COMUNICACIÓN CORTA

Detección de Mollicutes en leche de tanques procedentes de la provincia Zamora-Chinchipe, Ecuador

Detection of Mollicutes in tank milk from Zamora-Chinchipe province, Ecuador

Natacha Ramírez-Sanmartín¹, Luis Rodrigo-Saa², María Irian Percedo³, Anisleidy Pérez-Castillo³, Evelyn Lobo-Rivero³*

¹Universidad Nacional de Loja (UNL), Ecuador.

²Universidad Técnica Particular de Loja (UTPL), Ecuador.

³Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado 10, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.

RESUMEN

Existen varias especies de Mollicutes que pueden producir mastitis. Entre estos agentes infecciosos se reconoce a Mycoplasma bovis, Mycoplasma canadense, Mycoplasma californicum, así como Mycoplasma alkalences, Mycoplasma bovirhinis y Mycoplasma bovigenitalium. El objetivo del presente estudio fue detectar la presencia de Mollicutes en leches de tanque procedentes de rebaños de la provincia Zamora-Chinchipe, Ecuador. Para la selección de los rebaños se realizó una zonificación, en bloques de 25 km², de acuerdo a sus condiciones ecológicas (conglomerados). El número de rebaños para el estudio se determinó mediante el programa EpiData, para 95 % de confianza y 5 % de error. El muestreo se realizó entre mayo de 2015 y diciembre de 2016; se eligieron de forma aleatoria, los conglomerados de cada cantón, en los cuales se realizó el muestreo. En los rebaños seleccionados se colectó una muestra de leche (10 mL en tubo estéril) de cada tanque colector. Las muestras se analizaron mediante PCR con cebadores que amplifican un fragmento de 270 pb del ARNr 16S correspondiente a la clase Mollicutes. Además, las muestras se analizaron mediante PCR con cebadores específicos para detectar la presencia de M. bovis. De los 143 rebaños investigados, el 25,87 % resultó positivo a Mollicutes (37/143 muestras). Sin embrago, las 37 muestras positivas a Mycoplasma spp. resultaron negativas a M. bovis. Los resultados sugieren la presencia de otras especies de Mollicutes en los rebaños.

Palabras clave: Mollicutes, Mycoplasma bovis, mastitis, PCR.

ABSTRACT

There are several Mollicutes species that can produce mastitis. These infectious agents include Mycoplasma bovis, Mycoplasma canadense, Mycoplasma californicum, as well as Mycoplasma alkalences, Mycoplasma bovirhinis and Mycoplasma bovigenitalium. The objective of the present study was to detect the presence of Mollicutes in tank milk from herds in the Zamora-Chinchipe province, Ecuador.  For the selection of the herds, a zoning was carried out in blocks of 25 km², according to their ecological conditions (conglomerates). The number of herds for the study was determined by the EpiData program, for a 95 % confidence and a 5 % error. Sampling was carried out between May 2015 and December 2016, and the clusters of each canton to which the sampling was made were randomly chosen. In the selected herds, a milk sample (10 ml in sterile tube) was collected from each collection tank. Samples were analyzed by PCR with 16S rRNA universal primers of the Mollicutes class. In addition, the samples were analyzed by PCR with specific primers to detect the presence of M. bovis. Of the 143 herds researched, 25.87 % tested positive to Mollicutes (37/143 samples). However, the 37 samples positive to Mycoplasma spp. were negative to M. bovis. The results suggest the presence of other Mollicutes species in the herds.

Key words: Mollicutes, Mycoplasma bovis, mastitis, PCR.

La mastitis es la principal enfermedad de la ganadería lechera a nivel mundial, debido a los efectos adversos que ocasiona sobre la producción y la calidad de la leche, los costos de tratamientos, las alteraciones en los procesos industriales y los daños a la salud del animal y del consumidor (1). En el caso del ganado bovino, se considera una enfermedad compleja, que ocurre producto a la interacción de varios factores: el sistema inmunitario de la vaca, el medio ambiente en que se encuentren los animales y la patogenicidad-virulencia del agente causal que intervenga en la infección de la glándula mamaria (2).

Entre las actividades a las que se dedican los agricultores de Ecuador está la crianza de ganado vacuno con fines de comercialización de leche y carne; sin embargo, uno de los problemas de esta crianza es la presentación de mastitis, que ocasiona la disminución de la calidad y cantidad de la leche y, con ello, sensibles pérdidas económicas para los productores (7). Tanto el gobierno como los ministerios y asociaciones del país muestran interés por aumentar la producción y la calidad de la leche, pero no se realizan investigaciones científicas avaladas para avanzar en su diagnóstico, prevención y control (8). En tal sentido, solo se dispone de algunos reportes de estudios que muestran datos de prevalencia e incidencia de mastitis bovina en Cayambe, provincia Pichincha y El Chaco, provincia Napo, en los años 2012 y 2013, respectivamente (9).

