Desarrollo embrionario de bovino in vitro cocultivado con células oviductales y del cumulus oophorus

La principal limitación en la eficiencia de la producción de embriones de bovino in vitro es la maduración in vitro y el requerimiento de cocultivo para el desarrollo posterior a la fertilización, además de que no todos los ovocitos madurados son fecundados (1); aun cuando son fecundados, el desarrollo de blastocistos puede variar de 5 a 30 % (2,3). Los blastocistos producidos in vitro se consideran de menor calidad que los producidos in vivo (4); al ser de menor calidad se considera que el potencial de desarrollo disminuye (5).

Para el desarrollo in vitro de ovocitos de bovino se ha reportado que la temperatura más confortable es 38,5^oC, ya que permite obtener blastocistos de calidad (6), además del requerimiento de medios específicos en cocultivo, los cuales pueden proporcionar sustancias como las proteínas moduladoras presentes en el oviducto que se requieren para el inicio del desarrollo del embrión bovino (7). En ausencia de cocultivo puede darse el bloqueo del desarrollo temprano, aunque no implica la muerte inmediata del embrión, pero sí constituye una situación irreversible (8). En el caso del bovino, el bloqueo en el desarrollo ocurre en el paso del embrión de 8 a 16 células (9). El bloqueo no es un fenómeno pasivo, sino que requiere la participación activa de rutas de señalización que demandan la activación del genoma embrionario, el acompañamiento de células somáticas produce compuestos con actividad mitogénica para las células embrionarias que favorecen la diferenciación celular y la eliminación o degradación de algunas sustancias embriotóxicas (10). Kussano et al. (11) plantean que el desarrollo posterior a la fertilización in vitro (FIV) depende de factores, como la presencia de los genes glypican 4 (GPC4), los cuales están presentes en los ovocitos que forman embriones; de igual forma, Córdova et al. (12) reportan otros tipos de genes.

Para promover la competencia de desarrollo de ovocitos de bovino y la subsecuente calidad de los embriones, se han aplicado sustancias como la piridoxina que inhibe la actividad de la catepsina B (CTBS) durante la maduración in vitro (IVM) y el cultivo in vitro (IVC) (13). También se ha adicionado fluido oviductal de vesícula extracelular del istmo (14) y glucocorticoides (GCs), estos últimos benefician el desarrollo embrionario porque son importantes mediadores de eventos celulares clave, relacionados con la elevación de transcriptores embrionarios que participan en el metabolismo de los lípidos y glucosa, así como en la respuesta al estrés celular (15). Por otra parte, el microambiente del ovocito puede influir en el grado de muerte de células del embrión (16). Sin embargo, el método de cultivo in vitro de embriones es un medio usado para reducir el riesgo de la transmisión de enfermedades al realizar la transferencia a los animales receptores (17).

Hay otras causas que pueden afectar el desarrollo, como es el pipeteo por sí mismo o la relación de los componentes orgánicos de muchos cultivos de tejidos sobre los cuales se desarrollan los embriones (18), así como el tamaño del folículo mediano y grande, el cual tiene un efecto negativo en la competencia de desarrollo de los ovocitos de bovino in vitro cuando está presente un CL en el ovario (19).

Por consiguiente, el objetivo del presente trabajo fue determinar el efecto del cocultivo de los embriones con células oviductales y del cumulus oophorus sobre el porcentaje de embriones in vitro en estadio de blastocisto, de manera cuantitativa y cualitativa en el modelo bovino, usando el medio SOF secuencial.

Los medios de cultivo utilizados se prepararon con reactivos de grado cultivo celular de Sigma Chemical Co (St. Louis, Mo, USA) y diluidos en agua ultrapura Milli-Q. Los oviductos y ovarios se colectaron de hembras bovinas adultas sacrificadas en un rastro y se transportaron al laboratorio en solución salina al 0,9 % adicionada con antibiótico-antimicótico (penicilina G 10000 UI/mL, estreptomicina 10000 Ul/mL y anfotericina 24 Ul/mL) 1mL/L, a una temperatura de 30-35°C.

