Biotechnologies/Lucrari Stiintifice: Zootehnie si Biotehnologii. 2019;52(2)., 7373. Olofsson TC, Vásquez A. Detection and identification of a novel lactic acid bacterial flora within the honey stomach of the honeybee Apis mellifera. Current microbiology. 2008;57(4):356-363., 7474. Tajabadi N, Mardan M, Manap MYA, Shuhaimi M, Meimandipour A, Nateghi L. Detection and identification of Lactobacillus bacteria found in the honey stomach of the giant honeybee Apis dorsata. Apidologie. 2011;42(5):642.) y L. rhamnosus (2222. Daisley BA, Pitek AP, Chmiel JA, Al KF, Chernyshova AM, Faragalla KM, et al. Novel probiotic approach to counter Paenibacillus larvae infection in honey bees. The ISME journal. 2020 14(2):476-491., 5959. Meryandini A, Karyawati AT, Nuraida L, Lestari Y. Lactic Acid Bacteria from Apis dorsata hive possessed probiotic and Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitor Activity. Makara Jof Science. 2020;24(1):7.); además, con estas cepas se reportan resultados benéficos al ser administradas a las colmenas (1616. Alberoni D, Baffoni L, Gaggìa F, Ryan P, Murphy K, Ross P, et al. Impact of beneficial bacteria supplementation on the gut microbiota, colony development and productivity of Apis mellifera L. Beneficial microbes. 2018;9(2):269-278., 2222. Daisley BA, Pitek AP, Chmiel JA, Al KF, Chernyshova AM, Faragalla KM, et al. Novel probiotic approach to counter Paenibacillus larvae infection in honey bees. The ISME journal. 2020 14(2):476-491.), por lo cual se consideran las candidatas probióticas para inocular el jarabe de sacarosa a administrar a las abejas en periodos de hambruna.

La capacidad que manifiestan algunas cepas de resistencia a los antibióticos es un criterio determinante y restrictivo para ser seleccionado como posible probiótico. Con relación a las dos cepas (L. kunkeei SS70 y L. rhamnosus SS73) seleccionadas como posibles probióticos, mostraron sensibilidad frente a todos los antibióticos evaluados, excepto a la Sulfonamida y Vancomicina (Tabla 6); lo que sugiere que estas cepas no transmitirán mediadores de resistencia antimicrobiana hacia otros microrganismos presentes en el hospedero.

Los resultados concuerdan con otros autores (1414. Miranda-Yuquilema JE, Marin-Cárdenas A, Sánchez-Macías D, García-Hernández Y. Obtención, caracterización y evaluación de dos preparados candidatos a probióticos desarrollados con residuos agroindustriales. Revista MVZ Córdoba. 2018:6487-6499., 7575. Sánchez L, Omura M, Lucas A, Pérez T, Llanes M, Ferreira CdL. Cepas de Lactobacillus spp. con capacidades probióticas aisladas del tracto intestinal de terneros neonatos. Rev Salud Animal. 2015;37(2):94-104.), quienes indican que Lactobacillus ssp. y Bifidobacterium ssp. son sensibles frente a la mayoría de estos antibióticos. En un estudio sobre resistencia a antibióticos convencionales utilizados en medicina, de cinco cepas de BAL aisladas del estómago de la abeja melífera (L. fermentun (HM027462), L. kunkeei (GQ451631), L. pentosus (HM027640), Lactobacillus Taj Naser-1 (GQ451611), Lactobacillus ssp. Taj Makhdzir-Naser-1 (GQ451633), se reportan en la mayoría de ellas niveles de sensibilidad similares a los encontrados en el presente trabajo; aunque algunas de las cepas mostraron resistencia (7676. Gharehyakheh S, HosseinElhamirad A, Nateghi L, Varmira K. Evaluation of resistance to conventional antibiotics in medicine by 5 strains of Lactic Acid Bacteria isolated from the stomach of honey bee. Asian Journal of Biological and Life Sciences. 2017;6(3).). También se reportan en otros estudios variación en las cepas de Lactobacillus a los antibióticos (7777. Anisimova EA, Yarullina DR. Antibiotic resistance of Lactobacillus strains. Current microbiology. 2019;76(12):1407-1416.), pero la mayoría es sensible a los fármacos de uso clínico; aunque no todos los mecanismos de resistencia a antibióticos en Lactobacillus. ssp son intrínsecos.