Introducción
⌅Las cabras lecheras juegan un papel crucial en la dieta de aproximadamente 6 mil millones de personas en países en desarrollo, mediante el aporte a la mitigación del hambre, sobre todo en infantes que se encuentran en condiciones críticas de desnutrición (11. FAO. (2020) Dairy Market Review - Overview of Global Dairy Market Developments in 2019. , 22. Prosser CG. Navigating Food Analysis: Practical Tips and Tricks from Sample Prep to LC. J. Food Sci. 2021; 86: 257-265. https://doi.org/10.1111/1750-3841.15574].). En las últimas dos décadas, la producción de leche de cabra y sus productos se incrementaron de manera constante, impulsada por una creciente conciencia de sus beneficios nutricionales ayudando a mejorar la salud humana, mediante la prevención de patologías de deficiencia como la anemia, hipoavitaminosis, deficiencia de minerales, con efectos antihipertensivos y ergogénicos y en casos de intolerancia a la lactosa, resulta ser un reemplazo a la leche de vaca (33. ALKaisy QH, Al-Saadi J, Al-Rikabi AK, Altemimi AB, Hesarinejad A, Abeledmaksoud TG. Exploring the health benefits and functional properties of goat milk proteins. Food Sci Nutr. 2023; 11(10): 5641-5656. doi: 10.1002/fsn3.3531. , 44. Mirzaei H, Chaleshtori RS. Role of fermented goat milk as a nutritional product to improve anemia, J Food Biochem. 2021; 46, e13969. https://doi.org/10.1111/jfbc.13969 ). La cría de cabras contribuye significativamente a las economías de las comunidades rurales en todo el mundo, especialmente en las naciones en desarrollo, gracias a la resistencia y adaptabilidad de las cabras a los ambientes hostiles (55. Ajmone-Marsan P, Colli L, Han JL, Achilli A, Lancioni H, Joost S, Crepaldi P, Pilla F, Stella A, Taberlet P, Boettcher P, Negrini R, Lenstra JA. The characterization of goat genetic diversity: Towards a genomic approach. Small Rumin Res. 2014; 121(1):58-72. doi:10.1016/j.smallrumres.2014.06.010. ). Estos animales robustos prosperan en entornos desafiantes, mediante la utilización de eficiente de recursos naturales de baja calidad que pueden no ser aptos para otras especies de ganado (66. Ginja C, Cortés O, Gama LT, Delgado JV, Amills M, De Sousa C, et al. (2018) Conservation of Goat Populations from Southwestern Europe Based on Molecular Diversity Criteria. In: Simões J, Gutiérrez C, eds. Sustainable Goat Production in Adverse Environments: Volume I. Springer, Cham pp 509-5335. doi:10.1038/ismej.2011.41., 77. Nguyen VD, Nguyen CO, Chau TML, Nguyen DQD, Han AT, Le TTH. Goat Production, Supply Chains, Challenges, and Opportunities for Development in Vietnam: A Review. Animals. 2023;13(15):2546. doi: 10.3390/ani13152546 ).
En Ecuador, la mayor población de cabras (62%) se concentra en la región del bosque seco en la parte sur del país. Sin embargo, la producción y calidad de la leche de cabra son vulnerables a la mastitis, causada principalmente por infecciones intramamarias (IIM) bacterianas (55. Ajmone-Marsan P, Colli L, Han JL, Achilli A, Lancioni H, Joost S, Crepaldi P, Pilla F, Stella A, Taberlet P, Boettcher P, Negrini R, Lenstra JA. The characterization of goat genetic diversity: Towards a genomic approach. Small Rumin Res. 2014; 121(1):58-72. doi:10.1016/j.smallrumres.2014.06.010. , 77. Nguyen VD, Nguyen CO, Chau TML, Nguyen DQD, Han AT, Le TTH. Goat Production, Supply Chains, Challenges, and Opportunities for Development in Vietnam: A Review. Animals. 2023;13(15):2546. doi: 10.3390/ani13152546 ). Las IIM se destacan como la enfermedad más significativa que afecta a los pequeños rumiantes, con pérdidas económicas sustanciales para la industria lechera mundial (88. Polveiro RC, Vidigal PM, Mendes TA, Yamatogi RS, Lima MC, Moreira MA. Effects of enrofloxacin treatment on the bacterial microbiota of milk from goats with persistent mastitis. Sci Rep. 2020; 10(1):4421. doi:10.1038/s41598-020-61407-2., 99. Oikonomou G, Bicalho ML, Meira E, Rossi RE, Foditch C, Machado VS, Teixeira AG, Santisteban C, Schukken YH, Bicalho RC. Microbiota of Cow’s Milk; Distinguishing Healthy, Sub-Clinically and Clinically Diseased Quarters. Guan LL, ed. PLoS ONE. 2014; 9(1): e85904. doi:10.1371/journal.pone.0085904., 1010. Azooz MF, El-Wakeel SA, Yousef HM. Financial and economic analyses of the impact of cattle mastitis on the profitability of Egyptian dairy farms. Vet World. 2020; 13(9):1750-1759. doi: 10.14202/vetworld.2020.1750-1759.).
