Efectos beneficiosos de las células vero sobre la capacidad de desarrollo de embriones bovinos producidos in vitro

Reactivos y medios de cultivo in vitro

Los medios de cultivo se elaboraron con agua ultrapura (18 MΩ, calidad Milli-Q) y reactivos químicos calidad SIGMA, Ltd. En el caso del medio de cultivo CR1aa fue elaborado en el laboratorio (1313. Rosenkrans CF, First NL. Effect of free amino acids and vitamins on cleavage and developmental rate of bovine zygotes in vitro. J Anim Sci. 1994;72(2):434-7.). Todos los medios de cultivos se esterilizaron por filtración (poro de 0,22 µm Ø, MiniSart) y se conservaron durante un período máximo de cuatro semanas a 4 °C en frascos de cristal (500 mL) sellados.

Ovarios bovinos de mataderos donantes de CCOs inmaduros

Los ovarios se adquirieron del matadero local "Manolo Rojo" (Municipio Nueva Paz, Empresa Cárnica Tauro, Mayabeque) ubicado a dos horas de viaje con respecto al laboratorio. Como donantes se aprovecharon hembras adultas mestizas (Hosltein/Cebú) con una condición corporal entre 1,5 a 2 de una escala de 5 puntos. Los ovarios colectados fueron depositados en una solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7.2) suplementada con 50 µg/mL de sulfato de gentamicina (Sigma, G4793) y transportados hasta al laboratorio a una temperatura entre los 28 y 30 °C.

Maduración in vitro de los CCOs inmaduros

Los CCOs fueron extraídos por el método de punción folicular considerando folículos con diámetros entre 3 a 5 mm. Una vez extraídos los CCOs fueron clasificados teniendo en cuenta el: i) número de capas del cumulus oophorus, ii) la compactación del c. oophorus, y iii) la homogeneidad e intensidad del color del citoplasma del óvulo. Los CCOs seleccionados fueron madurados en medio TCM 199 (Sigma, M4530) suplementado con gonadotropinas a razón de 10 µg/mL de FSHp (Sigma, F2293), 10 µg/mL de LHo (Sigma, L5269), 1 µg/mL de 17 β Estradiol (Sigma, E2758) y 10% de suero fetal bovino inactivado (Catalog No. 11550356, GIBCO, USA). Además, se le agregó 10 ng/mL del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF-hr, Lote 03IFAB864, CIGB, La Habana, Cuba), 1 mM de glutamina (Sigma, G8540), 0,2 mM de piruvato de sodio (Sigma, P4562) y 50 µg /mL de sulfato de gentamicina (Sigma, G4793). La maduración in vitro se realizó en cajas de cultivo de cuatro pocillos (Four Wells, Nunclon ™, Delta, Surface, Denmark), donde se depositaron 400 µL de medio de maduración TCM 199 por pocillo y entre 25 a 30 CCOs/ pocillo. Inmediatamente, los CCOs se incubaron por espacio de 22 h en una atmósfera compuesta por 100 % de humedad relativa, 5% de CO₂ en aire y a 38,5 °C. Se consideraron como criterios de maduración citoplasmática y nuclear: i) Expansión y grado de mucificación del c. oophorus, y ii) la extrusión del primer cuerpo polar.