El cultivo de las monocapas se realizó una semana previa a la producción de los embriones in vitro. Los oviductos fueron lavados con PBS; posteriormente, haciendo una incisión se tomó un raspado de las células y se colocaron en TCM-199 suplementado con 20 % de SFB (Suero Fetal Bovino. Las células del cúmulo oophorus se colectaron del líquido folicular posterior a la colección de los complejos cúmulo-ovocito (COC’s), tomando para ello 100 µL del sedimento y colocándolas en TCM-199 suplementado con 20 % de SFB, cubierto con aceite mineral para su incubación dentro de un ambiente con 5 % de CO₂, 38,5°C y 90 % de humedad, con modificaciones del protocolo descrito por Goto et al. (20).

Los ovocitos se colectaron por aspiración de folículos de 2 a 7 mm de diámetro con medio TL-Hepes-PVA, a 38,5°C; posteriormente, se realizó la colección de los COC’s, solamente los ovocitos clase I y II fueron incluidos en la investigación. Una vez seleccionados los COC’s, se introdujeron en pozos de cultivo con 500 µL de TCM suplementado con 10 % (v/v) de SFB, 0,5 µg/mL de FSH y 0,5 µg/mL de LH cubiertos con aceite mineral; se cultivaron por 24 horas dentro de un ambiente con 5 % de CO₂, 38,5°C y 90 % de humedad (20).

Los ovocitos madurados se lavaron tres veces y se depositaron en 250 µL de TBM; se procedió a fertilizarlos con semen criopreservado, el cual se descongeló a 38,5°C y en 3 mL de TBM; posteriormente, se centrifugó y el pellet resultante fue resuspendido en 1 mL de TBM e incubado 1 hora (swim up), con el sobrenadante. Finalmente se adicionó una concentración de 1x10⁶ espermatozoides por mL; se coincubaron durante 18 horas. Los probables cigotos fueron removidos de la placa de fertilización y lavados tres veces en medio de fertilización, con el fin de desprender la mayor cantidad de espermatozoides y células de granulosa aún pegadas; luego se lavaron tres veces más con medio de desarrollo SOF (Synthetic Oviductual Fluid) para su cultivo final (14).

El desarrollo de los embriones se evaluó en medio SOF secuencial, el cual se cambió cada 48 horas por 50 % de medio fresco, para evitar la acumulación de sustancias embriotóxicas. Los ovocitos fertilizados fueron divididos aleatoriamente en tres tratamientos de cocultivo: 1) Cultivo control, los embriones se incubaron en microgotas de 100 µL de SOF, 2) Cultivo con células de cúmulo oophorus, los embriones se incubaron en microgotas de 100 µL sobre la monocapa de células granulosas con SOF; 3) Cultivo con células de oviducto, los embriones se incubaron en gotas de 500 µL sobre la monocapa de células oviductales con SOF.

Los embriones fueron evaluados cada 24 horas para observar y registrar su desarrollo, hasta las 192 horas. Al finalizar el periodo de cultivo se registró el número de mórulas y blastocistos, tomando las características citadas por Robertson y Nelson (21).

La viabilidad se evaluó al finalizar el periodo de incubación para el desarrollo embrionario in vitro; se tomaron al azar algunos de los embriones en estadio de mórula y blastocisto de los tres tratamientos y se procedió a someterlos a tinción con MTT. Para ello se lavaron tres veces con 100 µL de SOF y se colocaron en 300 µL de solución de MTT para finalmente colocarlos en incubación a 38,5°C, durante una hora. La viabilidad se determinó bajo el siguiente criterio: embriones teñidos de color púrpura en más del 85 % de su volumen fueron considerados viables, los embriones sin tinción se consideraron no viables (22).

El diseño experimental utilizado en la presente investigación se llevó a cabo en un sistema completamente aleatorio, dividido en bloques y tratamientos, por lo que los resultados fueron evaluados estadísticamente usando la prueba de independencia de chi-cuadrada y mediante la prueba de comparación múltiple de Duncan, para la cual se utilizaron los programas de estadística NCSS-2007, PASS 2005 y GESS 2006 (23), usando un nivel de significancia estadística de p<0,05.