La mastitis es una enfermedad costosa y multifactorial que impacta significativamente en el tejido de la ubre de los animales lecheros, que causa inflamación de la glándula mamaria, la cual resulta en una disminución de la calidad, cantidad y rendimiento de la leche. La mastitis provoca varios cambios en la composición de la leche, incluidas alteraciones físicas, químicas, patológicas y microbiológicas (1111. Podhorecká K, Borková M, Šulc M, Šulc M, Seydlová R, Hedvika Dragounová, H, Švejcarová M, Peroutková J, Elich O. Somatic Cell Count in Goat Milk: An Indirect Quality Indicator. Foods. 2021; 10(5), 1046; https://doi.org/10.3390/foods10051046., 1212. Menzies P. Udder Health for Dairy Goats. Veterinary Clinics: Food Animal Practice. 2021; 37:1, 149 - 174, 1313. Novac CS, Andrei S. The Impact of Mastitis on the Biochemical Parameters, Oxidative and Nitrosative Stress Markers in Goat’s Milk: A Review. Pathogens. 2020; 9(11):882. doi:10.3390/pathogens9110882.). Las células somáticas, particularmente los leucocitos y el tejido epitelial que se desprende en el parénquima, aumentan, lo que lleva a efectos perjudiciales de tal manera que, inclusive los conductos de leche pueden bloquearse temporal o permanentemente. Por otro lado, existe el riesgo de propagar enfermedades zoonóticas relacionadas con la leche (1010. Azooz MF, El-Wakeel SA, Yousef HM. Financial and economic analyses of the impact of cattle mastitis on the profitability of Egyptian dairy farms. Vet World. 2020; 13(9):1750-1759. doi: 10.14202/vetworld.2020.1750-1759.), debido a la presencia de patógenos, como es el caso de la brucelosis; lo que representa una amenaza para la salud pública (1313. Novac CS, Andrei S. The Impact of Mastitis on the Biochemical Parameters, Oxidative and Nitrosative Stress Markers in Goat’s Milk: A Review. Pathogens. 2020; 9(11):882. doi:10.3390/pathogens9110882.). Como resultado, la producción total de leche disminuye, lo que impacta negativamente en la economía de los productores (1212. Menzies P. Udder Health for Dairy Goats. Veterinary Clinics: Food Animal Practice. 2021; 37:1, 149 - 174, 1414. Rahimi H, Tukmechi A, Rashidian E. Genetic diversity of Brucella melitensis isolates from sheep and goat milk in Iran. Veterinary Research Forum. 2023; 14 (12): 649-657 doi: 10.30466/vrf.2023.1988859.3768 ,).
Las infecciones intramamarias (IIM) pueden atribuirse a varios patógenos bacterianos, con Staphylococcus spp. como el agente más comúnmente diagnosticado en cabras (1515. Contreras A, Sierra D, Sánchez A, Corrales JC, Marco JC, Paape MJ, Gonzalo C. Mastitis in small ruminants. Small Rumin Res. 2007; 68(1-2):145-153. doi:10.1016/j.smallrumres.2006.09.011., 1616. Polveiro RC, Vidigal PMP, De Oliveira Mendes TA, Yamatogi RS, Da SilvaLS, Fujikura JM, et al. Distinguishing the milk microbiota of healthy goats and goats diagnosed with subclinical mastitis, clinical mastitis, and gangrenous mastitis. Front Microbiol. 2022; 13:918706. doi:10.3389/fmicb.2022.918706.). La principal vía de transmisión de Staphylococcus aureus es a través de los procedimientos de ordeño, cuando ocurre el contacto directo entre las manos del ordeñador y las ubres del ganado lechero o cabras (1717. Deddefo A, Mamo G, Leta S, Amenu K. Prevalence and molecular characteristics of Sthaphylococcus aureus in raw milk and milk products in Ethiopia: a systematic review and meta-analisis. Int. J. Food Contam. 2022; 9:8 https://doi.org/10.1186/s40550-022-00094-5 ). Otros microorganismos, como: Streptococcus spp., Pseudomonas aeruginosa, Mannheimia haemolytica, Corynebacterium spp. y algunos hongos, son capaces de causar IIMs en ovejas y cabras; sin embargo, sus tasas de ocurrencia son relativamente bajas (1313. Novac CS, Andrei S. The Impact of Mastitis on the Biochemical Parameters, Oxidative and Nitrosative Stress Markers in Goat’s Milk: A Review. Pathogens. 2020; 9(11):882. doi:10.3390/pathogens9110882., 1616. Polveiro RC, Vidigal PMP, De Oliveira Mendes TA, Yamatogi RS, Da SilvaLS, Fujikura JM, et al. Distinguishing the milk microbiota of healthy goats and goats diagnosed with subclinical mastitis, clinical mastitis, and gangrenous mastitis. Front Microbiol. 2022; 13:918706. doi:10.3389/fmicb.2022.918706., 1818. Nagao PE, BurkovskiA, Mattos-Guaraldi AL. Editorial: Streptococcus spp. and Corynebacterium spp.: Clinical and Zoonotic Epidemiology, Virulence Potential, Antimicrobial Resistance, and Genomic Trends and Approaches. Front Microbiol. 