En investigaciones descritas por diferentes autores, se muestra que el medio Man Rogosa y Sharpe (MRS) es un medio de cultivo adecuado para la recuperación de Lactobacillus spp. en condiciones de laboratorio; sin embargo, su costo se eleva cuando se produce a una escala mayor para obtener grandes cantidades y producir un probiótico comercial (11. Jurado GHA, Romo SI, Benavides DVC. Evaluación del efecto probiótico de Lactobacillus plantarum en la alimentación de lechones en fase de precebo como una alternativa del uso de antibióticos. Departamento de Producción y Procesamiento Animal, Universidad de Nariño, Pasto. Revista Investigación Pecuaria Colombia. 2013;2(1):55-62., 22. Sánchez L, Tromps J. Caracterización in vitro de bacterias ácido lácticas con potencial probiótico. Rev Salud Anim. 2014;(2):124-129., 33. Santos CMA, Pires MCV, Sánchez L, Martins F, Nicoli J. Selection of Lactobacillus strains as potential probiotics for vaginitis treatment. Microbiology. 2016;162:1195-1207.).
Para la formulación de un medio de cultivo de tipo industrial es necesario que este cumpla con todos los requerimientos nutricionales (nitrógeno, carbono, vitaminas y minerales) para el buen crecimiento del microorganismo; se requiere que estén biodisponibles en una materia prima obtenida como subproducto de algún otro proceso, o sea, abundante en el mercado y de bajo costo de producción (44. Mbarga MJA, Zangué SCD, Tatsadjieu LN, Zargar M, Albert E, Bayat M. Producing probiotic beverage based on raffia sap fermented by Lactobacillus fermentum and Bifidobacterium bifidum. Res. Crops. 2019;20(3):629-634.).
Investigaciones anteriores descritas por Vera et al. (55. Vera R Ormaza J, Muñoz J, Arteaga MF, Sánchez L. Cepas de Lactobacillus plantarum con potencialidades probióticas aisladas de cerdos criollos. Rev Salud Anim. 2018;40(2):1-12.) y Sánchez et al. (66. Sánchez L Vera R, Agüero F, Vega E. Seguridad biológica de Lactobacillus plantarum 22 LMC con potencialidad probiótica. Rev Salud Anim. 2020;42(2):1-9.), demostraron las características probióticas in vitro y la seguridad biológica de una cepa de L. plantarum 22 LMC aislada de intestino de cerdo. Para demostrar su efecto in vivo se necesita su inclusión en la alimentación de los lechones, de ahí que se debe desarrollar un probiótico con materias primas nacionales de bajo costo y lograr altos rendimientos de células viables sin afectar su actividad biológica, por lo que el objetivo fue obtener un candidato a probiótico de L. plantarum 22 LMC a nivel de laboratorio en un medio de cultivo natural con residuos agroindustriales.
Cepa: L. plantarum (22 LMC), aislada de la mucosa del ciego de cerdos de 30 días de edad, clínicamente sanos e identificada mediante técnicas moleculares por el laboratorio de Biotecnología Aplicada Concepto Azul (77. Concepto Azul SA. Informe de análisis taxonomía molecular de cepas bacteriana y de hongos de la Escuela Superior Politécnica Agropecuaria de Manabí. Guayaquil Ecuador. 2013:9.). Conservada en el cepario del Laboratorio de Biología molecular de la Escuela Superior Politécnica Agropecuaria de Manabí, Ecuador (ESPAM) y seleccionada por sus mejores características probióticas in vitro: resistencia a pH ácido y a sales biliares, buenas propiedades hidrofóbicas, autoagregantes y actividad antimicrobiana frente a patógenos.
Se diseñó un medio natural, según los requerimientos nutricionales de L. plantarum y lo descrito por varios autores (88. Ossa JA, Vanegas MC, Badillo ÁM. Evaluation of cane molasses as substrate for Lactobacillus plantarum growth. Revista UDCA Actualidad y Divulgación Científica. 2010;13(1):97-104., 11. Jurado GHA, Romo SI, Benavides DVC. Evaluación del efecto probiótico de Lactobacillus plantarum en la alimentación de lechones en fase de precebo como una alternativa del uso de antibióticos. Departamento de Producción y Procesamiento Animal, Universidad de Nariño, Pasto. Revista Investigación Pecuaria Colombia. 2013;2(1):55-62.). Se conformó con melaza de caña 20 %, suero de leche 33,0 % y autolizado de levadura 10,36 %, a pH 6,5 (MLS).
