La reproducción sexual constituye uno de los principales pilares en el éxito de la producción animal moderna. El máximo aprovechamiento del potencial genético y productivo de los individuos garantiza resultados superiores en este sentido. Para el desarrollo económico de nuestro país urge impulsar la producción animal por su importancia en la alimentación de la población (1).
El uso de las biotecnologías reproductivas coadyuva a un mejor desempeño de la capacidad reproductiva (2), por ejemplo: tratamientos hormonales para la sincronización estral y superovulación de las hembras de alto valor genético y económico, la transferencia de embriones por vía transcervical y la fertilización in vitro de óvulos obtenidos a partir de ovarios de hembras sacrificadas en matadero (3). Otras técnicas utilizadas para la multiplicación de individuos de alto valor genético son la bisección de embriones y la clonación somática. Para la conservación de los genofondos se emplean modernas técnicas de crioconservación de embriones y óvulos mediante el principio de congelación conocido como vitrificación (4). El objetivo de la presente investigación fue realizar un reporte detallado de la obtención de embriones bubalinos en condiciones tropicales utilizando ovarios de hembras faenadas.
Se emplearon 464 ovarios seleccionados por presencia de cuerpo lúteo y folículos visibles, de hembras bubalinas de 66±6 meses de edad y 475 ±25 kg de peso, faenadas en el matadero Valle del Perú que pertenecieron a la Empresa Pecuaria "El Cangre". En el laboratorio del Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología se extrajeron los complejos cúmulo-ovocito (CCO) mediante punción folicular (PF), con una aguja hipodérmica (18Gx1½, TERUMO), acoplada a una jeringuilla plástica de 10 mL (HSW, Germany), que contenía 1 mL de medio de cultivo 199 Hepes (SIGMA, M7528), más 10 % de Suero Fetal Bovino inactivado (SFBi, PAA) (2), a partir de folículos que se dividieron en menores de 3 mm, entre 3 y 5 y mayores de 5 mm. Los complejos cúmulo-ovocito (CCO) se localizaron bajo un estereoscopio con 4X de magnificación (Olympus) y su captura se realizó con capilares.
Todos los CCO se clasificaron por la escala de Gupta et al. (5) en calidad I, II-III, IV y desnudos o degenerados. Para la maduración se utilizó el medio TCM 199 bicarbonato (M4530) durante 24 h a 39ºC, en una atmósfera de 5 % de CO2. A las 24 horas de maduración in vitro (MIV) se observó la progresión meiótica con aceto-orceína al 1,1 % y la presencia del primer cuerpo polar en el microscopio de contraste de fase (Leyca), con un aumento de 40X.
Para la fertilización se utilizó una pastilla de semen procedente de búfalos seleccionados para sementales del Centro de Inseminación Artificial “Rosafé Signet”. Los espermatozoides se capacitaron mediante la técnica de Swim-up con el medio Talp-Esperm. Luego se fertilizaron de 25 a 35 ovocitos maduros por pozo en una placa de cuatro pozos con medio Talp-Fertil, con una concentración espermática de 4x106 spz/mL; como estimulante se añadieron 400 µL de penicilamina-hipotaurina-epinefrina (PHE) a una relación de 20:10:2 µM. El cocultivo se realizó durante 24 horas a 39ºC, a una atmósfera con 5 % de CO2 y 95 % de humedad relativa, sobre una capa de células del cúmulo en medio SOFaa.
Se dividió el proceso por etapas y se calculó el porcentaje en cada una; cada porcentaje se comparó con resultados obtenidos por Camarra et al. (6) y Drost (7) para determinar la eficacia.
Los resultados de la colección, a partir de 3271 folículos contabilizados, se dividieron en 53,01 % con diámetro menor de 3 mm, 28,23 % con diámetro medio (entre 3 y 5 mm) y 18,75 % con más de 5 mm, donde se ubicaron los folículos de DeGraaf, que se presentan en la especie entre 6,4 y 7,2 mm de diámetro (8). En la primera etapa del proceso, que es la recolección de ovocitos, se llegó hasta 3,93 CCO/ovario. Ohashi et al. (9) obtuvieron entre 0,73 y 2,2 CCO/ovario, por lo que se evalúa de buena. Posiblemente se deba a la capacidad reproductiva que tienen las hembras de ciclar todo el año, aunque Almaguer (10) observó una distribución estacional de los partos, atribuible a la temperatura ambiental, al fotoperiodo y a los aportes de alimentos, pero para la realización del ensayo in vitro este comportamiento garantizó una población folicular disponible estable todo el año. Los resultados concuerdan con Huang et al. (11), quienes reportaron que el número de ovocitos utilizables en búfalos es de 3,18 ± 2,89 por ovario.
Los ovocitos colectados fueron de calidad I (31,9 %), para los grupos de calidad II-III se alcanzó 43,78 %; en los grupos de calidad IV 15,95 % y 8,28 % para los desnudos y atrésicos (12). En cuanto a la calidad los CCO, Neglia et al. (13) plantean que se obtienen embriones de mejor calidad con CCO de calidad I, que con los de calidad II-III y IV para ser trasplantados y desarrollar un feto sano a término.
En la Figura 1 se puede observar el comportamiento de todo el proceso por etapas. Se muestra la cantidad de folículos que se contabilizan y la disminución del número de CCO inmaduros por pérdidas de los mismos en el proceso de aspiración.
Luego de la maduración, se procede a la fertilización con 4 x106 spz/mL, lo que arrojó un 38,79 % de clivaje; de los fertilizados totales se obtuvo el 17 % de blastocisto en medio SOFaa. Nandi et aI. (14) proponen una concentración espermática para la FIV en la especie de 4x106 spz/mL, aunque también se propone un estimulante de la motilidad espermática de 400 µL PHE, como se realizó en nuestro estudio. Totey et al. (15) lograron 40 % de efectividad con la combinación antes mencionada. Se atribuyen los resultados obtenidos a la baja motilidad de los espermatozoides bubalinos, que oscila entre 60 y 75 %. La misma está proporcionalmente relacionada con las características estacionarias del semental bubalino, que presenta en las condiciones de Cuba de 5 a 6 mL de volumen, 70 a 80 % de motilidad, 700 a 800 x 106 spz/mL y 70 a 80 spz vivos, con la presentación de los valores máximos entre los meses de septiembre a febrero (16).
En la Figura 2 se muestran los CCO en las diferentes etapas del proceso de FIV en Bubalus bubalis.
A partir de los resultados alcanzados se puede concluir que los ovarios de hembras bubalinas, enviadas a matadero, se pueden utilizar, de modo experimental, para la producción de embriones aplicando la metodología y los medios recomendados para la especie.