2022; 28 (13):867210. doi: 10.3389/fmicb.2022.867210 ). Además, se ha observado una diversidad de géneros, incluidos: Acinetobacter, Agrobacterium, Alkalibacterium, Bacteroides, Bacillus, Enterobacter, Escherichia/Shigella, Fusobacterium, Klebsiella, Massilia, Micrococcus, Pseudomonas, Phyllobacterium, Rhodococcus, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Shewanella, Streptococcus y Yersinia (88. Polveiro RC, Vidigal PM, Mendes TA, Yamatogi RS, Lima MC, Moreira MA. Effects of enrofloxacin treatment on the bacterial microbiota of milk from goats with persistent mastitis. Sci Rep. 2020; 10(1):4421. doi:10.1038/s41598-020-61407-2., 1919. McInnisEA, Kalanetra KM, Mills DA, Maga EA. Analysis of raw goat milk microbiota: Impact of stage of lactation and lysozyme on microbial diversity. Food Microbiol. 2015; 46:121-131. doi:10.1016/j.fm.2014.07.021., 2020. Zhang F, Wang Z, Lei F, Wang Z, Jiang S, Peng Q, Zhang J, Shao Y. Bacterial diversity in goat milk from the Guanzhong area of China. J Dairy Sci. 2017; 100 (10):7812-7824. doi:10.3168/jds.2017-13244.).
Desafortunadamente, el conocimiento sobre la microbiota bacteriana asociada con la mastitis clínica en cabras sigue siendo limitado, especialmente en el contexto de infecciones intramamarias (IIMs), lo que impide una comprensión integral de los factores microbianos implicados en la patología en esta región. Hasta donde sabemos, no existen estudios en Ecuador que hayan reportado la diversidad de microorganismos en la leche de cabra con mastitis. Sin embargo, pocos estudios han caracterizado el microbioma en la leche de cabra, que incluye predominantemente a los filos bacterianos: Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes y Bacteroidetes (88. Polveiro RC, Vidigal PM, Mendes TA, Yamatogi RS, Lima MC, Moreira MA. Effects of enrofloxacin treatment on the bacterial microbiota of milk from goats with persistent mastitis. Sci Rep. 2020; 10(1):4421. doi:10.1038/s41598-020-61407-2., 1919. McInnisEA, Kalanetra KM, Mills DA, Maga EA. Analysis of raw goat milk microbiota: Impact of stage of lactation and lysozyme on microbial diversity. Food Microbiol. 2015; 46:121-131. doi:10.1016/j.fm.2014.07.021., 2020. Zhang F, Wang Z, Lei F, Wang Z, Jiang S, Peng Q, Zhang J, Shao Y. Bacterial diversity in goat milk from the Guanzhong area of China. J Dairy Sci. 2017; 100 (10):7812-7824. doi:10.3168/jds.2017-13244.). Entender la microbiología de las bacterias que causan mastitis clínica en cabras es fundamental para desarrollar estrategias de control, diagnóstico, tratamiento y prevención más efectivas. Para ello, se recomienda utilizar métodos moleculares como los estudios metagenómicos con un enfoque integral para revelar la composición microbiana completa de la leche de cabra, incluidas las bacterias asociadas con la mastitis y las bacterias que son parte de la flora normal de las ubres de cabra (2121. Ngara TR, Zhang H. Recent Advances in Function-Based Metagenomic Screening. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2018; 16 (6):405-415. doi:10.1016/j.gpb.2018.01.002., 2222. Ahmad T, Singh RS, Gupta G, Sharma A, Kaur B. Metagenomics in the Search for Industrial Enzymes. In: Advances in Enzyme Technology. Elsevier. 2019; 419-451. , 2323. Wright RJ, Gibson MI, Christie-Oleza JA. Understanding microbial community dynamics to improve optimal microbiome selection. Microbiome. 2019; 7(1):85. doi:10.1186/s40168-019-0702-x.).
El objetivo principal del estudio fue explorar la diversidad bacteriana de la leche de cabra mediante el análisis de muestras de cabras diagnosticadas con mastitis clínica. Se empleó la secuenciación del amplicón del ARNr 16S para detectar las poblaciones bacterianas asociadas con la mastitis clínica en las granjas de producción de leche caprina en Ecuador.
Materiales y métodos
⌅Aprobación ética
⌅En este estudio, se obtuvo el consentimiento informado de los propietarios de las cabras para recolectar muestras de leche tras el examen de las ubres. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por la Agencia de Regulación y Control Fito y Zoosanitario (AGROCALIDAD), bajo el permiso AGC/Z7/LOJA-2023-000528-EXT y la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad Técnica Particular de Loja. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los individuos.
