Actividad antibacteriana de nanopartículas de plata a partir de hojas de Leea coccinea sobre Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus es una bacteria oportunista, Gram positiva, que forma parte de la microbiota de la piel en los animales y el hombre (11. Adhwa Masimen M, Harun N, Maulidiani M, Wan Ismail W. Overcoming Methicillin-Resistance Staphylococcus aureus (MRSA) using antimicrobial peptides-silver nanoparticles. Antibiotics. 2022;11(951): 1-16. https://doi.org/10.3390/antibiotics11070951.). Esta es incluida en el grupo ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter sp.), grupo de patógenos bacterianos más importantes implicados en infecciones, que comprometen la calidad y la vida del hospedero, y que, además, se caracterizan por el desarrollo de multirresistencia a antibióticos (22. Swolana D, Wojtyczka RD. Activity of silver nanoparticles against Staphylococcus spp. International Journal of Molecular Sciences. 2022;23(8). https://doi.org/10.3390/ijms23084298.). La resistencia a antibióticos constituye una problemática de prioridad para la FAO, OMS, OMSA y para el Programa de Naciones Unidas del Medioambiente (33. FAO, UNEP, WHO, WOAH. One Heath Joint Plan of Action (2022-2026). Working together for the health of humans, animals, plants and the environment. Rome. 2022. https://doi.org/10.4060/cc2289en.). Debido a la resistencia de Staphylococcus aureus a meticilina o vancomicina, este es incluido en la lista de patógenos de la OMS con alta prioridad para investigación y desarrollo de nuevos antimicrobianos (44. Tacconelli E, Carrara E, Savoldi A, Harbarth S, Mendelson M, Monnet DL, et al. Discovery, research, and development of new antibiotics: the WHO priority list of antibiotic-resistant bacteria and tuberculosis. The Lancet Infectious Diseases. 2017;18(3): 318-327. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(17)30753-3.).

En Cuba, tanto para la salud animal como humana, se necesitan de alternativas a antibióticos que permitan controlar las infecciones ocasionadas por S. aureus. La suspensión de nanopartículas de plata (NpAg) obtenidas por síntesis verde con extracto de hojas de Leea coccinea posee actividad antibacteriana sobre Xanthomonas phaseoli pv. phaseoli (55. Novelles T, Travieso C, Ortega AR, Pita BA, López MC, Pérez LD, et al. Biosynthesis of fluorescent silver nanoparticles from Leea coccinea leaves and their antibacterial potentialities against Xanthomonas phaseoli pv. phaseoli. Bioresources and Bioprocessing. 2021;8(3). https://doi.org/10.1186/s40643-020-00354-2.), bacteria fitopatógena Gram negativa, sin embargo, se desconoce las potencialidades de esta suspensión sobre bacterias Gram positivas patógenas de animales y humanos como S. aureus. Extender el estudio de actividad antibacteriana de esta suspensión de nanopartículas sobre S. aureus, permite ampliar su espectro de acción, elemento de relevancia para el desarrollo fututo de un antibacteriano competitivo en el mercado de la industria farmacéutica. El objetivo de este trabajo fue determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración mínima bactericida (CMB) de nanopartículas de plata (NpAg) obtenidas por síntesis verde con extracto de hojas de Leea coccinea sobre cepas de Staphylococcus aureus y aislados resistentes a meticilina.

Se utilizaron tres lotes (Lote 1, Lote 2, Lote 3) de suspensión de NpAg de Leea coccinea, donados por el laboratorio de Ecología Química del CENSA, con la finalidad de evaluar el comportamiento de la actividad antibacteriana ante un proceso de síntesis de NpAg de Leea coccinea, donde los extractos provenían de tres colectas diferentes. Las NpAg de Leea coccinea se sintetizaron mediante la bio-reducción catiónica a partir de los extractos acuosos de hojas frescas de Leea coccinea como fuentes de compuestos reductores y la solución de nitrato de plata (Merck) como la solución precursora del catión Ag⁺ (55. Novelles T, Travieso C, Ortega AR, Pita BA, López MC, Pérez LD, et al. Biosynthesis of fluorescent silver nanoparticles from Leea coccinea leaves and their antibacterial potentialities against Xanthomonas phaseoli pv. phaseoli. Bioresources and Bioprocessing. 2021;8(3). https://doi.org/10.1186/s40643-020-00354-2.).

