Introducción
⌅La criobiología es la ciencia que estudia la respuesta de las células vivas a los eventos físico-químicos de la congelación. Los principios de congelación han permitido la conservación de una gran diversidad de tejidos, células somáticas y reproductivas de numerosas especies del reino animal y vegetal (11. Bolton R.L., Mooney A., Pettit M.T., Bolton A.E., Morgan L., Drake G.J., et al. Resurrecting biodiversity: advanced assisted reproductive technologies and biobanking. Reprod Fertil. 2022;3(3):R121-R46., 22. Holt W.V., Comizzoli P. Genome resource banking for wildlife conservation: promises and caveats. Cryo Letters. 2021;42(6):309-20.). Por esta vía es posible conservar indefinidamente los genofondos genéticos de las principales especies animales de interés productivo y científico. Particularmente, en el área de las investigaciones, la crioconservación de óvulos, espermatozoides, embriones y fragmentos de gónadas (33. Leibo S.P., Sztein J.M. Cryopreservation of mammalian embryos: Derivation of a method. Cryobiology. 2019;86:1-9.-55. Agca Y., Agca C. Cryopreservation and Transplantation of Laboratory Rodent Ovarian Tissue for Genome Banking and Biomedical Research. Methods Mol Biol. 2021;2180:469-83.) han facilitado la protección de numerosos biomodelos experimentales, especialmente los ratones de laboratorio (Mus musculus) (66. Takeo T., Nakao S., Nakagawa Y., Sztein J.M., Nakagata N. Cryopreservation of mouse resources. Lab Anim Res. 2020;36:33.-88. Hart-Johnson S., Mankelow K. Archiving genetically altered animals: a review of cryopreservation and recovery methods for genome edited animals. Lab Anim. 2022;56(1):26-34.).
Con este propósito se han utilizado diferentes técnicas para la crioconservación de embriones preimplantatorios, técnicas que en su mayoría son de compleja ejecución y requieren equipamiento sofisticado (99. Boubelik M., Cerna Z. A modified two-step method for cryopreservation of mouse embryos for purposes of embryo banking. Folia Biol (Praha). 1993;39(4):211-9., 1010. Taft R. Mouse Embryo Cryopreservation by Slow Freezing. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(5).). Sin embargo, nuevos métodos de crioconservación sobresalen por su simple ejecución y bajos costos de implementación como la congelación ultrarrápida (1111. Shaw J.M., Diotallevi L., Trounson A.O. A simple rapid 4.5 M dimethyl-sulfoxide freezing technique for the cryopreservation of one-cell to blastocyst stage preimplantation mouse embryos. Reprod Fertil Dev. 1991;3(5):621-6., 1212. Trounson A., Peura A., Kirby C. Ultrarapid freezing: a new low-cost and effective method of embryo cryopreservation. Fertil Steril. 1987;48(5):843-50.) y la técnica de vitrificación (1313. Oikonomou Z, Chatzimeletiou K, Sioga A, Oikonomou L, Tarlatzis B.C., Kolibianakis E. Effects of vitrification on blastomere viability and cytoskeletal integrity in mouse embryos. Zygote. 2017;25(1):75-84., 1414. Ghandy N, Karimpur Malekshah A.A. Which Stage of Mouse Embryos Is More Appropriate for Vitrification? Int J Fertil Steril. 2017;10(4):357-62.).