Recolección de muestras
⌅Este trabajo se realizó con 39 muestras de leche de cabra de animales afectados por mastitis clínica, provenientes de 47 granjas en seis provincias del Ecuador (Imbabura, Carchi, Pichincha, Azuay, Loja y Santa Elena). En cada una de las granjas se realizó la identificación de los animales afectados de mastitis clínica mediante exámenes visuales y táctiles de las ubres (detección de asimetrías, enrojecimiento, cambios en la textura/presencia de nódulos) y, a continuación, por observación visual de los primeros chorros de leche obtenidos por ordeño manual con el objeto de identificar alteraciones en la misma como: presencia de coágulos, cambios en el color y consistencia, como material caseoso o purulento. En 12, 31, 3, y 1, granjas se identificaron 0, 1, 2 y ≥3 cabras con mastitis clínica, respectivamente. En cada explotación se tomaron muestras de leche de un máximo de dos animales, elegidos al azar de entre los afectados (2424. Win Epi (Working in epidemiology) 2024. [Citado Sept 29]. Disponible en: http://www.winepi.net/sp/index.htm , 2525. ESPAC (Instituto Ecuatoriano de Estadísticas y Censos) 2023 [Citado Sept 29]. Disponible en: https://www.ecuadorencifras.gob.ec/estadisticas-agropecuarias-2/ ).
Para la obtención de las muestras de leche, se limpiaron los pezones con hipoclorito de sodio, para mantener la integridad del ADN proveniente exclusivamente del conducto. Las mismas fueron recolectaron en botellas estériles de 250 mL (BRAND®), se refrigeraron por 4 horas y luego se congelaron a temperatura entre -15 °C y -25 °C. Posteriormente, las muestras de leche se enviaron al laboratorio BioSequence (Quito, Ecuador), donde se extrajo el ADN para ser amplificado y secuenciado mediante la técnica Illumina.
Análisis molecular
⌅El ADN total se aisló de 250 µL de muestras de leche utilizando el kit ZymoBIOMICS Magbead DNA, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se amplificaron las regiones genéticas 16S V3-V4 mediante PCR con los cebadores 341F (5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3') y 805R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') (2626. Herlemann, DP, Labrenz M, Jürgens K, Bertilsson S, Waniek JJ, Andersson AF. Transitions in bacterial communities along the 2000 km salinity gradient of the Baltic Sea. ISME J. 2011; 5(10):1571-1579. doi:10.1038/ismej.2011.41. ). Las condiciones para la PCR, extracción de ADN y secuenciación fueron determinadas por el laboratorio BioSequence. Los amplicones obtenidos se purificaron con perlas de purificación Illumina® y se secuenciaron como lecturas emparejadas de 300 pb en la plataforma Illumina MiSeq (Illumina Inc., San Diego, CA). Los archivos de secuencias crudas se depositaron en NCBI bajo el BioProject PRJNA1113707.
Análisis de secuencias y delimitación de zOTU
⌅Se evaluó la calidad de las lecturas de las secuencias crudas de 16S bacterianas utilizando el programa FastQC (versión 0.11.9) (2727. Andrés S. FastQC: A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. 2012. https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ ). Posteriormente, se realizó un recorte de las secuencias en el software Trimmomatic (versión 0.39) (2828. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014; 30 (15):2114-2120. doi:10.1093/bioinformatics/btu170.), seleccionando aquellas con una calidad mínima de Q25 o superior. Los datos de las secuencias recortadas se analizaron con el algoritmo UPARSE implementado en USEARCH Ver. 11.0.667 (2929. Edgar RC. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Methods. 2013; 10(10):996-998. , 3030. Edgar RC. Updating the 97% identity threshold for 16S ribosomal RNA OTUs. Valencia A, ed. Bioinformatics. 2018; 34(14):2371-2375. doi:10.1038/nmeth.2604.), según las indicaciones recomendadas disponibles en https://drive5.com/usearch/manual/ex_miseq.html. Las lecturas de extremos emparejados de cada muestra se ensamblaron en una sola secuencia y se filtraron para descartar las lecturas cuando los errores esperados fueran mayores de 0,5 (3131. Herrera P, Suárez JP, Sánchez-Rodríguez, A, Molina MC, Prieto M, Méndez M. Many broadly-shared mycobionts characterize mycorrhizal interactions of two coexisting epiphytic orchids in a high elevation tropical forest. Fungal Ecol. 2019; 39:26-36. doi:10.1016/j.funeco.2018.11.003. ). Durante el procesamiento de datos se descartaron secuencias únicas, duplicadas y quimeras. Las secuencias con 97% de homología se agruparon en unidades taxonómicas operativas de radio cero (zOTUs) (3232. Edgar RC. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. BioRxiv, 2016. doi:10.1093/bioinformatics/bty113.), que son equivalentes a variantes de secuencia (3333. Callahan BJ, McMurdie PJ, Rosen MJ, Han AW, Johnson AJA, Holmes SP. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon ta. Nat Methods. 2016; 13(7):581-583. doi:10.1038/nmeth.3869.). El algoritmo SINTAX (3232. Edgar RC. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. BioRxiv, 2016. doi:10.1093/bioinformatics/bty113.) con un corte de 0,9 se utilizó para predecir la taxonomía de las zOTUs observadas, comparado con la base de datos del conjunto de entrenamiento RDP v16. Solo se consideraron para análisis posteriores las zOTUs bacterianas con una precisión promedio de 1,0. Las zOTUs asignadas como origen de arqueas, cloroplastos o mitocondrias fueron eliminadas. Finalmente, las secuencias de zOTU se utilizaron para calcular la distribución de conteo de cada zOTU en cada muestra. Solo se consideraron para análisis estadísticos adicionales las zOTUs presentes en más de dos muestras.