Se utilizó como control el Medio Mann Rugosa Sharpe (MRS, DifcoTM EUA).
Preparación del inóculo: L. plantarum (22 LMC) se multiplicó en caldo MRS a pH 6,7 a 37°C durante 24 a 48 h y, posteriormente, en agar del mismo medio. Para ello se empleó una incubadora (ESCO CelCulture®, EUA) con una atmósfera de CO2 de 5 % a 37°C durante 48 a 72°C, para establecer condiciones anaeróbicas.
Las colonias resultantes de la cepa L. plantarum 22 LMC se inocularon en dos frascos de 250 mL con 150 mL del medio MRS y se incubaron a 370C por 20 a 24 h, correspondiente a la fase logarítmica de crecimiento con una concentración de 108 UFC/mL para disponer del inóculo.
Volumen de inoculación: se inoculó el 10 % del volumen final para cada medio de cultivo, según lo referido por Vargas et al. (99. Vargas EM, Gómez CJ, Parra ME, Romero MA. Producción de microorganismos probióticos como aditivo para alimentos concentrados para ganado vacuno (primera parte). Revista de Ingeniería2004;( 19):167-178.).
Evaluación del crecimiento: se emplearon tres Erlenmeyer con tapas de rosca de 500 mL con 400 mL de líquido por medio de cultivo y se incubaron a 37°C durante 48 h en cultivos estáticos, para establecer las condiciones anaeróbicas en cultivos líquidos.
Se realizó una cinética de crecimiento hasta la entrada de la fase estacionaria crecimiento para evaluar los dos medios de cultivo durante 48 h y se tomaron muestras cada ocho horas para la cuantificación del número de unidades formadoras de colonias (UFC mL-1). Las corridas se realizaron por duplicado.
Para efectuar el conteo de colonias se tomó 10 mL de cada cultivo y se realizaron diluciones seriadas de las muestras en una relación de 1/10 (v/v) en agua peptonada (OXOID, EUA), desde 10-1 hasta 10-12. Las tres últimas diluciones se inocularon individualmente en placas Petri con agar MRS. Esta operación se replicó tres veces y las placas se incubaron a 37°C en condiciones de anaerobiosis en una incubadora (ESCO CelCulture®, EUA) de CO2 al 5 % por 48 h. Posteriormente, se realizó el conteo de las colonias en un contador de colonias digital (BOEGO modelo CC-1, Alemania).
A partir del programa de Microsoft Excel y los datos obtenidos en la cinética de crecimiento, se confeccionaron las curvas de dispersión; mediante la aplicación del método de ajuste se obtuvieron los polinomios correspondientes y los valores de µ. El td se determinó a través de la siguiente fórmula: (1010. Madigan MT, Martinko JM, Parker J. Brock Biology of Microorganisms. 8th Edition, Prentice Hall International, Inc., New York. 1997:153-154.).
Determinación de pH: se tomaron muestras de los cultivos cada 8 h y se midieron los valores de pH mediante un pHmetro digital (Sartorius, México).
Determinación de ácido láctico: se tomaron muestras de los cultivos a las 40 h de crecimiento correspondiente al final de la fase logarítmica de crecimiento y se determinó la producción de ácido láctico según lo descrito por Santos et al. (33. Santos CMA, Pires MCV, Sánchez L, Martins F, Nicoli J. Selection of Lactobacillus strains as potential probiotics for vaginitis treatment. Microbiology. 2016;162:1195-1207.).
Se prepararon cultivos de L. plantarum 22 LMC en Erlenmeyer de 5 L con 4 L de volumen de trabajo del medio MLS, para obtener dos concentraciones 1x 109 y 1x 10 10 UFC mL-1. Las concentraciones de los microorganismos se comprobaron mediante conteo de UFC en placas de agar MRS.
Se conformó un flujo de producción del candidato a probiótico a dos concentraciones representadas en la Figura 1.