La vitrificación se ha empleado con una alta efectividad para la crioconservación de células y tejidos reproductivos (1515. Shaw J.M., Jones G.M. Terminology associated with vitrification and other cryopreservation procedures for oocytes and embryos. Hum Reprod Update. 2003;9(6):583-605., 1616. Vajta G. Vitrification of the oocytes and embryos of domestic animals. Anim Reprod Sci. 2000;60-61:357-64.). En ratones se han obtenido crías viables a partir de la vitrificación de embriones en todos los estadios preimplantatorios (1111. Shaw J.M., Diotallevi L., Trounson A.O. A simple rapid 4.5 M dimethyl-sulfoxide freezing technique for the cryopreservation of one-cell to blastocyst stage preimplantation mouse embryos. Reprod Fertil Dev. 1991;3(5):621-6., 1717. Ali J, Shelton J.N. Vitrification of preimplantation stages of mouse embryos. J Reprod Fertil. 1993;98(2):459-65., 1818. Nakao K, Nakagata N, Katsuki M. Simple and efficient vitrification procedure for cryopreservation of mouse embryos. Exp Anim. 1997;46(3):231-4.). Generalmente son seleccionados estadios embrionarios avanzados para crioconservar genofondos, ya que estos cuentan con un mayor número de blastómeros y capacidad de supervivencia post descongelación (1414. Ghandy N, Karimpur Malekshah A.A. Which Stage of Mouse Embryos Is More Appropriate for Vitrification? Int J Fertil Steril. 2017;10(4):357-62., 1919. Zhou G.B., Hou Y.P., Jin F, Yang Q.E., Yang Z.Q., Quan G.B., et al. Vitrification of mouse embryos at various stages by open-pulled straw (OPS) method. Anim Biotechnol. 2005;16(2):153-63., 2020. Zhang J, Cui J, Ling X, Li X, Peng Y, Guo X, et al. Vitrification of mouse embryos at 2-cell, 4-cell and 8-cell stages by cryotop method. J Assist Reprod Genet. 2009;26(11-12):621-8.). Sin embargo, dicha opción limita la implementación de otras biotecnologías reproductivas. Técnicas como la microinyección pronuclear para la generación de animales transgénicos (2121. Kaneko T, Nakagawa Y. Genome editing of rodents by electroporation of CRISPR/Cas9 into frozen-warmed pronuclear-stage embryos. Cryobiology. 2020;92:231-4.-2323. Bagis H, Odaman H, Sagirkaya H, Dinnyes A. Production of transgenic mice from vitrified pronuclear-stage embryos. Mol Reprod Dev. 2002;61(2):173-9.), las técnicas de edición génica y la clonación somática (2424. Maemura M, Taketsuru H, Nakajima Y, Shao R, Kakihara A, Nogami J, et al. Totipotency of mouse zygotes extends to single blastomeres of embryos at the four-cell stage. Sci Rep. 2021;11(1):11167.), así como la obtención de células madres (2525. Markoulaki S, Meissner A, Jaenisch R. Somatic cell nuclear transfer and derivation of embryonic stem cells in the mouse. Methods. 2008;45(2):101-14., 2626. Sung LY, Chang CC, Amano T, Lin CJ, Amano M, Treaster SB, et al. Efficient derivation of embryonic stem cells from nuclear transfer and parthenogenetic embryos derived from cryopreserved oocytes. Cell Reprogram. 2010;12(2):203-11.), que requieren de estadios embrionarios tempranos para su implementación (2727. Montoliu L. Transgenesis and Genome Engineering: A Historical Review. Methods Mol Biol. 2023;2631:1-32.).
Por ello resulta de gran interés la vitrificación de embriones en estadios tempranos y crear reservas suficientes para usos posteriores. Desde el punto de vista práctico esta opción permitiría simplificar el número de pasos en un día de trabajo, también los operadores tendrían una mayor flexibilidad en los horarios para ejecutar las técnicas, y no menos importante, una reducción de animales por concepto de fallos experimentales. Sin dudas, el dominio de esta biotecnología incrementaría la efectividad de los técnicos de laboratorio y en consecuencia los resultados esperados serían superiores.
Teniendo en cuenta los elementos descritos, en el presente trabajo el primer objetivo fue demostrar la efectividad de la vitrificación de embriones en 4-células con el propósito de conservar el genofondo de cuatro líneas de ratones transgénicos; y el segundo objetivo, fue obtener crías transgénicas a partir de embriones pronucleares vitrificados y modificados genéticamente por lentitransgénesis.