Fertilización in vitro de los CCOs maduros

La capacitación y selección de los espermatozoides móviles se realizó por el principio de Swim-Up (1414. Parrish JJ. Bovine in vitro fertilization: in vitro oocyte maturation and sperm capacitation with heparin. Theriogenology. 2014;81(1):67-73.,1515. Parrish JJ, Susko-Parrish JL, Leibfried-Rutledge ML, Critser ES, Eyestone WH, First NL. Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen. Theriogenology. 1986;25(4):591-600.). Del nitrógeno líquido se extrajeron cuatro pastillas de semen congelado y depositaron individualmente en tubos cónicos con 1 mL de medio de capacitación TALP-SPERM [Elaborado en el laboratorio; (1414. Parrish JJ. Bovine in vitro fertilization: in vitro oocyte maturation and sperm capacitation with heparin. Theriogenology. 2014;81(1):67-73.)], enriquecido con 0,2 mM de piruvato de sodio (Sigma, P4562), 6 mg/mL de BSA (Sigma, A3311) y 50 µg/mL de sulfato de gentamicina (Sigma, G4793). Cada muestra se incubó a 37 °C durante 1 h. Luego, el sobrenadante de las muestras se extrajo mezclándolas suavemente en un sólo tubo. Los espermatozoides se centrifugaron dos veces (200 x g) por 10 minutos, intercalando entre ellas un cambio de medio fresco TALP-SPERM. Del precipitado formado se tomó aproximadamente 1 x 10⁶ espermatozoides, y fueron depositados en medio TALP-FERT (microgotas de fertilización de 400 µL). Este medio fue suplementado con 0,2 mM de piruvato de sodio, 6 mg/mL de BSA (Sigma, A6003), 5 mM de glucosa (Sigma, G6152), 50 µg /mL de sulfato de gentamicina (Sigma, G4793), 10 µg/mL de sulfato de heparina (Sigma, H3149) y la mezcla correspondiente de activadores 2mM D-Penicilamina (Sigma, P4875), 1 mM de hipotaurina (Sigma, H1384) y 250 µM de epinefrina (Sigma, E4250). Seguidamente, los CCOs maduros se distribuyeron en las microgotas de fertilización in vitro a razón de 30 CCOs por pocillo y se coincubaron con los espermatozoides por 48 h. Se consideró como único criterio de fertilización los cigotos divididos a las 48 horas post inseminación. Los cigotos obtenidos fueron cocultivados en microgotas de 400 µL de medio CR1aa con o sin células Vero según el diseño experimental. En general se utilizó una atmósfera de cultivo compuesta por 5% de CO₂ en aire, 100% de humedad relativa y una temperatura de 38,5 °C.

Producción in vitro de los embriones clonados

La CS se realizó por el método tradicional de Wilmut et al., 1997 (1616. Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Cloning Stem Cells. 2007;9(1):3-7.). Ovocitos en MII (18-20 horas post maduración) fueron desnudados por pipeteo en medio de manipulación suplementado con 0,3 mg/mL de hialuronidasa (Sigma, H4272), una vez libres de célula del cúmulo se seleccionaron los ovocitos con cuerpo polar y citoplasma homogéneo. Para la enucleación éstos se incubaron durante 20 min en medio de manipulación con citocalasina B (7,5 µg/mL; Sigma, C6762), e individualmente se le extracción del plato metafásico y el primer cuerpo polar a cada óvulo maduro. Seguidamente, los citoplastos fueron reconstruidos con fibroblastos fetales, e inducida la fusión celular en una solución de Manitol 0,3 M (Sigma, M1902), aplicando dos pulsos eléctricos 2,2 kV/cm² de una duración de 30 µs (CELLFUSION, CF150/B, BLS®, Hungría). Los complejos fundidos fueron reprogramados en medio TCM 199 que contenía cicloheximida (10 µg/mL; Sigma, C4859) y citocalasina B (5 µg/mL) más 10% suero fetal bovino. Los embriones clonados fueron cultivados en microgotas de 400 µL de medio CR1aa en la presencia o no de las células Vero según el diseño experimental.