Riqueza y diversidad de zOTUs bacterianas en la leche
⌅Se calculó una curva de acumulación basada en individuos y su asíntota para evaluar la riqueza potencial y la completitud del inventario de zOTUs bacterianas, mediante el programa EstimateS Ver. 9.1.0. La curva y sus intervalos de confianza del 95% se ajustaron a una curva de Clench (3434. SoberónM J, Llorente BJ. The Use of Species Accumulation Functions for the Prediction of Species Richness. Conserv Biol.1993; 7(3):480-488. doi:10.1046/j.1523-1739.1993.07030480.x.) en el programa Statistica Ver. 7.0.61.0. El esfuerzo de muestreo para registrar el 95% de la proporción estimada de las zOTUs se calculó de acuerdo a Jimenez Valverde (3535. Jiménez-ValverdeA, Horta J Las curvas de acumulación de especies y la necesidad de evaluar la calidad de los inventarios biológicos. Rev Ibérica Aracnol2003; 8:151-161.).
Resultados y discusión
⌅A partir de las 39 muestras analizadas, se obtuvieron un total de 1,255,275 secuencias para la delimitación de zOTUs. Se descartaron 80,120 singletons y 42 quimeras.
Se observaron un total de 550 zOTUs bacterianas en la leche de cabras con mastitis (Fig. 1). La curva de acumulación de zOTUs bacterianas en las muestras de leche fue asintótica e indicó una completitud del inventario del 52.44% (Fig. 1).
Los zOTUs observados pertenecieron a 12 filos, pero solo seis filos fueron los más ricos, donde Proteobacteria y Firmicutes presentaron la mayor riqueza con 254 y 103 zOTUs, respectivamente. Los seis filos restantes abarcaron a menos de 60 zOTUs (Fig. 2). Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes y Actinobacteria fueron los filos más abundantes en la mayoría de las muestras estudiadas (Fig.3).
En el filo Proteobacteria se encontraron 43 familias de bacterias, pero la familia más abundante fue Enterobacteriaceae con 43 zOTUs, seguida por Moraxellaceae, Hyphomicrobiaceae, Pseudomonadaceae, Sphingomonadaceae y Xanthomonadaceae, que tuvieron entre 12 y 22 zOTUs (Fig. 4). Las otras 37 familias de Proteobacteria presentaron menos de 10 zOTUs (Fig. 4). Dentro de estas familias, encontramos 95 géneros, con Pseudomona como el género dominante con 15 zOTUs.
En el filo Firmicutes, se detectaron 19 familias, siendo la familia Staphylococcaceae la más predominante con 23 zOTUs (Fig. 4). La familia de bacterias Flavobacteriaceae fue la más rica en zOTUs (21 zOTUs) entre las 12 familias del filo Bacteroidetes, y las familias Corynebacteriaceae y Micrococcaceae fueron las más ricas en el filo Actinobacteria con 10 zOTUs cada una (Fig. 4). Actinobacteria contenía 19 familias.
En el estudio se empleó la secuenciación del gen 16S rRNA y la delimitación de zOTUs para caracterizar la diversidad bacteriana asociada con la mastitis clínica en cabras. Hasta donde sabemos, esta investigación representa el primer estudio en Ecuador que explora las comunidades bacterianas presentes en cabras con mastitis clínica. Estos hallazgos revelaron una alta riqueza de zOTUs bacterianas, que incluyen algunos patógenos conocidos asociados con la mastitis clínica en varias especies de rumiantes, incluidas las cabras. La mastitis clínica en cabras representa una carga económica significativa para los productores en Ecuador, conduciendo a una reducción en la producción de leche, posible mastectomía, sacrificio de animales e incluso la muerte (1616. Polveiro RC, Vidigal PMP, De Oliveira Mendes TA, Yamatogi RS, Da SilvaLS, Fujikura JM, et al. Distinguishing the milk microbiota of healthy goats and goats diagnosed with subclinical mastitis, clinical mastitis, and gangrenous mastitis. Front Microbiol. 2022; 13:918706. doi:10.3389/fmicb.2022.918706., 3636. Anil,N.S, JanusA., Deepa, P.M. Shyma VH, RajasekharR., Habeeb BB. Anand LF. Clinicopathological findings and etiological characterization in caprine gangrenous mastitis. Small Rumin Res. 2024 241: 107389 https://doi.org/10.1016/j.smallrumres.2024.107389 , 3737. RibeiroMG, Lra GHB, Bicudo SD, Souza AVG, Salerno T, Siqueira AK, GeraldoJS. An unusual gangrenous goat mastitis caused by Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens and Escherichia coli co-infection. Arq Bras Med Veterinária E Zootec. 2007; 59(3):810-812. doi:10.1590/S0102-09352007000300037.).