Materiales y métodos
⌅Condiciones de manejo y alojamiento de los ratones
⌅Los ratones de las líneas transgénicos y no transgénicos fueron mantenidos bajos condiciones controladas (CENPALAB, La Habana, Cuba, 2007). Las hembras donantes de embriones se alojaron en cajas convencionales de polisulfonato PSU TIII (Modelo 1290D, Tecniplast) a razón de 10 hembras por caja (≈ 50 cm2/animal), y los machos individualmente en cajas TII (Modelo 1264C, Tecniplast). Como encamado se utilizó el bagazo de caña de azúcar desmeollado manualmente (AZCUBA, Cuba). Fueron alimentados con concentrado suministrado a voluntad (Formulación EAO1004, CENPALAB, Cuba) y agua tratada. Sin excepción, todos los materiales en contacto con los animales fueron esterilizados por autoclave (121 °C/20 min). Las salas de manejo poseen un ambiente controlado automáticamente, con una temperatura de 22 ± 2 °C, Humedad Relativa de 65% a 80% y un ciclo de 12 h luz.
Donantes de embriones
⌅Los embriones transgénicos en estadios 4-células fueron obtenidos del apareamiento de machos transgénicos homocigotos con hembras no transgénicas de la línea B6D2/F1Cenp, y como grupo control se utilizaron hembras y machos no transgénicas de la línea B6D2/F1Cenp. Fueron seleccionadas cuatro líneas transgénicas: i) Ataxia humana (SCA2) (2828. Aguiar J, Fernandez J, Aguilar A, Mendoza Y, Vazquez M, Suarez J, et al. Ubiquitous expression of human SCA2 gene under the regulation of the SCA2 self promoter cause specific Purkinje cell degeneration in transgenic mice. Neurosci Lett. 2006;392(3):202-6.), ii) Transferrina humana (2929. Perera Y, Cobas K, Garrido Y, Nazabal C, Brown E, Pajon R. Determination of human transferrin concentrations in mouse models of neisserial infection. J Immunol Methods. 2006;311(1-2):153-63.), iii) Receptor CD46 humano (Biomodelo no publicado) y iv) ratones transgénicos expresando el gen reportero PVF (Biomodelo no publicado). En el caso de los embriones pronucleares se obtuvieron de hembras y machos no transgénicos de la línea B6D2/F1Cenp. Las hembras donantes se escogieron con una edad entre 4 y 5 semanas de edad, vírgenes y un peso corporal entre 14 g y 16 g. Para la superovulación se aplicó una dosis inicial de 10 UI/i.p. de PSMG (Folligon®, Intervet, Viena, Austria), seguido de una segunda inyección a las 48 horas de 5 UI/i.p. de hCG (Chorulon®, Intervet, Viena, Austria) e inmediatamente fueron apareadas con los machos fértiles. A la mañana siguiente se determinó el tapón vaginal, y fueron sacrificadas (inhalación vapores de éter) según el estadio embrionario a colectar, a las 18 h ó 55 h post hCG en el caso de los embriones pronucleares y en 4-células, respectivamente. Los embriones fueron colectados por vía quirúrgica en ambos casos (3030. Riego E, Limonta J, Aguilar A, Perez A, de Armas R, Solano R, et al. Production of transgenic mice and rabbits that carry and express the human tissue plasminogen activator cDNA under the control of a bovine alpha S1 casein promoter. Theriogenology. 1993;39(5):1173-85.).
Cultivo in vitro de los embriones preimplantatorios de ratón
⌅El cultivo in vitro de los embriones se realizó por el sistema de microgotas (9 gotas/20 µL) en placas Petri (Ø 35 mm, Greiner bio-one) cubiertas con 2.5 mL de aceite mineral. Como medio de cultivo fue empleado el M-16 suplementado con 0.1 mM de EDTA, 1 mM de glutamina y 4 mg/mL de BSA. Una vez distribuidos los embriones en cada gota (n = 20) fueron cultivados a 37 °C en una mezcla de 5% de CO2 en aire y 100% de humedad relativa.