Cultivo in vitro de las células Vero y elaboración de las monocapas para el cultivo de los embriones

Para el establecimiento de las monocapas celulares se extrajo del nitrógeno líquido un vial de células Vero (Subpase 7, concentración celular de 2,5 x 10⁶ células/ mL), e inmediatamente fue descongelado a 37 °C. El contenido del vial se diluyó en 10 mL de medio CR1aa suplementado con 2% de suero fetal bovino, y dicho volumen centrífugado a 120 x g/ 10 min. Seguidamente, el precipitado fue extraído y diluido en 10 mL de medio CR1aa a razón de 1 x 10⁵ células/mL. A partir de esta dilución se extrajo 1 mL y se depositó en cada pocillo de las placas de cultivo (4-Wells, Nunclon ™, Delta, Surface, Denmark). Las células Vero fueron cultivadas por 24 h hasta observar la formación de la monocapa, pasado ese tiempo se le retiró el 100% del medio de cultivo y añadió medio fresco CR1aa suplementado con 2% de suero fetal bovino y 12,5 µM de 2β-Mercaptoetanol (Sigma, M7522), quedando lista la monocapa para el cultivo de los embriones bovinos.

Diseño experimental

Análisis estadístico

Para los análisis estadísticos fue utilizada la prueba de Chi-cuadradro (22. Cordeiro ALL, Satrapa RA, Gregianini HAG, Gregianini JTF, Maia GFN, Landim-Alvarenga FC. Influence of temperature-humidity index on conception rate of Nelore embryos produced in vitro in northern Brazil. Trop Anim Health Prod. 2020;52(3):1527-32.) con un nivel de significación de p< 0,05, empleando el programa GraphPad Prism version 6.00 para Windows (GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com).

Desarrollo in vitro de los embriones producidos por FIV y cocultivados en monocapas de células Vero

Las células Vero, con características epiteliales y un origen común al tracto reproductivo (mesodermo; ver figura 1A y B), han demostrado su capacidad para estimular el desarrollo embrionario in vitro (55. Ménézo YJ, Servy E, Veiga A, Hazout A, Elder K. Culture systems: embryo co-culture. Methods Mol Biol. 2012;912:231-47.,1717. Ammerman NC, Beier-Sexton M, Azad AF. Growth and maintenance of Vero cell lines. Curr Protoc Microbiol. 2008;Appendix 4:Appendix 4E.), en particular en condiciones subóptimas de cultivo (66. Conway-Myers BA. Co-culture update: creating an embryotrophic environment in vitro. Semin Reprod Endocrinol. 1998;16(3):175-82.) y en embriones micromanipulados (1818. Hajian M, Hosseini SM, Asgari V, Ostadhoosseini S, Forouzanfar M, Nasr Esfahani MH. Effect of Culture System on Developmental Competence, Cryosurvival and DNA-Fragmentation of In Vitro Bovine Blastocysts. Int J Fertil Steril. 2011;5(1):21-6.). En nuestro experimento se observaron diferencias altamente significativas (Gráfico 1) en los porcentajes de embriones que alcanzaron la primera división embrionaria 75,4% vs 60,9% (p<0,0052), y el estadio de blastocisto 17,8% vs 8,1%; (p<0,0001) cuando fueron cocultivados o no, sobre células Vero. Estudios relacionados demuestran el efecto positivo que ejerce las células Vero sobre el desarrollo embrionario en bovinos, con incrementos significativos en la producción de blastocisto, de 26,5% vs 0,7% (p<0,001) (1919. Menck MC, Guyader-Joly C, Peynot N, Le Bourhis D, Lobo RB, Renard JP, et al. Beneficial effects of Vero cells for developing IVF bovine eggs in two different coculture systems. Reprod Nutr Dev. 1997;37(2):141-50.) y 14,7% vs 2.8% (p<0,01) (2020. Myers MW, Broussard JR, Menezo Y, Prough SG, Blackwell J, Godke RA, et al. Established cell lines and their conditioned media support bovine embryo development during in-vitro culture. Hum Reprod. 1994;9(10):1927-31.), en condiciones de cocultivo o no con células Vero, respectivamente. En bovinos, los resultados publicados hasta la fecha demuestran el gran potencial de las células Vero para incrementar el desarrollo de blastocitos in vitro con valores entre un 15,7% (2121. Pegoraro LM, Thuard JM, Delalleau N, Guérin B, Deschamps JC, Marquant Le Guienne B, et al. Comparison of sex ratio and cell number of IVM-IVF bovine blastocysts co-cultured with bovine oviduct epithelial cells or with Vero cells. Theriogenology. 1998;49(8):1579-90.) y 36,3% (2222. Duszewska AM, Reklewski Z, Pieńkowski M, Karasiewicz J, Modliński JA. Development of bovine embryos on Vero/BRL cell monolayers (mixed co-culture). Theriogenology. 2000;54(8):1239-47.). También, en humanos se ha demostrado la utilidad de los cocultivos con células Vero para la producción de blastocitos in vitro (57,0% vs 17,0%; p<0,05) (2323. Menezo Y, Hazout A, Dumont M, Herbaut N, Nicollet B. Coculture of embryos on Vero cells and transfer of blastocysts in humans. Hum Reprod. 1992;7 Suppl 1:101-6.), y el número de blastómeros por embrión (2424. Fong CY, Bongso A. Comparison of human blastulation rates and total cell number in sequential culture media with and without co-culture. Hum Reprod. 1999;14(3):774-81.).

