Artículo Original
 
Caracterización in vitro de propiedades probióticas de Lactobacillus ssp. aislados del tracto digestivo de abejas
In vitro characterization of probiotic properties of Lactobacillus ssp. isolated from the digestive tract of bees
 

iDJosé Antonio Rodríguez Díaz1Laboratorio de Referencia para Investigaciones y Salud Apícola (LARISA). Sancti Spíritus. Cuba.*✉:diagnostico@larisaulcsa.minag.gob.cu

iDJuan Emilio Hernández García2Departamento de Medicina Veterinaria. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad de Sancti Spíritus "José Martí Pérez". Cuba.

Laureano Sebastián Frizzo3Departamento de Salud Pública, Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional del Litoral. UNL-FCV. Argentina.

iDKen Jact Fernández León1Laboratorio de Referencia para Investigaciones y Salud Apícola (LARISA). Sancti Spíritus. Cuba.

iDLilian Sánchez4Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA). Mayabeque, Cuba.

iDYovanni Solenzal Valdivia1Laboratorio de Referencia para Investigaciones y Salud Apícola (LARISA). Sancti Spíritus. Cuba.

 

1Laboratorio de Referencia para Investigaciones y Salud Apícola (LARISA). Sancti Spíritus. Cuba.

2Departamento de Medicina Veterinaria. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad de Sancti Spíritus "José Martí Pérez". Cuba.

3Departamento de Salud Pública, Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional del Litoral. UNL-FCV. Argentina.

4Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA). Mayabeque, Cuba.

 

*Autor para la correspondencia: José Antonio Rodríguez Díaz. E-mail:diagnostico@larisaulcsa.minag.gob.cu

 

RESUMEN

El presente trabajo tuvo como objetivo caracterizar in vitro bacterias ácido lácticas (Fructobacillus fructosus SS66, Lactococcus garvieae SS79, Fructobacillus fructosus SS72, Lactobacillus kunkeei SS70, Lactobacillus rhamnosus SS73), aisladas del tracto digestivo de abejas Apis mellifera. Se evaluó su capacidad probiótica mediante pruebas enzimáticas, estabilidad de crecimiento a diferentes temperaturas (37 y 45°C) y a un rango de pH (3,5; 4,5; 5,5; 6,5), tolerancia a jugo gástrico artificial (JGA), sales biliares (0,3, 05 y 1 %); pruebas de adherencia como agregación, autoagregación e hidrofobicidad y antagonismo microbiano. Los resultados mostraron que todas las cepas crecieron a 37°C a pH ácido 6,5 y 5,5; no crecieron a pH 4,5, produjeron peróxido de hidrógeno y no revelaron actividad hemolítica. Las cepas soportaron el JGA pH 3 durante 3 h a 37°C y a las sales biliares hasta 1 %. Ninguna cepa mostró poder de autoagregación y solo dos (L. rhamnosus SS73 y L. kunkeei SS70) produjeron coagregación contra Escherichia coli. La hidrofobicidad fue variable entre las cepas, F. fructosus SS72 exhibió un valor alto, L. rhamnosus SS73 y L. kunkeei SS70 medio y L. garvieae SS79 y F. fructosus SS66 bajo. Todas las cepas presentaron amplio espectro de actividad antimicrobiana y efecto inhibitorio frente a Paenibacillus larvae y otros patógenos humanos y animales. Las cepas que mejor comportamiento mostraron corresponden a L. kunkeei SS70 y L rhamnosus SS73; fueron susceptibles a los agentes antimicrobianos utilizados con excepción de la Sulfonamida y Vancomicina y, a partir de estos resultados, se podrán incorporar en un inóculo probiótico para evaluar su efecto in vivo.

Palabras clave: 
probióticos; Apis mellifera; Lactobacillus ssp; microbiota en abejas; L. rhamnosus; L. kunkeei.
 