Método de vitrificación y desvitrificación para embriones en estadio de 4-células
⌅La solución de vitrificación (SV) consistió en una mezcla de 4,5 mol/L de DMSO y 0,25 mol/L de sucrosa disueltos en medio M-2 (1111. Shaw J.M., Diotallevi L., Trounson A.O. A simple rapid 4.5 M dimethyl-sulfoxide freezing technique for the cryopreservation of one-cell to blastocyst stage preimplantation mouse embryos. Reprod Fertil Dev. 1991;3(5):621-6.). Los embriones se depositaron en grupos de 10 a 20 en 1 mL de SV por 3 min, e inmediatamente fueron cargados en las pajuelas de congelación (Minitub, 0,25 mL) y sumergidos en el nitrógeno líquido (N2L). Para la desvitrificación, las pajuelas se extrajeron del N2L y se mantuvieron suspendidas en el aire 10 s, luego se introdujeron en un baño a 37 °C hasta su total descongelación. Seguido, el contenido de la pajuela se descargó en 1 mL de medio de descongelación (0,25 mol/L sucrosa) y se incubó en este por 15 min. Posteriormente, los embriones se lavaron tres veces en medio M-2, y se evaluó la integridad morfológica. El desarrollo in vivo se evaluó transfiriendo los embriones en hembras receptoras adultas de la línea B6D2/F1 (≥8 semanas de edad), con un peso corporal mayor de 25 g y con 0,5 días poscoito de seudogestación.
Método de vitrificación y desvitrificación para embriones pronucleares
⌅Se utilizaron dos soluciones de vitrificación, SV1 (2,68 mol/L etilenglicol, 0,6 mol/L DMSO) y SV2 (4,47 mol/L etilenglicol, 1,2 mol/L DMSO mol/L, 0,25 mol/L sucrosa), ambas soluciones fueron preparadas con medio M-2. Los embriones se vitrificaron en grupos de 20, primeramente, fueron incubados en la SV1 por 1 min; luego, incubados 30 s en la SV2 e inmediatamente, cargados en las pajuelas de congelación (Minitub, 0,25 mL) y sumergidos en el N2L. La desvitrificación se realizó en dos pasos, primero las pajuelas se extrajeron del N2L, se expusieron 5 s al aire y 10 s a 37 °C. Luego el contenido de la pajuela se descargó en 1 mL del primer medio de descongelación (0,25 mM sucrosa) y equilibró por 15 min. Se realizó un segundo lavado en medio con sucrosa al 0,125 mol/mL por 10 min. Finalmente, los embriones se lavaron tres veces en medio M-2 y se evaluó la viabilidad e integridad morfológica.
Producción del vector lentiviral (LvPVF) y microinyección de los embriones pronucleares en el espacio perivitelino
⌅Para la producción del vector lentiviral se utilizó el sistema de expresión comercializado por Invitrogen-Life Technologies (Cat. No. K49500-00) compuesto por la línea celular 293-FT y el sistema de vectores ViraPower™. Brevemente, las células 293-FT fueron sembradas a una densidad de 1,7 x 106 células/frasco de cultivo (25 cm2, Greiner-bione), a las 18 h de cultivo la monocapa de células se transfectaron con los vectores lentivilares y mantuvieron en cultivo de 16 a 20 h. A las 48 h posterior a transfección del lentivirus recombinante, éste fue cosechado del sobrenadante, ultra centrifugado y separado en alícuotas hasta su microinyección en los embriones (3131. Toledo JR, Prieto Y, Oramas N, Sanchez O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl Biochem Biotechnol. 2009;157(3):538-44.). La microinyección del vector lentiviral se realizó en el espacio perivitelino de los embriones pronucleares vitrificados o no vitrificados (grupo control). Para ello se utilizaron microagujas de cristal con puntas de 1-2 µm de diámetro de grosor. Las microagujas fueron previamente cargadas con la solución que contenía el vector lentiviral (3-5 µL), esta solución fue microinyectada en el espacio perivitelino a través de la zona pelúcida.