Se utilizaron dos cepas de referencia S. aureus (ATCC 25923 y ATCC 6538) y dos aislados de S. aureus (Cuba8 y Cuba28) con multirresistencia a antibióticos, procedentes de muestras de piel de cerdos que pertenecen a la colección del Laboratorio de Bacteriología Animal del CENSA. Ambos aislados poseen genes de resistencia a β-lactámicos (incluyendo a la meticilina) y a aminoglucósidos. Además, el aislado Cuba28 presenta genes de resistencia a macrólidos, estreptograminas y quinolonas (66. Baez M, Collaud A, Espinosa I, Perreten V. MRSA USA300, USA300-LV and ST5-IV in pigs, Cuba. International Journal of Antimicrobial Agents. 2017;49(2): 259-261. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2016.12.001.).

La actividad antimicrobiana de los tres lotes de suspensión de NpAg de Leea coccinea sobre las cepas y aislados de S. aureus, se determinó por el método de diluciones seriadas (77. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically-M07. CLSI. 11th ed. 2018; 1-60. https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m07.). A partir de cultivos en medio agar nutriente (AN, Biocen) incubados durante 24 h a 36 °C, se prepararon suspensiones bacterianas de las cepas y los aislados de S. aureus a 10⁸ UFC/mL, en solución salina estéril (SS) al 0,85% de NaCl (Merck), a 0,5 McFarland. Se aplicó 100 µL de cada suspensión en medio caldo nutriente (CN, Biocen) para una concentración de 10⁶ UFC/mL. La concentración de inóculo en el medio CN se verificó por conteo de colonias viables expresada en unidades formadoras de colonia (UFC/mL) en placas de AN.

Se distribuyó 1 mL por tubo de medio con cada una de las suspensiones bacterianas. Se adicionó 1 mL de cada lote de suspensión de NpAg de Leea coccinea en el rango de concentraciones de 0,97 a 0,015 mg/mL. El ensayo se realizó por triplicado y se incluyeron los siguientes controles: medio de cultivo (CN), medio de cultivo con la suspensión de NpAg de Leea coccinea a 0,97 mg/mL y medio inoculado con la suspensión de S. aureus. Todos los tubos se incubaron a 36 °C con agitación a 17,8 rad/s.

Se identificó la CMI y la CMB. La CMI se estableció como la mínima concentración a la que la suspensión de NpAg de Leea coccinea inhibió el crecimiento visible de S. aureus en medio liquido (CN) después de 24 h de incubación. Para la CMB se tomó una asada de cada tubo y se sembró en una placa de medio AN, que se incubaron a 36 °C por 24 h. Se estableció la CMB como la concentración más baja de la suspensión de NpAg de Leea coccinea que resultó en un subcultivo negativo en medio sólido (AN). Este ensayo se repitió en tres experimentos independientes.

Los tres lotes de la suspensión de NpAg de Leea coccinea inhibieron el crecimiento de las cepas y los aislados de S. aureus (Tabla 1). Los valores de CMI de los tres lotes coinciden en 0,03 mg/mL, excepto para el Lote 3 sobre el aislado multiresistente Cuba8 (0,12 mg/mL). En las CMB, los tres lotes concuerdan en 0,12 mg/mL para las cepas de referencia y 0,485 mg/mL para los aislados multiresistentes.

Los resultados demuestran la reproducibilidad de la síntesis de la suspensión de NpAg de Leea coccinea, al mantener homogeneidad entre lotes y resaltan la acción de estas nanoestructuras híbridas sobre aislados dotados genéticamente con herramientas para la resistencia a diferentes grupos de antibacterianos, aunque para lograr esta actividad requirió cuatro veces el valor a la obtenida para las cepas de referencia.

El valor de CMI de la suspensión de NpAg de Leea coccinea se encuentra en el rango informado en la literatura para suspensiones de NpAg de extractos vegetales sobre S. aureus (0,02 - 0,250 mg/mL) (22. Swolana D, Wojtyczka RD. Activity of silver nanoparticles against Staphylococcus spp. International Journal of Molecular Sciences. 2022;23(8). https://doi.org/10.3390/ijms23084298.). Los valores de CMB de suspensiones de NpAg de extractos vegetales sobre S. aureus suelen estar en el rango entre 0,04 - 0,2 mg/mL (22. Swolana D, Wojtyczka RD. Activity of silver nanoparticles against Staphylococcus spp. International Journal of Molecular Sciences. 2022;23(8). https://doi.org/10.3390/ijms23084298.), rango que incluye el valor de CMB de la suspensión de NpAg de Leea coccinea sobre las cepas de referencia. Sin embargo, para alcanzar este efecto bactericida con la suspensión de NpAg de Leea coccinea, en los aislados multirresistentes, se necesita un valor superior de CMB en las suspensiones de NpAg de extractos de Leea coccinea,al informado por la literatura, lo que está en concordancia con una mayor dotación genética de estos aislados que le permite subsistir en condiciones adversas. No obstante, los valores de CMI y CMB pueden variar: en función: I) de la nanopartícula (condiciones edafoclimáticas en las que se cultivaron las plantas, parte de la planta seleccionada para el extracto, tamaño de partícula, carga superficial, forma de la estructura, pH, entre otras) y II) en correspondencia con las características genéticas (intrínsecas y adquiridas) del patógeno que le permitan subsistir en el medio, incluyendo el desarrollo de resistencia a compuestos (88. Mohammadlou M, Maghsoudi H, Jafarizadeh-Malmiri H. A review on green silver nanoparticles based on plants: Synthesis, potential applications and eco-friendly approach. International Food Research Journal. 2016;23(2): 446-463. http://ifrj.upm.edu.my/23(02)2016/(2).pdf ).