Se cultivaron al azar 1,643 ovocitos en cada uno de los tres tratamientos: 1) Control: 538 ovocitos; 2) Cúmulo: 627 ovocitos; y 3) Oviducto: 478 ovocitos (Tabla 1). Del total de ovocitos cultivados, presentaron división 1,161 (71 %); el mayor porcentaje correspondió al cocultivo de células cúmulo.

El porcentaje de ovocitos divididos fue muy similar en los tres grupos, en tanto que el desarrollo embrionario en el grupo control presentó un mayor porcentaje 72 % (p<0,05) en el estadio de 2 a 8 blastómeros. El mayor porcentaje de mórulas y blastocistos se obtuvo en los grupos cocultivados con células cúmulo (34 %) y (14 %), respectivamente (p<0,05) (Tabla 1).

Los resultados de viabilidad, en el día ocho de cultivo de las mórulas y blastocistos, indican que todos los embriones que llegaron al estadio de blastocisto fueron viables (100 %); en tanto, solo el 3 % de las mórulas del grupo cocultivado con células del cúmulo fue viable (Tabla 2).

El embrión en condiciones in vivo ejerce importantes interacciones paracrinas locales con el epitelio materno, que promueven su desarrollo hasta la etapa de blastocisto y subsecuente implantación (24), en el cultivo in vitro no existe la comunicación materno-embrionaria, por consiguiente, el principal inconveniente es el mismo proceso de cultivo in vitro hasta el estadio de blastocisto, lo que sugiere que el cultivo de los embriones posfertilización es un periodo de importancia crítica en el proceso de producción de blastocistos (25). De la competencia de desarrollo del ovocito depende que los cigotos puedan desarrollar hasta blastocisto, pero también es importante el medio de cultivo seleccionado, porque de las condiciones de cultivo depende la cantidad y la calidad de los embriones obtenidos (26). El desarrollo embrionario en medio de cultivo in vitro SOF sin suero fetal bovino o BSA, usando varios factores de crecimiento, citoquinas y otras moléculas surfactantes con propiedades embriotróficas, como albúmina recombinante y ácido hialurónico, dio como resultado embriones con masa celular interna y número total de células, similar a los cultivados en medio SOF suplementado con albúmina (17).

La competencia de desarrollo del ovocito se adquiere durante la ovogénesis, durante esta se involucran diversos procesos moleculares como la activación o represión de genes, así como la síntesis y degradación de proteínas, los cuales brindan a los gametos femeninos su calidad para su desarrollo preimplantacional, implantación y gestación (27). Algunas sustancias han sido utilizadas para promover el desarrollo de los embriones de bovino, entre estas la glutatión (28), activador de plasminógeno (del tipo de urokinasa) (29) y vitamina C (30); esta última promueve la proliferación celular, disminuye los niveles de metilación de ADN en células donadoras y promueve la competencia de desarrollo en la transferencia nuclear de células somáticas bovinas a embriones.

En el presente estudio se confirma que el cocultivo con las células proporcionó algunos elementos que contribuyeron a evitar el bloqueo en el desarrollo, de tal forma que los embriones alcanzaron la etapa de blastocisto dentro del tiempo establecido por la IETS (International Embryo Transfer Society) para obtener blastocistos viables y de calidad, es decir, a los ocho días de cultivo (21). En el acompañamiento en cocultivo es posible que la estimulación de las células cúmulo por adenosina cíclica 3´5´-monofosfato (cAMP), durante la maduración in vitro (IVM), mejore el desarrollo de los embriones, debido a su participación en la regulación del metabolismo celular, esteroidogénesis y expansión del cúmulo como lo reportan Khan et al. (31).

El porcentaje de embriones en estadio de mórula está dentro de los valores reportados por otros autores, que va de 13 a 49 % (20,32), aun cuando los embriones cultivados traspasaron el estadio de 8 a 16 células (9). Existen factores que pueden modificar el desarrollo, como elevados ácidos grasos no esterificados (NEFAs) in vitro, que ejercen un efecto negativo en las células de epitelio oviductal bovino en su fisiología (33). Asimismo, el tamaño del folículo mediano y grande tiene un efecto negativo en la competencia de desarrollo de los ovocitos de bovino in vitro cuando está presente un CL en el ovario (19). La adición de micro ARN al medio de cultivo de embriones en estado de mórula resulta en una disminución de 27,3 % en el desarrollo al estado de blastocisto (34). Por otra parte, cuando se encuentra un bajo índice de fragmentación en espermatozoides corresponde con la baja reacción del embrión al estado de blastocisto (35).