El cocultivo es una relación tripartita entre "Medio de cultivo-Células-Embrión" generándose efectos beneficiosos que favorecen el desarrollo embrionario. Entre estos, la detoxificación del medio, regulación de concentraciones de gases y metabolitos; así como la secreción de factores proteicos son los más importantes. Este último, es conocido como "sistema embriotrófico autocrino" (88. Bavister BD. Culture of preimplantation embryos: facts and artifacts. Hum Reprod Update. 1995;1(2):91-148.), identificándose en cultivo de células Vero polipéptidos con pesos moleculares que oscilan entre 6,5 a 35,9 kDa, y concentraciones en el orden de 2-4 µg de proteínas/mL (2525. Chen HF, Ho HN, Chen SU, Chao KH, Lin HR, Huang SC, et al. Peptides extracted from Vero cell cultures overcome the blastocyst block of mouse embryos in a serum-free medium. J Assist Reprod Genet. 1994;11(3):165-71.).

También es interesante el uso de medios condicionados, proceso en el cual los medios de cultivos son expuestos a las células Vero durante 48h a 72h, y enriqueciendo el medio de cultivo con proteínas como: el factor de crecimiento epidérmico, factor inhibidor de la leucemia, factor de crecimiento transformador-β, e interleucina 6, entre otros (66. Conway-Myers BA. Co-culture update: creating an embryotrophic environment in vitro. Semin Reprod Endocrinol. 1998;16(3):175-82.,2626. Desai NN, Goldfarb JM. Growth factor/cytokine secretion by a permanent human endometrial cell line with embryotrophic properties. J Assist Reprod Genet. 1996;13(7):546-50.). Se ha comprobado en otros cocultivos como las células epiteliales obtenidas de oviducto bovino (BOEC, por sus siglas en inglés) secretan proteínas en el orden de 32 - 37 µg/mL (2727. Maeda J, Kotsuji F, Negami A, Kamitani N, Tominaga T. In vitro development of bovine embryos in conditioned media from bovine granulosa cells and vero cells cultured in exogenous protein- and amino acid-free chemically defined human tubal fluid medium. Biol Reprod. 1996;54(4):930-6.) y células de granulosa bovina en el orden de 40 µg de proteínas/mL (2828. Mermillod P, Vansteenbrugge A, Wils C, Mourmeaux JL, Massip A, Dessy F. Characterization of the embryotrophic activity of exogenous protein-free oviduct-conditioned medium used in culture of cattle embryos. Biol Reprod. 1993;49(3):582-7.). Estas proteínas, una vez purificadas e incluidas en el cultivo de embriones, a razón de 0,8-1,6 µg/µL, incrementan los porcentajes de blastocistos eclosionados (21,6% vs 1,4%; p<0.05), demostrándose su papel embriotrófico (2525. Chen HF, Ho HN, Chen SU, Chao KH, Lin HR, Huang SC, et al. Peptides extracted from Vero cell cultures overcome the blastocyst block of mouse embryos in a serum-free medium. J Assist Reprod Genet. 1994;11(3):165-71.). En bovinos se ha observado un incremento significativo en la producción de blastocistos, con diferencias de 14,7% vs 2,8% (p<0,01) (20) y 14,6% vs 0,7% (p<0,001) (1919. Menck MC, Guyader-Joly C, Peynot N, Le Bourhis D, Lobo RB, Renard JP, et al. Beneficial effects of Vero cells for developing IVF bovine eggs in two different coculture systems. Reprod Nutr Dev. 1997;37(2):141-50.), cuando fueron utilizados medios condicionado y no condicionado, respectivamente. Este efecto también ha sido comprobado con la adición de factores de crecimiento “puros” en los medios de cultivos in vitro de embriones, reflejándose en un incremento en la tasa de desarrollo de blastocistos, así como un número superior de blastómeros por embrión, y una reducción significativa de blastómeros en apoptosis (2929. Ahumada CJ, Salvador I, Cebrian-Serrano A, Lopera R, Silvestre MA. Effect of supplementation of different growth factors in embryo culture medium with a small number of bovine embryos on in vitro embryo development and quality. Animal. 2013;7(3):455-62.-3131. Wooldridge LK, Keane JA, Rhoads ML, Ealy AD. Bioactive supplements influencing bovine in vitro embryo development. J Anim Sci. 2022;100(7).).