Se observó una notable diversidad bacteriana en las muestras de leche provenientes de cabras con mastitis clínica, identificándose un total de 550 unidades operacionales taxonómicas (zOTUs). Estas zOTUs correspondieron a 12 filos bacterianos, siendo Proteobacteria, Firmicutes y Actinobacteria los filos predominantes en las muestras analizadas. Estas observaciones se alinean con investigaciones previas en otras regiones geográficas, donde se identificaron filos similares en la microbiota central en la leche de cabra, como Proteobacteria y Firmicutes, así como Bacterioidetes y Actinobacteria. Es importante destacar que los filos predominantes se asocian al estadío de la lactación, es así que Proteobacteria se ha encontrado como dominante al inicio de la lactación y Actinobacteria al final de la misma (1616. Polveiro RC, Vidigal PMP, De Oliveira Mendes TA, Yamatogi RS, Da SilvaLS, Fujikura JM, et al. Distinguishing the milk microbiota of healthy goats and goats diagnosed with subclinical mastitis, clinical mastitis, and gangrenous mastitis. Front Microbiol. 2022; 13:918706. doi:10.3389/fmicb.2022.918706., 2020. Zhang F, Wang Z, Lei F, Wang Z, Jiang S, Peng Q, Zhang J, Shao Y. Bacterial diversity in goat milk from the Guanzhong area of China. J Dairy Sci. 2017; 100 (10):7812-7824. doi:10.3168/jds.2017-13244., 3636. Anil,N.S, JanusA., Deepa, P.M. Shyma VH, RajasekharR., Habeeb BB. Anand LF. Clinicopathological findings and etiological characterization in caprine gangrenous mastitis. Small Rumin Res. 2024 241: 107389 https://doi.org/10.1016/j.smallrumres.2024.107389 ). La aplicación de la secuenciación de nueva generación (NGS) demostró ser altamente beneficiosa en este estudio, ya que permite la amplificación y detección de un amplio espectro de secuencias bacterianas por muestra. Esto facilita una caracterización más exhaustiva y robusta de la microbiota de la leche en comparación con los métodos tradicionales basados en cultivos. No obstante, ambos enfoques pueden complementarse entre sí, aprovechando las fortalezas de cada uno (3838. Niyazbekova Z, Yao XT, Liu MJ, Bold N, Tong JZ, Chang Jj, Wen Y, Li L, WangY, Chen DK, Ma WT. Compositional and functional comparison of the microbiota in the colostrum and mature Milk of dairy goats. Animals. 2020; 10(11): 1955 https://doi.org/10.3390/ani10111955 , 3939. Quigley L, O’Sullivan O, Stanton C, Beresford TP, Ross RP, Fitzgerald GF, Cotter PD. The complex microbiota of raw milk. FEMS Microbiol Rev. 2013; 37(5):664-698. doi:10.1111/1574-6976.12030., 4040. Breitenwieser F, Doll EV, Clavel T, Scherer S, Wenning M. Complementary Use of Cultivation and High-Throughput Amplicon Sequencing Reveals High Biodiversity Within Raw Milk Microbiota. Front Microbiol. 2020; 11:1557. doi:10.3389/fmicb.2020.01557.).
Al examinar los filos dominantes, se identificó una amplia variedad de familias bacterianas, las cuales abarcan: Enterobacteriaceae (Proteobacteria), Staphylococcaceae (Firmicutes), Flavobacteriaceae (Bacteroidetes), Corynebacteriaceae y Micrococcaceae (Actinobacteria). Notablemente, Pseudomonas emergió como el género dominante dentro de la comunidad bacteriana. Aunque este estudio se centró en la identificación a nivel de familia, nuestros hallazgos proporcionan una valiosa primera aproximación de los grupos bacterianos más representativos asociados con la mastitis clínica en la leche de cabra ecuatoriana. Estos hallazgos destacan la compleja composición bacteriana asociada con la mastitis clínica en cabras y complementan este conocimiento existente al establecer una comprensión básica de las comunidades bacterianas asociadas con la mastitis clínica en las cabras ecuatorianas.