ABSTRACT

The present work aimed at characterizing in vitro the lactic acid bacteria Fructobacillus fructosus SS66, Lactococcus garvieae SS79, Fructobacillus fructosus SS72, Lactobacillus kunkeei SS70, Lactobacillus rhamnosus SS73, isolated from the digestive tract of bees Apis mellifera. Their probiotic capacity was evaluated by enzymatic tests, growth stability at different temperatures (37 and 45°C) at a range of pH (3.5; 4.5; 5.5; 5.5; 6.5), tolerance to artificial gastric juice (AGJ), bile salts (0.3, 05 and 1 %), and adhesion tests such as aggregation, self-aggregation and hydrophobicity and microbial antagonism. The results showed that all strains grew at 37°C at acidic pH 6.5 and 5.5 and did not grow at pH 4.5; they produced hydrogen peroxide and did not reveal hemolytic activity. The strains tolerated AGJ pH 3 for 3 h at 37 °C and bile salts up to 1%. No strain showed self-aggregation and only two (L. rhamnosus SS73 and L. kunkeei SS70) produced co-aggregation against Escherichia coli. Hydrophobicity was variable among the strains, F. fructosus SS72 exhibiting a high value, L. rhamnosus SS73 and L. kunkeei SS70 a medium value and L. garvieae SS79 and F. fructosus SS66 a low one. All strains showed a broad spectrum of antimicrobial activity and inhibitory effect against Paenibacillus larvae and other human and animal pathogens. The best-performing strains were L. kunkeei SS70 and L. rhamnosus SS73, which were susceptible to the antimicrobial agents used, with the exception of Sulfonamide and Vancomycin. From these results, they can be incorporated into a probiotic inoculum to evaluate their effect in vivo.

Key words: 
probiotics; Apis mellifera; Lactobacillus ssp; microbiota in bees; L. rhamnosus; L. kunkeei.
 
 
 
INTRODUCCIÓN

Son conocidas las consecuencias negativas de los residuos de antibióticos y químicos en los alimentos, por lo que constituyen una gran preocupación y amenaza para la salud humana en todo el planeta (11. Hudson JA, Frewer LJ, Jones G, Brereton PA, Whittingham MJ, Stewart G. The agri-food chain and antimicrobial resistance. Trends in Food Science and Technology. 2017.); una alternativa ante tal situación sería evitar el uso de antimicrobianos como promotores de crecimiento o profilácticos de rutina en los animales (22. Aidara-Kane A, Angulo FJ, Conly JM, Minato Y, Silbergeld EK, McEwen SA, et al. World Health Organization (WHO) guidelines on use of medically important antimicrobials in food-producing animals. Antimicrobial Resistance & Infection Control. 2018;7(1):7.) y, como estrategia, incluir prácticas mejoradas de manejo, uso de probióticos y otros productos naturales que aumenten la capacidad del sistema inmune y la salud de los animales (33. Gao P, Ma C, Sun Z, Wang L, Huang S, Su X, et al. Feed-additive probiotics accelerate yet antibiotics delay intestinal microbiota maturation in broiler chicken. Microbiome. 2017;5(1):91.) y, en especial, las abejas (44. Tonello NV. Caracterización de nuevos medicamentos no contaminantes para el tratamiento de enfermedades apícolas [Doctoral]. Argentina: Universidad Nacional de Rio Cuarto; 2019., 55. Bonilla-Rosso G, Engel P. Functional roles and metabolic niches in the honey bee gut microbiota. Current opinion in microbiology. 2018;43:69-76.).

Actualmente se acepta que las abejas tienen una microbiota intestinal específica, que se vuelve estable al llegar a la etapa adulta (66. Zheng H, Powell JE, Steele MI, Dietrich C, Moran NA. Honeybee gut microbiota promotes host weight gain via bacterial metabolism and hormonal signaling. PNAS. 2017;114(18):4775-80., 77. Kwong WK, Mancenido AL, Moran NA. Immune system stimulation by the native gut microbiota of honey bees. R Soc open sci. 2017;4:1-9.). El conocimiento sobre su composición y diversidad de funciones (88. Engel P, Moran NA. The gut microbiota of insects - diversity in structure and function. FEMS Microbiol Ecol. 2013;37:699-735.), así como el vínculo entre una microbiota intestinal equilibrada y el estado de salud del insecto, potencian el uso de cepas probióticas y otros aditivos naturales con tales fines (99. Budge GE, Adams I, Thwaites R, Pietravalle S, Drew GC, Hurst GDD, et al. Identifying bacterial predictors of honey bee health. Journal of Invertebrate Pathology. 2016:1-19., 1010. Engel P, Kwong WK, McFrederick Q, Anderson KE, Barribeau SM, Chandler JA, et al. The Bee Microbiome: Impact on bee health and model for evolution and ecology of host-microbe interactions. Mbioasmorg. 2016;7(2):1-9.); por consiguiente, aislar microorganismos propios del insecto favorece su utilización como probióticos, debido a que estos tienen un gran potencial de exclusión competitiva contra patógenos, ya que existe una mayor adaptación y afinidad por el mismo nicho ecológico (1111. Khalafalla GM, Sadik MW, Ali MAM, Mohamed RS. Novel potential probiotics from gut microbiota of honeybees (Apis mellifera) in clover feeding season in Egypt. Plant Archives. 2019;19(2):3381-3389.).