La estabilidad en anaquel del probiótico se realizó a la temperatura de 5 ± 3°C durante 60 días. La selección de la temperatura se estableció según las recomendaciones establecidas por AGROCALIDAD (1111. Agrocalidad. Resolución, N. D. A. J. 2013 ec-0201.0099. Instructivo de la Normativa General para Promover y Regular la Producción Orgánica-Ecológica-Biológica en el Ecuador. Ecuador. 2013:64 .) y el centro para el control estatal de medicamentos, equipos y dispositivos médicos (CEDMED) (1212. CECMED Regulaciones 23-2000: Requerimientos de los estudios de estabilidad para el registro de productos farmacéuticos nuevos y conocidos CECMED. Cuba, 2000:27.) de Cuba.
Para ello se produjeron dos lotes de 5 L del probiótico de L. plantarum 22 LMC para cada concentración (1x 109 y 1x 1010 UFC mL-1), los cuales se distribuyeron en 24 frascos estériles con tapas de goma con 250 mL de volumen total. Se tomaron tres muestras para su análisis los días 1, 15, 35 y 60.
La estabilidad de este producto biológico se determinó por la viabilidad, la pureza microbiana y la determinación del pH hasta los 60 días.
El paquete estadístico utilizado fue INFOSTAT Versión 2,0 2017 (1313. Di Rienzo JA, Macchiavelli R, Casanoves F. Modelos lineales generalizados mixtos aplicaciones en InfoStat. 2017.). Se realizaron Ios análisis de varianza y la prueba de Duncan (1414. Duncan DB. Multiple Range and Multiple F Tests. Biometrics.1955;11(1):1-42. doi:10.2307/3001478.) para comparar los resultados en la capacidad de crecimiento microbiano entre los cultivos, la producción de ácido y eI pH en cada tiempo de muestreo.
En la Figura 2 se muestran las características del crecimiento de L. plantarum 22 LMC en dos medios de cultivo. En ambos medios se obtuvieron valores de crecimiento superiores a 12 Log UFC mL-1 a las 48 h. Al comparar el crecimiento de la cepa en el medio MLS, no existieron diferencias con respecto al crecimiento en el medio de referencia MRS.
Se observa que la fase logarítmica o exponencial de crecimiento comienza a las 10 h. Esta se prolonga hasta las 30 h; a partir de las 32 h se muestra una fase de desaceleración de crecimiento y a las 40 h entra el cultivo en la fase estacionaria de crecimiento. Al comparar los índices de crecimiento como la µ y el td en ambos medios, se comprobó que no existieron diferencias entre los valores hallados.
Estas características concuerdan con las descritas para las bacterias acido lácticas (BAL), que son microorganismos que se reproducen por fisión binaria, con altas velocidades de crecimiento y tiempos de duplicación entre 30-90 min, en óptimas condiciones de cultivo (1515. Sosa D, Garcia Y, Dustet JC. Desarrollo de probióticos destinados a la producción animal: experiencias en Cuba. Cuban J. Agric. Sci 2018;52(4):357-373.); en este caso, el tg se obtiene a los 66 min.
Además, son aspectos muy importantes a tener en cuenta para la selección de los microorganismos probióticos, los que deben poseer elevada velocidad de crecimiento para competir por los nutrientes y los sitios de adhesión dentro del ecosistema gastrointestinal, adherirse y colonizar la mucosa para ejercer su efecto beneficioso en el hospedero y disminuir su expulsión durante el paso por el tracto gastrointestinal (1616. Rojas C, Ochoa G, Alfaro R, Querevalú J, Sánchez H. Producción y evaluación de inóculos lácteos probióticos obtenidos del tracto digestivo de lechón (Sus scrofa domesticus) propuestos para alimentación porcina. Rev. mex. de cienc. pecuarias. 2021;12(1):120-137. Disponible en: https://doi.org/10.22319/rmcp.v12i1.5445.).
En la Figura 3 se observa una disminución del pH en el cultivo durante las 48 horas de crecimiento. Se encontraron valores de 3,11 ± 0,01 en el medio MLS y de 4,01 ± 0,05 en el medio MRS.
Se demuestra la alta capacidad de la cepa para acidificar el medio MLS, por lo que se infiere que se producen sustancias inhibitorias y, dentro de ellas, el ácido láctico. En este caso, a las 48 horas de crecimiento se encontraron valores de este ácido 3,28 ± 0,12 g.L-1 en el medio MLS y 2, 69 ± 0,12 g.L-1 en MRS con diferencias significativa para p≤ 0,05.