También se conoce que los productores aplican tratamientos con diversos antimicrobianos para el control de la mastitis, pero la enfermedad no deja de ser un serio problema económico en sus rebaños, por lo que se asume que los productos y/o esquemas que utilizan no son los apropiados para los patógenos circulantes, como es el caso de los micoplasmas (10). En tal sentido es importante señalar que estos agentes presentan una resistencia intrínseca a determinados antimicrobianos, debido a la carencia de pared celular; tal es el caso de las penicilinas, los betalactámicos, los glucopéptidos, las polimixinas, la rifampicina y las sulfonamidas (11). Esto presupone un problema al elegir el antibiótico adecuado para el tratamiento de la mastitis, por eso se recomienda, regularmente, segregar y/o eliminar del rebaño las vacas afectadas por estos agentes (12).

A partir de lo señalado anteriormente, el objetivo del presente estudio fue detectar Mollicutes en leches de tanque procedentes de rebaños de la provincia Zamora-Chinchipe, Ecuador.

Para la selección de los rebaños se realizó una zonificación en bloques de 25 km², de acuerdo con sus condiciones ecológicas (conglomerados), según la metodología descrita por Puglla (13). El número de rebaños para el estudio se determinó mediante el programa EpiData, para un 95 % de confianza y 5 % de error. El muestreo se realizó entre mayo de 2015 y diciembre de 2016 y se eligieron, de forma aleatoria, los conglomerados de cada cantón en los cuales se realizó el muestreo.

En los rebaños seleccionados se colectó una muestra de leche (10 mL en tubo estéril) de cada tanque recolector. Las muestras se identificaron y se colocaron en neveras con refrigerantes; posteriormente se trasladaron al Laboratorio de Sanidad Animal y Zoonosis, de la Universidad Técnica Particular de Loja. Durante este proceso se cumplió con las medidas de bioseguridad descritas por Acuña (10).

Para la extracción del ADN se siguió el protocolo descrito por Rosseti et al. (14). Se centrifugaron 10 mL de leche a 3000 rpm por 10 minutos y se decantó el sobrenadante.  Se tomaron 50 µL del sedimento acuoso y se adicionó a 200 µL de solución de lisis (0,1M Tris HCl, pH 8,5; 0,05 % Tween 20; 0,24 mg/mL de proteinasa K). Posteriormente, se incubó, en baño de agua, durante una hora a 60ºC, pasado ese tiempo se volvió a incubar, esta vez a 95ºC por 15 minutos. Las muestras de ADN se conservaron a -20^oC hasta su posterior uso. Se trasladaron a MYCOLAB (Laboratorio de Referencia de la OIE para el Diagnóstico de Micoplasmas), perteneciente al Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Cuba.

Se utilizó el sistema de PCR descrito por Van Kuppeveld et al. (15) y la Farmacopea Europea (16). Se empleó la pareja de cebadores (Tabla 1), que amplifica un fragmento de 270 pb del ARNr 16S de la clase Mollicutes (15,16).

La reacción de amplificación se realizó en un volumen final de 25 µL, que contenía 3 µL del ADN de la muestra clínica, 20 pmoL de cada cebador, 1X Green Master Mix (Promega). La reacción de PCR se desarrolló en un Termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient, según el programa de amplificación descrito por Van Kuppeveld et al. (15): 1 ciclo de desnaturalización inicial a 94°C por 5 minutos, seguido por 40 ciclos de desnaturalización a 94°C por 30 segundos, hibridación a 60°C por 30 segundos, extensión a 72°C por 30 segundos, y una extensión final de 72°C por 5 minutos.

Los productos se aplicaron en gel de agarosa al 2 % (v/v). Se utilizó un marcador de peso molecular de 100 pb (Promega, Madison, EE.UU.). El gel se tiñó con Bromuro de Etidio (0,5 μg/mL) durante 15 minutos y los resultados se visualizaron en un transiluminador de luz ultravioleta. El análisis estadístico de los resultados se realizó por el sistema de comparación de proporciones múltiples (17).

De los 143 rebaños investigados, en el 25.87 % se detectó la presencia de Mollicutes (37/143 muestras). La Figura 1 muestra el resultado del PCR para esta clase. Las muestras que resultaron positivas amplificaron un fragmento de 270 pb, el cual coincide con el obtenido por el control positivo y  lo descrito para este ensayo (15,16).