En la determinación de la actividad antibacteriana de NpAg sobre S. aureus, diferentes autores refieren el uso indistinto de los métodos de difusión de agar y/o por diluciones seriadas (22. Swolana D, Wojtyczka RD. Activity of silver nanoparticles against Staphylococcus spp. International Journal of Molecular Sciences. 2022;23(8). https://doi.org/10.3390/ijms23084298.). Sin embargo, ante la difusión limitada de las NpAg en el medio agarizado, el método de difusión en agar no permite una visualización real de la actividad antibacteriana. Para la evaluación de NpAg de Leea coccinea sobre S. aureus se utilizó el método de diluciones seriadas que permite una mayor dispersión de esta suspensión coloidal en el medio de cultivo y se aplicó incubación con agitación para garantizar el contacto de las NpAg con el patógeno.

La actividad antibacteriana de las NpAg se asocia fundamentalmente al metal Ag⁰, elemento con el que se vinculan sus principales modos de acción. Las NpAg poseen múltiples modos de acción sobre S. aureus que incluyen desde la adhesión directa, con cambios en la permeabilidad de la membrana, interacción con componentes celulares que comprometen los procesos metabólicos; formación de poros en la membrana, con alteraciones en la estructura celular; generación de exceso de especies reactivas del oxígeno, con daño oxidativo irreversible; y obstrucción de las señales de transducción vitales (11. Adhwa Masimen M, Harun N, Maulidiani M, Wan Ismail W. Overcoming Methicillin-Resistance Staphylococcus aureus (MRSA) using antimicrobial peptides-silver nanoparticles. Antibiotics. 2022;11(951): 1-16. https://doi.org/10.3390/antibiotics11070951.). Por otra parte, los componentes de las NpAg procedentes de los extractos vegetales pueden desencadenar sinergia con el metal, con mayor efecto antibacteriano u otros modos de acción; prevenir la aglomeración de NpAg y reducir la toxicidad del metal (99. Roy A, Bulut O, Some S, Mandal AK, Yilmaz MD. Green synthesis of silver nanoparticles: Biomolecule-nanoparticle organizations targeting antimicrobial activity. RSC Advances. 2019;9(5): 2673-2702. https://doi.org/10.1039/c8ra08982e.). Estos elementos en su conjunto hacen de estas sustancias híbridas una alternativa para combatir la resistencia antimicrobiana (RAM).

De forma general, contar con opciones diferentes a los antibióticos actuales, en el tratamiento de las infecciones provocadas por S. aureus, son una prioridad para los sistemas sanitarios. Esto se resalta cuando se enfrentan tratamientos frente a patógenos con patrones de resistencia o/y multiresistencia a dichos antibióticos. Otra aplicación de las NpAg de extractos vegetales es la unión con antibióticos (1010. Nandhini P, Kumar P, Mickymaray S, Alothaim AS, Somasundaram J, Rajan M. Recent developments in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) treatment: A review. Antibiotics. 2022;11(5): 1-21. https://doi.org/10.3390/antibiotics11050606.) o con péptidos (11. Adhwa Masimen M, Harun N, Maulidiani M, Wan Ismail W. Overcoming Methicillin-Resistance Staphylococcus aureus (MRSA) using antimicrobial peptides-silver nanoparticles. Antibiotics. 2022;11(951): 1-16. https://doi.org/10.3390/antibiotics11070951.) en combinaciones con efecto sinérgico de actividad antibacteriana ante el fenómeno de la RAM por S. aureus.

Los resultados de la actividad antibacteriana de la suspensión de NpAg de Leea coccinea sobre cepas y aislados multirresistentes de S. aureus, sugieren continuar con las investigaciones in vivo, en modelos de animales experimentales, para el futuro desarrollo de un producto antibacteriano. Además, se requieren de estudios posteriores encaminados a optimizar la estabilidad y desagregación de las nanoestructuras en el medio acuoso y sus posibles modos de acción.