Técnica de transferencia de embriones por vía quirúrgica
⌅Las hembras receptoras fueron preanestesiadas con una combinación de diazepán/atropina (3:1, 100 µL/i.p./animal), luego se les administró una segunda inyección (20 µL/animal) de Ketamina (50 mg/mL/i.p.). Para acceder a la cavidad abdominal se realizó una incisión sobre la fosa del ijar izquierdo aproximadamente de 0,5 cm de largo, seccionando por plano de tejidos hasta llegar al interior de la cavidad. El ovario izquierdo junto con el oviducto y parte del cuerno uterino se extrajeron por el panículo adiposo. Identificado la entrada del infundíbulo y con la ayuda de pinzas de disección los embriones son depositados en la primera porción del infundíbulo. Finalizado este paso se reintrodujo el tracto reproductivo a la cavidad abdominal y la herida fue suturada por planos. Las hembras transferidas retornaron a su local de crianza y durante una semana se les aplicó tratamientos post operatorios y de analgesia.
Análisis estadísticos
⌅Para los análisis estadísticos fue utilizada la prueba de Chi-cuadradro (X2) con un nivel de significación de p<0,05, empleando el programa GraphPad Prism version 6.00 para Windows (GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com).
Resultados y discusión
⌅La vitrificación es la solidificación de una solución a bajas temperaturas sin la formación de micro-cristales de hielo dando la apariencia de un cristal transparente (1515. Shaw J.M., Jones G.M. Terminology associated with vitrification and other cryopreservation procedures for oocytes and embryos. Hum Reprod Update. 2003;9(6):583-605.), donde se alcanzan velocidades de congelación en un rango entre los 2000 a 20,000 ℃/min; velocidad, que dependerá en gran medida del volumen de crioprotectores donde son congeladas las muestras biológicas (3232. Zhao XM, Quan GB, Zhou GB, Hou YP, Zhu SE. Conventional freezing, straw, and open-pulled straw vitrification of mouse two pronuclear (2-PN) stage embryos. Anim Biotechnol. 2007;18(3):203-12.). Esta tecnología ha tenido un impacto transcendental en la protección de miles de líneas de ratones generadas alrededor del mundo (66. Takeo T., Nakao S., Nakagawa Y., Sztein J.M., Nakagata N. Cryopreservation of mouse resources. Lab Anim Res. 2020;36:33., 77. Shaw J.M., Nakagata N. Cryopreservation of transgenic mouse lines. Methods Mol Biol. 2002;180:207-28., 3333. Takeo T, Nakagata N. Cryobanking and Recovery of Genetically Modified Mice. Methods Mol Biol. 2020;2066:195-209.).
Para considerar un programa de conservación de genofondo o la producción de ratones transgénicos, es necesario obtener de forma regular suficientes embriones de alta calidad y en los estadios apropiados. En este trabajo, un alto porcentaje de las hembras respondieron al tratamiento superovulatorio, confirmándose el apareamiento del 76,9% (n = 40/52) y 76,0% (n = 95/125) en las donantes de embriones en estadios 4-células y pronucleares, respectivamente. Considerando las cuatro líneas transgénicas, se obtuvo promedio 13 embriones (4-células) por hembra superovulada (n = 526 embriones/40 donantes) y en el caso de los embriones pronucleares fueron producidos un promedio de 10 embriones /hembra superovulada (n = 1005 embriones/95 donantes).