Los probióticos son definidos como "microorganismos que, administrados vivos y en cantidades adecuadas, confieren un beneficio a la salud del huésped" (1212. Hill C, Guarner F, Reid G, Gibson GR, Merenstein DJ, Pot B, et al. Expert consensus document: The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics consensus statement on the scope and appropriate use of the term probiotic. Nature reviews Gastroenterology & hepatology. 2014;11(8):506.). Sin embargo, en el campo de la nutrición y salud animal, especialmente para los animales de granja donde se incluyen las abejas, los probióticos pueden proteger al animal contra bacterias patógenas específicas o tener efectos beneficiosos sobre el rendimiento animal (1313. Markowiak P, Śliżewska K. The role of probiotics, prebiotics and synbiotics in animal nutrition. Gut pathogens. 2018;10(1):21.).

Los probióticos, que generalmente se utilizan, son bacterias acidolácticas y corresponden a los siguientes géneros: Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Enterococcus y especies de hongos anaerobios como Saccharomyces y Aspergillus (1414. Miranda-Yuquilema JE, Marin-Cárdenas A, Sánchez-Macías D, García-Hernández Y. Obtención, caracterización y evaluación de dos preparados candidatos a probióticos desarrollados con residuos agroindustriales. Revista MVZ Córdoba. 2018:6487-6499.); muchas de estas especies son habitantes importantes del tracto intestinal del hombre y los animales y son generalmente reconocidas como seguras (por sus siglas en inglés, GRAS, Generally recognized as safe) (1515. Yao W, Yang L, Shao Z, Xie L, Chen L. Identification of salt tolerance-related genes of Lactobacillus plantarum D31 and T9 strains by genomic analysis. Annals of Microbiology. 2020;70(1):1-14.).

El uso de probióticos está bien establecido desde hace décadas, tanto en humanos como en animales de producción, principalmente con el uso de bacterias lácticas y levaduras. La introducción al sector apícola en los últimos años se incrementó, y se reporta que potencian el sistema inmune, disminuyen el número de microorganismos patógenos y mejoran las tasas de crecimiento (1616. Alberoni D, Baffoni L, Gaggìa F, Ryan P, Murphy K, Ross P, et al. Impact of beneficial bacteria supplementation on the gut microbiota, colony development and productivity of Apis mellifera L. Beneficial microbes. 2018;9(2):269-278.).

Son varios los mecanismos de acción de los probióticos (1717. Khare A, Thorat G, Bhimte A, Yadav V. Mechanism of action of prebiotic and probiotic. immunity (Choct, 2009; Williams et al, 2001). 2018;3:27.), pero los efectos solo pueden ser atribuidos con especificidad a las cepas analizadas en cada estudio, y no se pueden generalizar a todas las especies ni a todo el grupo de cepas probióticas (1818. Sánchez L, Omura M, Lucas A, Pérez T, Llanes M, Ferreira C. Cepas de Lactobacillus spp. con capacidades probióticas aisladas del tracto intestinal de terneros neonatos. Rev Salud Anim. 2015;32(2):11.) y se deben seguir diferentes protocolos de seguridad (1919. Thakur N, Rokana N, Panwar H. Probiotics, Selection criteria, safety and role in health and. Journal of Innovative Biology January. 2016;3(1):259-270.). El hecho de que los efectos son específicos para cada cepa, implica que se deben registrar los resultados sanitarios apoyados en los estudios in vitro.

Estos microorganismos deben ser capaces de sobrevivir al paso por el tracto digestivo y para ello tienen que resistir la acción de los jugos gástricos y la bilis; además, tener capacidad de colonizar y proliferar en este medio (2020. FAO/WHO. WHO works group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food London. Ontario, Canada, April. 2002;30.). Desde esas perspectivas, se evaluaron diferentes bacterias ácido lácticas (BAL) y se incorporaron en el alimento de las abejas (2121. Audisio MC. Gram-Positive bacteria with probiotic potential for the Apis mellifera L. honey bee: The Experience in the Northwest of Argentina. Probiotics & Antimicro Prot. 2016:1-10., 2222. Daisley BA, Pitek AP, Chmiel JA, Al KF, Chernyshova AM, Faragalla KM, et al. Novel probiotic approach to counter Paenibacillus larvae infection in honey bees. The ISME journal. 2020 14(2):476-491.). Por lo que el objetivo del presente trabajo fue caracterizar mediante pruebas in vitro el potencial probiótico de cepas BAL del tracto digestivo de abejas Apis mellifera, previamente aisladas e identificadas.

MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismos

Se emplearon las siguientes cepas BAL (Fructobacillus fructosus SS66, Lactococcus garvieae SS79, Fructobacillus fructosus SS72, Lactobacillus kunkeei SS70, Lactobacillus rhamnosus SS73), aisladas previamente del tracto digestivo de abejas adultas (Apis mellifera) (2323. Hernández García JE, Rodríguez Díaz JA, Sebastián Frizzo L, Fernández León KJ, Solenzal Y, Paola Soto L, et al. Aislamiento e identificación de bacterias ácido lácticas del tracto digestivo de abejas adultas Apis mellifera. Rev Salud Anim. 2020;42(2):9.) y mantenidas en el cepario del Laboratorio de Referencia para Investigaciones y Salud Apícola (LARISA) y el Departamento de Medicina Veterinaria de la Universidad de Sancti Spíritus “José Martí Pérez”, provincia Sancti Spíritus, Cuba. Las cepas fueron sometidas a diferentes ensayos in vitro (2020. FAO/WHO. WHO works group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food London. Ontario, Canada, April. 2002;30.) para evaluar y seleccionar aquellas que pudieran ser las mejores candidatas para ser utilizadas como probióticas en la alimentación de las abejas. Los ensayos se describen a continuación.

Crecimiento a diferentes temperaturas

Se utilizaron tubos de ensayo de 15 mL de capacidad, con 9 mL del medio De Man, Rogosa and Sharpe (MRS), a pH 6,5 a los que se le inoculó un cultivo fresco de 16 h (10 % del volumen final) y se incubaron a diferentes temperaturas (37 y 45°C) durante 24 h, se observó el crecimiento mediante cambios de turbidez en el medio de cultivo. Se utilizaron los siguientes criterios: Ausencia de crecimiento (-); Crecimiento muy débil (+); Crecimiento débil (++); Crecimiento abundante (+++).

Cinética de crecimiento a diferentes pH

Se prepararon tubos Falcon TM de 20 mL de capacidad con 10 mL de medio caldo MRS; se ajustó el pH con ácido fosfórico a 6,5; 5,5; 4,5 y 3,5. La esterilización de los medios de cultivo se realizó en autoclave (VK-75-01, Rusia) a 121°C durante 15 min. El ensayo de la cinética de crecimiento se realizó en microplacas de 96 pocillos (Costar 3599, Corning, EUA). Para esto, se depositaron en cada pocillo 240 µL de los medios y 30 µL de inóculo de un cultivo de 18 h de cada cepa en estudio. El crecimiento microbiano se realizó a 37°C durante 24 h, bajo condiciones aeróbicas en incubadora (Binder, Alemania). Las lecturas de la absorbancia se realizaron cada 30 min a 630 nm mediante el Lector multimodal de microplacas Sinergy HT BioTEK (BioTEK Instrumentos-EUA). Los medios no inoculados se utilizaron como controles. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.

Hidrólisis de la caseína de la leche (proteólisis)

Para examinar la actividad proteolítica se siguió la metodología descrita por Harrigan (2424. Harrigan WF. Laboratory methods in food microbiology: Gulf professional publishing; 1998.), con algunas modificaciones. Se prepararon dos medios de cultivo: 1) agar leche descremada que consistió en leche en polvo descremada (Loba Chemie PVT.LTD, India) al 5 % y agar (Britania, Argentina) al 1,3 %; medio 2) agar-leche descremada al 2 % en agua de peptona y agar a una concentración de 1,3 %; ambos medios se ajustaron a pH 6,5; se esterilizaron por separado la leche y el medio peptonado, se dejaron enfriar a 60°C y luego se mezclaron y repartieron en placas Petri. Se prepararon placas con perforaciones de 6 mm de diámetro, que se rellenaron con 20 µL de los cultivos de las cepas BAL en estudio, y placas sin perforaciones que se sembraron por estrías. Se utilizó Staphylococcus aureus ATCC 25923 como control. Las placas se incubaron a 37°C durante 48 a 72 h. La presencia de un halo transparente alrededor de las colonias y en las perforaciones se consideró como reacción positiva de proteólisis de la caseína. El ensayo se realizó por triplicado y en dos momentos diferentes.