Las BAL se caracterizan por la producción de ácido láctico a niveles elevados. Varios autores refieren que estas son los microorganismos que más se utilizan como probióticos, donde hay un predominio de la producción de ácido láctico (1717. Saavedra S, Alejandro-Paredes L, Flores-Santos JC, Flores-Fernández CN, Arellano-García H, Zavaleta AI. Optimization of lactic acid production by Lactobacillus plantarum strain Hui1 in a medium containing sugar cane molasses. Agronomía Colombiana. 2021;39(1):98-107. Disponible en https://doi.org/10.15446/agron.colomb.v39n1.89674 ,1818. Vera Mejia RR, Vega Cañizarres E, Bulnes C, Agüero Diaz F, Zambrano Aguayo MD, Sánchez Miranda L. Actividad probiótica de Lactobacillus plantarum en los indicadores bioproductivos y de salud en lechones. Livestock Research for Rural Devlopment. 2019;31(11):31-37.).
Después de crecida la cepa de L. plantarum 22 LMC en el medio MLS, se estableció la obtención probiótico en mayores volúmenes a nivel de laboratorio.
Se precisaron los puntos de control de proceso que se debe realizar para producir a escala de laboratorio el probiótico y mantener la consistencia del mismo. Se elaboraron tres lotes para cada concentración y, a partir de estas producciones, se evaluó en cerdos en crecimiento. Se demostró su efecto de tipo probiótico en atención al comportamiento de la salud y bioproductividad de los mismos (1818. Vera Mejia RR, Vega Cañizarres E, Bulnes C, Agüero Diaz F, Zambrano Aguayo MD, Sánchez Miranda L. Actividad probiótica de Lactobacillus plantarum en los indicadores bioproductivos y de salud en lechones. Livestock Research for Rural Devlopment. 2019;31(11):31-37.).
Los resultados demuestran que la composición del medio MLS cubre los requerimientos nutricionales para la cepa L. plantarum 22 LMC, de forma similar al medio MRS, debido a sus componentes como la miel finaI o melaza, rica en azúcares fermentables, así como sales, minerales, vitaminas y factores de crecimiento (88. Ossa JA, Vanegas MC, Badillo ÁM. Evaluation of cane molasses as substrate for Lactobacillus plantarum growth. Revista UDCA Actualidad y Divulgación Científica. 2010;13(1):97-104.); el suero de leche que aporta fuente de nitrógeno orgánico en forma de aminoácidos, dentro de los cuales se reportan cisteína, metionina, triptófano, isoleucina y valina, además de vitaminas como el complejo B y minerales como calcio, fósforo y magnesio (1919. Yoo H, Rheem I, Rheem S, Oh S. Optimizing Medium Components for the Maximum Growth of Lactobacillus plantarum JNU 2116 Using Response Surface Methodology. Korean J Food Sci Anim Resour. 2018;38(2):240-250. doi:10.5851/kosfa.2018.38.2.240 ), el autolizado de levaduras proporciona aminoácidos esenciales, vitaminas, minerales y oligosacáridos.
En este sentido, Jurado et al. (11. Jurado GHA, Romo SI, Benavides DVC. Evaluación del efecto probiótico de Lactobacillus plantarum en la alimentación de lechones en fase de precebo como una alternativa del uso de antibióticos. Departamento de Producción y Procesamiento Animal, Universidad de Nariño, Pasto. Revista Investigación Pecuaria Colombia. 2013;2(1):55-62.) emplearon medios de cultivo naturales compuestos por azúcar, leche de soya comercial y suero de leche para caracterizar el crecimiento de L. plantarum y obtuvieron 12 Log UFC mL-1 de células viables con pH 3,7, con fines probióticos en lechones como una alternativa al tratamiento con antibiótico. Estos resultados son similares a los encontrados con el medio de MLS.
Flores et al. (2020. Flores LG, García Y, Usca JE, Caicedo WO. Estudio comparativo de tres aditivos zootécnicos en el comportamiento productivo y sanitario de cerdos en el período post-destete. Ciencia y Agricultura. 2016;13(2):95-105.), para la obtención de preparados de lactobacilos y levaduras, utilizaron el suero de leche en la formulación del medio de cultivo y obtuvieron 6,7 Log UFC mL-1 de células viables. Con la utilización del medio MLS, las concentraciones de células viables de L. plantarum 22 LMC fueron superiores a las que refirieron estos autores, posiblemente, por la utilización de la melaza de caña y del autolizado de levadura que aportan carbohidratos fermentables, vitaminas y minerales, por lo que los resultados validan el uso del medio de cultivo MLS conformado con materia prima agroindustrial para la elaboración del probiótico a escala de laboratorio y, posteriormente, su aplicación por vía oral en lechones.