En el momento prefijado para el sacrificio de las hembras donantes (18 h y 55 h post hCG), el 87,7% (n = 1005/1146) y 87,5% (n = 526/601) de los embriones se encontraban en los estadios pronucleares y 4-células, respectivamente. Los porcentajes de fragmentación, en el caso de los embriones obtenidos en los estadios pronucleares no superaron el 7,4% (n = 85/1146), y en los embriones en estadio de 4-células el 5,1% (n = 31/601).
La superovulación de ratones, mediante la administración de las gonadotropinas PMSG y hCG, es una vía simple y económicamente viable, que permite obtener suficientes embriones y óvulos de alta calidad a partir de un reducido grupo de hembras (3434. Behringer R, Gertsenstein M, Nagy KV, Nagy A. Administration of Gonadotropins for Superovulation in Mice. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(1).). Sin embargo, la respuesta superovulatoria puede variar por múltiples factores, situación que exige que cada laboratorio ajuste los protocolos a utilizar (3434. Behringer R, Gertsenstein M, Nagy KV, Nagy A. Administration of Gonadotropins for Superovulation in Mice. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(1)., 3535. Lamas S, Carvalheira J, Gartner F, Amorim I. C57BL/6J mouse superovulation: schedule and age optimization to increase oocyte yield and reduce animal use. Zygote. 2021;29(3):199-203.). En nuestras condiciones se observó que un alto porcentaje de las hembras superovuladas respondieron al tratamiento hormonal, y produjeron suficientes embriones por hembra. Si bien, la respuesta obtenida coincide con resultados de otros autores (3434. Behringer R, Gertsenstein M, Nagy KV, Nagy A. Administration of Gonadotropins for Superovulation in Mice. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(1)., 3636. Luo C, Zuniga J, Edison E, Palla S, Dong W, Parker-Thornburg J. Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2011;50(4):471-8.), es deseable obtener respuestas superovulatorias superiores (3737. Hasegawa A, Mochida K, Inoue H, Noda Y, Endo T, Watanabe G, et al. High-Yield Superovulation in Adult Mice by Anti-Inhibin Serum Treatment Combined with Estrous Cycle Synchronization. Biol Reprod. 2016;94(1):21.). Los resultados obtenidos sugieren que, en nuestras condiciones, sería necesario contar con un promedio de 30 a 50 hembras donantes, para obtener entre 300 y 500 embriones necesarios para proteger una línea de ratón.
Post descongelación de los embriones en 4-células se lograron altas tasas de recuperación (Figura 1A) con un valor de 88,6% en el grupo control vitrificado; y valores de un 90,4%, 91,3%, 98,4% y 98,9%, en los transgénicos de ataxia humana, transferrina humana, receptor CD46 humano y ratones transgénicos PVF, respectivamente. El porcentaje de embriones vivos post descongelación superó en todos los casos el 90% de eficiencia (Figura 1A), y se observaron valores de integridad de 72,5%, 77 %, 71,9%, 91,9% y 86,8% para el grupo control vitrificado, y los transgénicos de ataxia humana, transferrina humana, receptor CD46 humano y PVF, respectivamente. En ninguno de los criterios evaluados se observaron diferencias significativas.
Como principales daños mecánicos post vitrificación, se consideraron la ruptura de la zona pelúcida y la lisis de blastómeros. En el primer caso, los porcentajes de ruptura de la zona pelúcida difieren significativamente sólo en el grupo de ratones transgénicos PVF y el grupo control vitrificado, 8,2% vs 1,9%, respectivamente (p<0,0310). En el caso de las lisis de blastómeros, fue significativamente superiores en los grupos de transferrina humana, control vitrificado y ataxia humana en comparación con el grupo transgénico de PVF, de un 20,4% 17% 12,4% vs 1,6%, respectivamente (Figura 1B). Se conoce que la pérdida de blastómeros puede afectar la capacidad de desarrollo in vitro e in vivo de los embriones, sin embargo, los blastómeros de los embriones en 4-células tienen capacidad totipotente, y es posible obtener crías viables a partir de la transferencia de embriones con más de un 50% de blastómeros dañados (2424. Maemura M, Taketsuru H, Nakajima Y, Shao R, Kakihara A, Nogami J, et al. Totipotency of mouse zygotes extends to single blastomeres of embryos at the four-cell stage. Sci Rep. 2021;11(1):11167.).