Numerosos géneros dentro de las familias bacterianas identificadas han sido previamente asociados con la mastitis caprina en diversos estudios. En particular, Staphylococcus spp. (familia Staphylococcaceae) y Streptococcus spp. (familia Streptococcaceae) son comúnmente reportados como patógenos involucrados en diferentes tipos de mastitis, incluyendo las formas subclínicas, clínica y gangrenosa. (1616. Polveiro RC, Vidigal PMP, De Oliveira Mendes TA, Yamatogi RS, Da SilvaLS, Fujikura JM, et al. Distinguishing the milk microbiota of healthy goats and goats diagnosed with subclinical mastitis, clinical mastitis, and gangrenous mastitis. Front Microbiol. 2022; 13:918706. doi:10.3389/fmicb.2022.918706., 4141. Nelli A, Voidarou C, Venardou B, Fotou K, Tsinas A, Bonos E, Fthenakis GC, Skoufos I, Tzora A. Antimicrobial and Methicillin Resistance Pattern of Potential Mastitis-Inducing Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci Isolates from the Mammary Secretion of Dairy Goats. Biology. 2022; 11(11):1591. doi:10.3390/biology11111591.). De manera similar, Streptococcus y Escherichia coli (Enterobacteriaceae) se identifican como patógenos comunes responsables de la mastitis en cabras (4242. Jabbar A, Saleem MH, Iqbal MZ, Qasim M, Ashraf M, Tolba MM, et al. Epidemiology and antibiogram of common mastitis-causing bacteria in Beetal goats. Vet World. 2020; 13(12):2596-2607. doi:10.14202/vetworld.2020.2596-2607.). Además, Staphylococcus aureus y Staphylococcus agalactiae se han aislado en casos tanto de mastitis clínica como subclínica y a menudo presentan perfiles de resistencia a antibióticos bajos, con excepciones para antibióticos específicos como penicilina y tetraciclina (4343. Pereira CS, Santos LM, Machado LS, Melo DA, Coelho S, Pereira V, Souza M, Nascimiento E. Proteomics characterization of Staphylococcus spp. from goat mastitis and phenogeno-typical assessment of resistance to beta-lactamics. Pesqui Veterinária Bras. 2021; 41:e06129. doi:10.1590/1678-5150-pvb-6129. ). La presencia de estos patógenos conocidos de mastitis dentro de las familias identificadas requiere una investigación adicional para determinar su prevalencia e impacto potencial en la severidad de la mastitis en las cabras ecuatorianas.
Curiosamente, nuestros hallazgos sobre la composición bacteriana de la leche de cabras con mastitis clínica concuerdan con análisis metagenómicos previos de leche de cabras sanas. Estos estudios demuestran una microbiota central compartida tanto en el calostro como en la leche madura, con: Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria y Bacteroidetes como los filos predominantes (3838. Niyazbekova Z, Yao XT, Liu MJ, Bold N, Tong JZ, Chang Jj, Wen Y, Li L, WangY, Chen DK, Ma WT. Compositional and functional comparison of the microbiota in the colostrum and mature Milk of dairy goats. Animals. 2020; 10(11): 1955 https://doi.org/10.3390/ani10111955 ). Por lo tanto, dentro de esta alta diversidad de bacterias encontrada en nuestro estudio, ciertamente puede haber muchas bacterias que no son patógenas, o que son parte de la flora de la glándula mamaria de la cabra. Esta observación sugiere que las comunidades microbianas de la leche de cabra son relativamente estables, y que la presencia de mastitis clínica causa cambios en las abundancias relativas de taxones específicos dentro de los filos principales. Además, es esencial reconocer que la secuenciación del gen 16S rRNA captura la taxonomía microbiana y genera perfiles funcionales potenciales, pero no revela directamente las funciones reales de las comunidades microbianas presentes.
Aunque en este estudio se centró en caracterizar la diversidad bacteriana asociada con la mastitis clínica en cabras ecuatorianas, la influencia de diversos factores en esta composición, aún debe ser dilucidada. Investigaciones previas sugieren que la raza de cabra, las propiedades fisicoquímicas de la leche (pH, proteínas, grasas, contenido de aminoácidos), la ubicación geográfica y las prácticas de manejo pueden desempeñar un papel en la conformación de las comunidades bacterianas en la leche de cabra, de tal manera que aquellas granjas que manejan la leche cruda de manera artesanal tienen una microbiota en la leche diferente de aquellas granjas en las que se maneja la leche de manera más técnica (1616. Polveiro RC, Vidigal PMP, De Oliveira Mendes TA, Yamatogi RS, Da SilvaLS, Fujikura JM, et al. Distinguishing the milk microbiota of healthy goats and goats diagnosed with subclinical mastitis, clinical mastitis, and gangrenous mastitis. Front Microbiol. 