Aunque el porcentaje de división en el grupo control fue del 72 %, no fueron capaces de impulsar su desarrollo hasta estadio de blastocisto, como aquellos cultivados con células somáticas, tal como lo indica Shirazi et al. (36); solamente los embriones sometidos a cocultivo lograron alcanzar en mayor proporción el estadio de mórula y blastocisto, tanto en cantidad como en calidad. El análisis de estos resultados sugiere que el cocultivo de los embriones con células somáticas contribuye a favorecer el ambiente, como lo reportan Orsi y Reischl (37). Se ha reportado que el medio de cultivo con monocapas de células de oviducto bovino (BOEC) aumenta la producción de blastocisto y, sobre todo, la calidad de los embriones resultantes (38). Asimismo, el incremento en el desarrollo de blastocistos está relacionado con los transcriptores embrionarios que participan en el metabolismo de la glucosa y de los lípidos, tanto como la respuesta celular al estrés (15).

Las células de cúmulo favorecieron la división de los embriones y permitieron obtener una tasa de blastocistos de 14 %; en tanto, con el cocultivo de oviducto tuvo 7 %, lo cual puede deberse al cambio estructural y funcional que sufren las células de granulosas al estar en cultivo in vitro, como lo describen Familiari et al. (39) y Shirazi y Moalemian (40), quienes observaron que estas células pueden llevar a cabo una diferenciación celular y producir estrógenos y progesterona, como la producida por las células luteínicas que contribuyen a la preparación del ambiente materno para la gestación. De manera similar observaron Ferguson et al. (41), al adicionar progesterona al medio de cultivo, con lo que contribuía a acelerar el desarrollo embrionario a estadio de blastocisto, además de producir embriones de mayor diámetro. Se ha descrito que la monocapa de las células oviductales tiene efectos benéficos al modular el medio y las condiciones ambientales que rodean al embrión, pues son capaces de disminuir los niveles de oxígeno, previniendo con ello el deterioro del embrión ocasionado por los radicales libres; además, remueve sustancias embriotóxicas como el amonio y disminuye los niveles de iones y glucosa, que pueden dañar al embrión (24). Cuando las células se enfrentan a un estrés no realizan su función adecuadamente y arrojan mayor cantidad de desechos que pueden resultar tóxicos para los embriones en desarrollo, lo que se ve reflejado en una disminución del desarrollo (2). Las células somáticas en los cocultivos pueden metabolizar la glucosa en lactato y piruvato, proporcionándoles con ello, el sustrato energético necesario durante el desarrollo temprano (42).

El cultivo de embriones de mamíferos en volúmenes reducidos de medio o en grupos incrementa significativamente el desarrollo de los blastocistos, el número de células y subsecuentemente la viabilidad después de su transferencia, debido a la producción de factores autocrinos/paracrinos derivados del embrión que estimulan el desarrollo. Un volumen muy grande resulta en la dilución de los factores haciéndolos poco efectivos (43).

Las células oviductales en cultivo no pierden su actividad embriotrófica; sin embargo, los diferentes métodos de cultivo pueden influenciar drásticamente en los atributos de las líneas celulares y el mantenimiento del contacto célula-célula y célula-monocapa puede ser interrumpida, fallando con ello la secreción de estradiol, lo cual altera la expresión del ARNm de oviductina; por tanto, debido a estos cambios no pueden mimetizar completamente el ambiente natural del oviducto bovino (44).

Los embriones cultivados en monocapa de células de cúmulo alcanzan un mayor porcentaje de blastocistos, lo cual sugiere que sus características embriotróficas pueden mantenerse en mayor medida, al brindar con ello un ambiente más favorable al embrión; contrario a las células de oviducto, las cuales sobrellevan mayores cambios estructurales y posiblemente funcionales que les impiden poder brindar un ambiente materno apropiado al embrión. Es importante impulsar la realización de más investigaciones que contribuyan a revelar de manera precisa el mecanismo mediante el cual los cocultivos benefician el desarrollo embrionario in vitro.