En el caso del desarrollo in vivo, no se observaron diferencias significativas en los porcentajes de nacimientos de crías viables post transferencia entre los embriones vitrificados de las tres líneas transgénicas y el control vitrificado (Ataxia 49,5%, Transferrina 47%, Receptor CD46 24,4% y control vitrificado 38,3%, respectivamente) (Tabla 1). En nuestro caso fueron transferidos solamente embriones íntegros, lográndose altos porcentajes de nacimientos en todos los grupos estudiados. Además, se observa en todos los grupos una proporción de hembras y machos suficientes para iniciar un núcleo genético.
| Grupo | Embriones Transferidos | Hembras | Crías | Relación Hembras/Machos | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Transferidas | Gestación | Nacidas | Destetadas | |||
| Control Fresco | 120 | 8 | 6 (75%) | 50 (41,6%) | 40 (80%) | 0.90 |
| Control vitrificado | 146 | 16 | 10 (62,5%) | 56 (38,3%) | 48 (85,7%) | 1.52 |
| Ataxia Humana vitrificados | 95 | 7 | 7 (100%) | 47 (49,5%) | 41 (87,2%) | 1.15 |
| Transferrina Humana vitrificados | 100 | 7 | 6 (85,7%) | 47 (47%) | 14 (29,8%)† | 1.33 |
| Receptor CD46 vitrificados | 45 | 3 | 3 (100%) | 11 (24,4%) | 11 (100%) | 1.2 |
Control
Fresco (Embriones no transgénicos no vitrificados); Control Vitrificado
(Embriones no transgénicos vitrificados); † 33 muertes de crías por
canibalismo y muerte perinatal de madres nodrizas. Prueba de
Chi-cuadrado (p<0,05). † 33 deaths of pups due to cannibalism and perinatal death of nursing mothers. Chi-square test (p<0,05).
En el caso de la generación de crías transgénicas a partir de embriones pronucleares previamente vitrificados y microinyectados con el vector lentiviral, en la tabla 2 se observa que no hubo diferencias significativas en la supervivencia a la microinyección entre los grupos de embriones pronucleares vitrificados y no vitrificados (Control fresco), de 80,4% vs 71,6% (p<0,05), respectivamente. Sin embargo, post cultivo in vitro se observó un porcentaje significativamente mayor de embriones verdes fluorescentes en el grupo de embriones no vitrificados en comparación con los embriones vitrificados (44,7% vs 17,7%; p<0,003; Tabla 2).
Los embriones pronucleares son el estadio de preferencia para la introducción de fragmentos de ADN recombinante en ratones (3838. Pu XA, Young AP, Kubisch HM. Production of Transgenic Mice by Pronuclear Microinjection. Methods Mol Biol. 2019;1874:17-41.). La obtención de este estadio embrionario requiere de una coordinación precisa, y sólo se cuenta con un lapso de tiempo muy breve para la visualización y microinyección de los pronúcleos. En términos prácticos para ejecutar una sesión de microinyección de embriones pronucleares se requiere de embriones frescos obtenidos a partir de las hembras superovuladas y, además es necesario preparar las hembras nodrizas que recibirán los embriones modificados. Un fallo en la respuesta de las hembras superovuladas cancelaría la sesión de microinyección y la pérdida de las hembras nodrizas. En términos de tiempo significarían dos semanas de trabajo perdidos. Por ello, resulta de gran interés práctico contar con una fuente alternativa de embriones pronucleares previamente criopreservados, que garantice una disponibilidad rápida y confiable de este estadio en caso necesario (1111. Shaw J.M., Diotallevi L., Trounson A.O. A simple rapid 4.5 M dimethyl-sulfoxide freezing technique for the cryopreservation of one-cell to blastocyst stage preimplantation mouse embryos. Reprod Fertil Dev. 1991;3(5):621-6., 2222. Keskintepe L, Agca Y, Pacholczyk G.A., Machnicka A, Critser J.K. Use of cryopreserved pronuclear embryos for the production of transgenic mice. Biol Reprod. 2001;65(2):407-11.).