La prueba de estabilidad es la principal herramienta para evaluar la fecha de caducidad y las condiciones de almacenamiento para productos biológicos. En este sentido, el probiótico con dos concentraciones de L. plantarum permanecieron estables durante el tiempo evaluado, ya que en la prueba de pureza microbiana realizada no se observaron contaminaciones con otros microorganismos. En el estudio de la de viabilidad (Figura 4) se observó una disminución del recuento de células viables a partir de los 35 días en las dos concentraciones analizadas.
Sin embargo, no hubo diferencias entre los tiempos evaluados. Las concentraciones requeridas de células viables durante los 60 días de almacenamiento se mantuvieron por encima de los niveles recomendados por la FAO (2121. Bajagai YS, Klieve AV, Dart PJ, Bryden WL. Probiotics in animal nutrition: production, impacts and regulation. En Harinder P.S. Makkar (Eds). FAO. Probiotics in animal nutrition Paper No. 179. 2017. Roma. ISBN: 978-92-5-109333-7.), que es entre 106 y 107 UFC mL-1 de microorganismos viables para un alimento probiótico.
Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Betancur et al. (2222. Betancur CA, Rondón AJ, Martínez Y, Rodríguez R. Formulación y caracterización de un biopreparado con Lactobacillus plantarum CAM-6, procedente del tracto digestivo de cerdos criollos. Cuban Journal of Agricultural Science. 2020;54(3):1-10.), quienes evaluaron algunos parámetros de estabilidad de un probiótico con cepas de L. plantarum con fines probióticos para cerdos. Estudios similares realizó Beruvides (2323. Beruvides A. Efecto del aditivo zootécnico VITAFERT en la respuesta biológica en crías y precebas porcinas. [Tesis presentada en opción al grado científico en Doctor en Ciencias Veterinarias]. Instituto de Ciencias Animal. Mayabeque, Cuba. 2019:pp.100.), con un aditivo VITAFER compuesto de BAL y levaduras para crías y cerdos en crecimiento. Estos autores comprobaron que a partir de los 30 días se afecta la viabilidad de las BAL, debido a que en estas condiciones se agotan los nutrientes esenciales para su desarrollo.
El pH obtenido en esta investigación se mantuvo dentro de los rangos establecidos para productos biológicos de esta categoría (Figura 5).
Según Benedetti y Palacios (2424. Benedetti DC, Palacios JA. Los probióticos y su uso en el tratamiento de enfermedades. Revista Ciencias Biomédicas. 2020;9(1):54-66.), los mecanismos de acción de los productos biológicos con valores de pH igual o inferior a 4, implican la inhibición del crecimiento de bacterias patógenas, la producción de ácido láctico, la disminución de la permeabilidad intestinal, el aumento de la actividad de la lactasa y la estimulación de la inmunidad, de manera que la disminución del pH en los productos obtenidos es indicador de la viabilidad de las bacterias lácticas; en este caso permanecen viables las bacterias de L. plantarum.
Es importante mencionar que se debe continuar la evaluación de la estabilidad en anaquel del probiótico en el tiempo a dos temperaturas (temperatura ambiente y 5 ± 3°C) debido a la importancia de la viabilidad del producto final.
Además, se recomienda el uso de este medio en la producción de otros probióticos, ya que presentan componentes de bajo costo que podrán sustituir el uso del medio MRS comercial como medio de referencia para el crecimiento de lactobacilos.
Se demostró que el medio de cultivo natural compuesto por materias primas agroindustriales (MLS) constituye un medio adecuado para el crecimiento de L. plantarum 22 LMC, ya que presenta una velocidad de crecimiento y concentraciones de células viables similares a las que se obtienen cuando se utiliza el medio MRS o medio de referencia. El probiótico de L. plantarum 22 LMC, a dos concentraciones de células viables, presentó estabilidad en anaquel en la viabilidad microbiana y el pH a temperatura de 5 ± 3°C, durante 60 días de almacenamiento.