2022; 13:918706. doi:10.3389/fmicb.2022.918706., 2020. Zhang F, Wang Z, Lei F, Wang Z, Jiang S, Peng Q, Zhang J, Shao Y. Bacterial diversity in goat milk from the Guanzhong area of China. J Dairy Sci. 2017; 100 (10):7812-7824. doi:10.3168/jds.2017-13244., 4343. Pereira CS, Santos LM, Machado LS, Melo DA, Coelho S, Pereira V, Souza M, Nascimiento E. Proteomics characterization of Staphylococcus spp. from goat mastitis and phenogeno-typical assessment of resistance to beta-lactamics. Pesqui Veterinária Bras. 2021; 41:e06129. doi:10.1590/1678-5150-pvb-6129. ). Por ejemplo, se han identificado variaciones específicas en la composición de la microbiota de la leche asociadas a la raza de las cabras. Estos estudios han demostrado que ciertas razas presentan una mayor abundancia de taxones bacterianos específicos, lo que sugiere que la raza influye significativamente en la diversidad y en el perfil bacteriano de la microbiota láctea (2020. Zhang F, Wang Z, Lei F, Wang Z, Jiang S, Peng Q, Zhang J, Shao Y. Bacterial diversity in goat milk from the Guanzhong area of China. J Dairy Sci. 2017; 100 (10):7812-7824. doi:10.3168/jds.2017-13244.). Además, la ubicación geográfica (por ejemplo, zonas áridas) y las prácticas de manejo empleadas en la crianza de cabras probablemente contribuyan a la diversidad de comunidades bacterianas (4444. Hoving-Bolink RA, Antonis AF, te Pas MFW, Schokker D. An observational study of the presence and variability of the microbiota composition of goat herd milk related to mainstream and artisanal farm management. PLOS ONE. 2023; 18(10): e0292650. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0292650., 4545. Tormo H, Delacroix-A, Lopez C, Lekhal DA, Roques C. Farm Management Practices and Diversity of the Dominant Bacterial Species in Raw Goat’s Milk. Int J Dairy Sci. 2010; 6(1):29-43. doi:10.3923/ijds.2011.29.43., 4646. Barraza A, Montes-Sánchez JJ, Caamal-Chan MG, Loera-Muro A. Characterization of microbial communities from rumen and large intestine of lactating creole goats grazing in arid plant communities. Microbiology. 2021;167(10). doi:10.1099/mic.0.001092.). Se justifican futuros estudios en la producción de cabras ecuatorianas para investigar las contribuciones específicas de estos factores a la diversidad bacteriana observada en nuestro estudio. Tales investigaciones proporcionarán valiosos conocimientos sobre la ecología de las bacterias asociadas con la mastitis en cabras ecuatorianas y allanarán el camino para desarrollar estrategias de prevención y control de mastitis más específicas.
Por otro lado, es importante mencionar ciertas limitaciones que requieren una investigación adicional. La curva de acumulación no saturada sugiere que el número total de especies bacterianas en las muestras de leche puede superar los 550 zOTUs identificados en este estudio. Esto destaca la necesidad de aumentar los esfuerzos de muestreo para capturar una representación más completa de la microbiota de la leche. Además, aunque este estudio se centró en caracterizar familias bacterianas, la investigación futura debería profundizar en la identificación de especies y géneros específicos, particularmente aquellos conocidos por estar asociados con la patogénesis de la mastitis. Esta información es crucial para comprender los mecanismos subyacentes al desarrollo de la mastitis en las cabras.
Aunque los métodos convencionales de cultivo han sido aplicados en estudios anteriores para aislar e identificar bacterias de la leche de cabra, sus limitaciones para identificar la diversidad completa de la microbiota de la leche son ampliamente reconocidas (4747. Neviani E, Bottari B, Lazzi C, Gatti M. New developments in the study of the microbiota of raw-milk, long-ripened cheeses by molecular methods: the case of Grana Padano and Parmigiano Reggiano. Front Microbiol. 2013; 4 (36): 1-14. doi:10.3389/fmicb.2013.00036., 4848. Yang Z, Ni L, Tian W, Chi H. Screening and Identification of Goat-Milk-Derived Lactic Acid Bacteria with Bacteriocin-like Activity and Probiotic Potentials. Microorganisms. 2023-, 11(4):849. doi:10.3390/microorganisms11040849., 4949. Toquet M, Gómez-Martín betaller E. Review of the bacterial composition of healthy milk, mastitis milk and colostrum in small ruminants. Research in Veterinary Science. 2021; 140 1-5 https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2021.07.022. ). Sin embargo, la disponibilidad de aislados bacterianos puede representar otro paso importante en la búsqueda de nuevos tratamientos específicos contra la mastitis. Enfoques alternativos, como la metagenómica y la metatranscriptómica, ofrecen una mayor sensibilidad y especificidad para caracterizar las comunidades microbianas en la leche de cabra. Continuar con la aplicación de estas técnicas avanzadas en estudios futuros proporcionará una comprensión más completa de los roles funcionales desempeñados por diferentes taxones bacterianos en el contexto de la mastitis.
Conclusiones
⌅En conclusión, este estudio proporciona una valiosa primera aproximación a la diversidad bacteriana asociada con la mastitis clínica en cabras ecuatorianas, con una alta riqueza y diversidad de bacterias. Estos hallazgos contribuyen al creciente cuerpo de conocimiento sobre la microbiota central de la leche de cabra y destacan la presencia de patógenos conocidos de mastitis. Se necesita más investigación para explorar los roles funcionales de los taxones bacterianos específicos y la influencia de diversos factores en la composición de la microbiota de la leche. Al abordar estas limitaciones, podemos obtener valiosos conocimientos que informarán el desarrollo de estrategias más efectivas para la prevención y control de la mastitis en la industria caprina ecuatoriana.