La eficiencia de transgénesis microinyectando vectores lentivirales en embriones pronucleares frescos de ratón es variable, con porcentajes que pueden oscilar en un mismo laboratorio, entre un 2,9% a 85,7% (3939. Cheng PH, Chang YF, Mao SH, Lin HL, Chen CM, Yang SH. Lentiviral transgenesis in mice via a simple method of viral concentration. Theriogenology. 2016;86(6):1427-35.) y de un 12,5% a 100% en la producción de crías transgénicas (4040. Lois C, Hong EJ, Pease S, Brown EJ, Baltimore D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 2002;295(5556):868-72.). En nuestro caso, no se observaron diferencias significativas el desarrollo in vivo en ninguno de los criterios evaluados (Tabla 3), lográndose un 25% de ratones transgénicos por crías nacidas (n=13/52), y un 4,9% de eficiencia general de transgénesis (n=13/266).
| Pronucleares | Réplicas | Microinyección Lentiviral | Cultivo in vitro | ||
|---|---|---|---|---|---|
| n | Supervivencia | N | Fluorescentes PVF | ||
| Vitrificados | 7 | 582 | 468 (80,4%) | 130 | 23 (17,7%)a |
| No vitrificados (Control fresco) | 14 | 1302 | 933 (71,6%) | 170 | 76 (44,7%)b |
Efecto del tratamiento: a,b p<0,001. Prueba de Chi-cuadradro. Effect of the treatment: a, b p<0,001. Chi-square test.
Es importante mencionar que fue necesario transferir más de 20 embriones vitrificados y microinyectados con el vector lentiviral por nodriza para conseguir gestaciones a término, ya que un número inferior de embriones transferidos no se lograron obtener gestaciones y por consiguiente crías (Resultados no publicados).
Hasta la fecha sólo se han generado ratones transgénicos por lentitransgénesis utilizando embriones frescos (4040. Lois C, Hong EJ, Pease S, Brown EJ, Baltimore D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 2002;295(5556):868-72.-4343. Koza P, Przybys J, Klejman A, Olech-Kochanczyk G, Konopka W. Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach. J Vis Exp. 2020(159).). En esta investigación se reporta, por primera vez, el nacimiento de ratones transgénicos generados por lentitransgénesis utilizando embriones pronucleares vitrificados (Foto 1). Por sus implicaciones prácticas consideramos estos resultados pueden servir de base para su aplicación en otras especies de mayor interés económico.
| Pronucleares | Total de embriones transferidos | Hembras transferidas | Promedio de embriones/ hembra | Hembras gestadas | Crías Nacidas Viables | Crías positivas fluorescentes PVF |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Vitrificados | 266 | 11 | 24 | 8 (72,2%) | 52 (19,5%) | 13/52 (25%) |
| No vitrificados (Control fresco) | 621 | 29 | 21 | 22 (75,9%) | 147 (23,6%) | 20/51† (39,2%) |
†Se evaluó la expresión de PVF en 51 crías del total nacidas. Prueba de Chi-cuadrado (p<0,05). †The expression of GFP was evaluated in 51 offspring out of the total born. Chi-square test (p<0,05).
Conclusión
⌅Los resultados obtenidos corroboran la efectividad de la vitrificación de embriones con fines de protección de genofondos y la generación de ratones modificados genéticamente por lentitransgénesis.