Si bien las células Vero han sido una de las líneas celulares de mayor uso para el cocultivo de embriones en diferentes especies, otras líneas celulares han demostrado su capacidad de promover el desarrollo embrionario en condiciones in vitro como, por ejemplo: las células de hígado de ratas búfalo (BRL, por sus siglas en inglés) (2222. Duszewska AM, Reklewski Z, Pieńkowski M, Karasiewicz J, Modliński JA. Development of bovine embryos on Vero/BRL cell monolayers (mixed co-culture). Theriogenology. 2000;54(8):1239-47.), las células de riñón bovino Madin-Darby (MDBR, por sus siglas en inglés) (2020. Myers MW, Broussard JR, Menezo Y, Prough SG, Blackwell J, Godke RA, et al. Established cell lines and their conditioned media support bovine embryo development during in-vitro culture. Hum Reprod. 1994;9(10):1927-31.); y células de la granulosa, y células mesenquimales derivadas de tejido adiposo (3232. Miranda MS, Nascimento HS, Costa MP, Costa NN, Brito KN, Lopes CT, et al. Increasing of blastocyst rate and gene expression in co-culture of bovine embryos with adult adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Assist Reprod Genet. 2016;33(10):1395-403.).

En nuestras condiciones se extrajeron un promedio 2,4 CCOs/ovario (n=2105 CCOs/ 888 ovarios bovinos) en 17 réplicas experimentales (Resultados no publicados), con la particularidad que estos gametos provienen de hembras con baja condición corporal, como consecuencia de estrés nutricional. Si bien la viabilidad de estos gametos está comprometida por esta condición (99. Cardoso FC, Kalscheur KF, Drackley JK. Symposium review: Nutrition strategies for improved health, production, and fertility during the transition period. J Dairy Sci. 2020;103(6):5684-93.), en nuestro caso el uso del cocultivo jugó un papel beneficioso en los embriones producidos. Este resultado ofrece una opción práctica aquellos grupos que sólo cuentan con ovarios de matadero proveniente de hembras de desecho, y requieren grandes cantidades de gametos. No menos importante es una alternativa más económica en comparación con otras técnicas para la extracción de CCOs inmaduros, como las técnicas de Ovum Pick-Up (OPU, por sus siglas en inglés) (3333. Baruselli PS, Sá Filho MF, Ferreira RM, Sales JN, Gimenes LU, Vieira LM, et al. Manipulation of follicle development to ensure optimal oocyte quality and conception rates in cattle. Reprod Domest Anim. 2012;47 Suppl 4:134-41.,3434. Ferré LB, Alvarez-Gallardo H, Romo S, Fresno C, Stroud T, Stroud B, et al. Transvaginal ultrasound-guided oocyte retrieval in cattle: State-of-the-art and its impact on the in vitro fertilization embryo production outcome. Reprod Domest Anim. 2023;58(3):363-78.) o la superovulación de hembras donantes (3535. Mikkola M, Hasler JF, Taponen J. Factors affecting embryo production in superovulated Bos taurus cattle. Reprod Fertil Dev. 2019;32(2):104-24.).