La manipulación del material genético para el diagnóstico, o caracterización de un patógeno, siempre requiere de la preparación de la muestra, de tal forma que permita la exposición, la extracción o la purificación del ADN (18). Existen métodos descritos, no solo para micoplasmas y ureaplasmas, sino también para otros microorganismos basados en pasos de extracción con fenol cloroformo, combinación de choque térmico y centrifugación (19); los más novedosos se presentan en formatos de estuches comerciales, que pueden o no necesitar de equipamiento semiautomatizado o automatizado, de los que se obtienen muestras de ADN de alta pureza (20).

En el caso de la metodología que se utilizó en este trabajo (combinación de una solución de lisis, proteinasa K y choque térmico), permitió la obtención de ADN de micoplasmas a partir de muestras de leche. Este resultado coincide con lo que refieren algunos autores (6,14) sobre la utilización de este método para la obtención de un ADN que permite su utilización en ensayos de PCR.  En tal sentido, las células de los micoplasmas, al carecer de pared celular presentan una membrana citoplasmática trilaminar, rica en esteroles; esto le confiere una gran sensibilidad a las variaciones de presión osmótica, que afectan la composición de su membrana celular e inducen a la célula a un choque osmótico, lo que hace que ocurra la ruptura y que el ADN quede expuesto (14).

Por otra parte, la utilización de este método también propicia la eliminación de posibles sustancias inhibidoras presentes en la leche, tal es el caso del calcio, proteasas, nucleasas y ácidos grasos, así como restos de hemoglobina que pueden interferir en la reacción de PCR (21,22).

Los valores de positividad encontrados en este trabajo son inferiores a los reportados por Hirose et al. (6), quienes alcanzan 70 % de muestras positivas a micoplasmas a partir de muestras de leche procedentes de vacas con mastitis; semejante a lo reportado por Justice-Allen et al. (23), pues señalan 83 % de muestras de leche de tanque positivas a micoplasmas por PCR. La variación del por ciento puede ser atribuida al nivel de infección de los rebaños y al periodo de excreción del microorganismo en el momento de la toma de muestra, lo cual coincide con lo informado por Biddle et al. (24) y Wilson et al. (25).

En la figura 2 se observan los resultados del diagnóstico de Mollicutes, por PCR, en las muestras trabajadas teniendo en cuenta su origen. Como se puede observar, en las procedentes de los cantones Chinchipe y Palanda no se detectaron micoplasmas. Este resultado puede deberse a la no presencia del agente en esta zona por su ubicación geográfica y a la no práctica de intercambio de ganado; de igual manera, las condiciones higiénicas sanitarias en estas producciones son más controladas. Resultados similares se reportan por Baird et al. (26), quienes refieren que una fuente común de infección es la compra de vacas afectadas subclínicamente por mastitis.

Por otra parte, la alta positividad encontrada en el cantón Yacuambi puede estar asociada a las condiciones higiénico-sanitarias y al manejo de los animales, pues se conoce que las medidas de bioseguridad en hatos afectados por micoplasmas son imprescindibles para el control de los mismos (27).

El manejo de las vacas enfermas y recién paridas contribuye a la diseminación del organismo. Estas no deben ser alojadas en los mismos corrales, ni ordeñadas con el mismo equipo y/o momento que las vacas enfermas, si no se tienen en cuenta las medidas de bioseguridad establecidas. La alimentación de los becerros con leche de desecho es otra fuente de transmisión, puede ocasionar neumonía, infecciones articulares e infecciones en los oídos (28).

Las 37 muestras positivas a Mycoplasma spp. resultaron negativas a M. bovis. Este resultado coincide con lo que reportan Andrade-Becerra et al. (29), quienes no detectaron M. bovis en muestras de leche en Colombia, en el Altiplano Boyacense. Resultados semejantes se describieron por Tamiozzoa et al. (30) al hallar solo Mycoplasma canadense y Mycoplasma californicum en muestras de leche de tanque; de igual manera, Hirose et al. (6) señalan 70 % de positividad para Mycoplasma bovirhinis en muestras de leche de tanque. Aunque se señala a M. bovis como la especie de micoplasmas más frecuente asociada a mastitis, en los últimos años se reportan otras especies como las mencionadas anteriormente, unidas a Mycoplasma alkalescens y Mycoplasma bovigenitalium, detectadas a partir de leche con mastitis (23).

Por tal motivo, se hace imprescindible continuar con la identificación de las especies de micoplasma presentes en las muestras que forman parte de este estudio.

REFERENCIAS

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Recibido: 9/6/2017

Aceptado:10/11/2017