Desarrollo de los embriones clonados bovinos cocultivados en monocapas de células Vero

En un segundo experimento, un total de 1482 embriones clonados fueron divididos en dos variantes de cultivo in vitro. La presencia de células Vero tuvo un efecto positivo en los embriones micromanipulados, lográndose diferencias altamente significativas, particularmente, en el desarrollo in vitro de blastocistos, de 28,9% vs 10,2% (p<0,0001), cocultivados con o sin células Vero, respectivamente (Tabla 1). La clonación somática es una técnica compleja que por su extensa micromanipulación infringe numerosos daños a los embriones (3636. Malin K, Witkowska-Piłaszewicz O, Papis K. The many problems of somatic cell nuclear transfer in reproductive cloning of mammals. Theriogenology. 2022;189:246-54.). Los principales daños son ejercidos sobre la integridad y volumen del citoplasma embrionario, la zona pelúcida, la exposición a inhibidores de la síntesis proteica, y uso de ionóforos para provocar la activación artificial del genoma embrionario (3737. Srirattana K, Kaneda M, Parnpai R. Strategies to Improve the Efficiency of Somatic Cell Nuclear Transfer. Int J Mol Sci. 2022;23(4).,3838. Czernik M, Anzalone DA, Palazzese L, Oikawa M, Loi P. Somatic cell nuclear transfer: failures, successes and the challenges ahead. Int J Dev Biol. 2019;63(3-4-5):123-30.). Por ello, es de interés permanente la búsqueda de tratamientos y vías que permitan incrementar la viabilidad de los embriones post micromanipulación. El uso del cocultivo ha sido efectivo en otras técnicas de micromanipulación que provocan daños significativos en las citoestructuras y metabolismo de óvulos y embriones (1818. Hajian M, Hosseini SM, Asgari V, Ostadhoosseini S, Forouzanfar M, Nasr Esfahani MH. Effect of Culture System on Developmental Competence, Cryosurvival and DNA-Fragmentation of In Vitro Bovine Blastocysts. Int J Fertil Steril. 2011;5(1):21-6., 3939. Diez C, Heyman Y, Le Bourhis D, Guyader-Joly C, Degrouard J, Renard JP. Delipidating in vitro-produced bovine zygotes: effect on further development and consequences for freezability. Theriogenology. 2001;55(4):923-36.). Con embriones clonados bovinos, cocultivados con células Vero, se alcanzan altos valores de producción de blastocitos, que oscilan entre un 37,4% (4040. Liu L, Shin T, Pryor JH, Kraemer D, Westhusin M. Regenerated bovine fetal fibroblasts support high blastocyst development following nuclear transfer. Cloning. 2001;3(2):51-8.) y un 29,8% (4141. Li GP, White KL, Aston KI, Meerdo LN, Bunch TD. Conditioned medium increases the polyploid cell composition of bovine somatic cell nuclear-transferred blastocysts. Reproduction. 2004;127(2):221-8.).

En el aspecto citomorfológico se comprobó que los blastocistos producidos en condiciones de cocultivo poseen un botón embrionario y trofoblasto bien definidos (Figura 2 A, B). Con una edad de siete días post cultivo in vitro, estos poseen un promedio de 101±61,0 núcleos/ embrión clonado (n=12, blastocistos), en comparación con los embriones obtenidos de cultivos sin células Vero 62±28,8 núcleos/ embrión clonado (n=12, blastocistos). Los resultados obtenidos coinciden con investigaciones previas. Por ejemplo, en medio CR1aa se obtuvieron un total de 92,5±13,3 núcleos/ embrión clonado (n=11, blastocistos), y en medio complejo Menezo-B2 se lograron 103.6±6.6 núcleos/ embrión clonado (n=27, blastocistos) (4040. Liu L, Shin T, Pryor JH, Kraemer D, Westhusin M. Regenerated bovine fetal fibroblasts support high blastocyst development following nuclear transfer. Cloning. 2001;3(2):51-8.).

Conocer el número de núcleos que contiene un embrión producido in vitro es de vital importancia, ya que existe una estrecha relación entre el número de núcleos que posee un embrión y la viabilidad embrionaria en las etapas pre y post implantatoria. Se plantea que, para establecer una preñez a partir de la transferencia de un blastocisto bovino, con una edad de siete días post fertilización in vitro, debe tener un número crítico de 117±6 núcleos totales (4242. Ross PJ, Goissis MD, Martins JPN, Chitwood JL, Pursley JR, Rosa GJM, et al. Blastocyst Cell Number and Allocation Affect the Developmental Potential and Transcriptome of Bovine Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos. Stem Cells Dev. 2023;32(17-18):515-23.). Sin embargo, esta cifra puede variar entre laboratorios, e incluso desconocerse ya que no se realizan los estudios de fluorescencia nuclear necesarios para determinar la calidad de los mismos.

Otro factor determinante para obtención de buenos resultados en la producción in vitro de embriones bovinos es la correcta selección del medio de cultivo. En este experimento se utilizó medio CR1aa elaborado en nuestro laboratorio. Es un medio simple diseñado específicamente para el cultivo de embriones bovinos, y puede ser elaborado con reactivos y agua de calidad apropiados (4343. Rosenkrans CF, Zeng GQ, MCNamara GT, Schoff PK, First NL. Development of bovine embryos in vitro as affected by energy substrates. Biol Reprod. 1993;49(3):459-62.). Es significativo la supervivencia de las células Vero nueve días en medio CR1aa sin sufrir cambios visibles de muerte celular, propiedad que permite mantener los embriones en este sistema de cocultivo por el tiempo seleccionado. Según la compañía Americana de Colecciones de cultivos Celulares (ATCC®, por sus siglas en inglés), recomienda para su cultivo utilizar el Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) suplementado con 10% de suero fetal bovino, y realizarle cambios de medios de 3 a 4 veces por semana.

Esta línea celular, con morfología epitelial, conserva la propiedad de inhibición de la proliferación por contacto. Por ello, para su mantenimiento es recomendable evitar que alcance la máxima confluencia, ya que en esta fase dejan de crecer y se inician los eventos de senescencia. En nuestras condiciones, las células Vero fueron sembradas a un 50% de confluencia en pocillos con un área de 1,9 cm², a una relación de ≈520 células/mm², requiriendo entre 24 a 30 h para doblar su número y conforma una monocapa al 100% de confluencia (≈1300-1500 células/mm²). Durante el periodo de cocultivo in vitro propuesto para los embriones micromanipulados (7-9 días), no se observaron en las monocapas de células Vero signos de muerte celular o cambios mayores, como por ejemplo el desprendimiento o contracción individual de las células o de las monocapas formadas. Estudios relacionados demuestran la adaptabilidad de las células Vero en cultivos libres de suero fetal (1919. Menck MC, Guyader-Joly C, Peynot N, Le Bourhis D, Lobo RB, Renard JP, et al. Beneficial effects of Vero cells for developing IVF bovine eggs in two different coculture systems. Reprod Nutr Dev. 1997;37(2):141-50.), en nuestras condiciones la inclusión de un 2% de suero fetal bovino fue suficiente para conservar las monocapas celulares por espacio de dos semanas.