Producción de peróxido de hidrógeno (H2O2)

La capacidad de las cepas para producir H2O2 se determinó según la metodología descrita por McLean y Rosentein (2525. Mclean NW, Rosenstein IJ. Characterisation and selection of a Lactobacillus species to re-colonise the vagina of women with recurrent bacterial vaginosis. Journal of medical microbiology. 2000; 49(6):543-552.). Los cultivos bacterianos se sembraron en duplicado por estría sobre agar MRS suplementado con 2,5 mg/mL de Tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) y 0,01 mg/mL de Peroxidasa de rábano (HRP) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Las placas fueron incubadas a 37°C durante 48 h en condiciones de anaerobiosis. En presencia de H2O2, la enzima HRP oxida al TMB (incoloro) para dar lugar a la formación de un pigmento azul. La tonalidad de la coloración azul se consideró una medida semicuantitativa de la cantidad de H2O2 producido y liberado al medio por la cepa (1616. Alberoni D, Baffoni L, Gaggìa F, Ryan P, Murphy K, Ross P, et al. Impact of beneficial bacteria supplementation on the gut microbiota, colony development and productivity of Apis mellifera L. Beneficial microbes. 2018;9(2):269-278.). La intensidad de la coloración azul fue incluida dentro de una de las siguientes categorías: azul claro o azul oscuro y, por la rapidez en la aparición, en Rápido (+++), Intermedio (++), Lento (+) y Negativo (-).

Prueba de coagulación

La capacidad de coagulación de las cepas BAL se determinó según la metodología descrita por Hernández-García et al. (2626. Hernández-García JE, Sebastián-Frizzo L, Rodríguez-Fernández JC, Valdez-Paneca G, Virginia-Zbrun M, Calero-Herrera I. Evaluación in vitro del potencial probiótico de Lactobacillus acidophilus SS80 y Streptococcus thermophilus SS77. Rev Salud Anim. 2019;41(1).); se utilizó leche descremada en polvo (LDP) con una concentración final de sólidos de 12,5 % p/v. Posteriormente se dispensó en tubos de ensayos de 15 mL de capacidad, a razón de 9 mL, los cuales fueron esterilizados en vapor fluyente durante 20 min. Después de enfriar a 45°C, se le añadió 1 mL (10 % vol final) del inóculo inicial (crecido de 16-18 h en MRS, pH 6,5). Los tubos se incubaron a 37°C durante 12 h. La coagulación de la leche se consideró positiva cuando apareció la presencia de un coágulo adherido al fondo del tubo que no se desplazaba al invertir el mismo. Se utilizó Lactobacillus acidophilus como cepa indicadora (control positivo).

Actividad hemolítica

La actividad hemolítica de las cepas BAL se realizó sobre el medio Agar Columbia con 5 % de sangre de caballo (Biomérieux, Marcy l’Etoile, Francia), pH 6,5, según el método estándar con ligeras modificaciones descrito por Balamurugan et al. (2727. Balamurugan R, Chandragunasekaran AS, Chellappan G, Rajaram K, Ramamoorthi G, Ramakrishna BS. Probiotic potential of lactic acid bacteria present in homemade curd in southern India. The Indian journal of medical research. 2014;140(3):345.). La incubación se realizó a 37°C por 48 h en aerobiosis. Las cepas fueron evaluadas según la zona de hemólisis alrededor de la colonia, como positivas o negativas y de acuerdo al tipo de hemólisis: β-hemólisis, cuando apareció una zona clara de hemólisis alrededor de la colonia, α-hemólisis, una zona verde alrededor de la colonia y gamma (γ) si la zona alrededor de la colonia no era clara. Se utilizó como control positivo Staphylococcus aureus ATCC 25923.

Descarboxilación de aminoácidos

La actividad amino-descarboxilasa de las cepas BAL se realizó mediante un método cualitativo descrito por Mete et al. (2828. Mete A, Cosansu S, Demirkol O, Ayhan K. Amino acid decarboxylase activities and biogenic amine formation abilities of lactic acid bacteria isolated from shalgam. International Journal of Food Properties. 2017;20(1):171-178.), que consistió en un medio líquido base con la siguiente composición: Peptona de caseína 0,5 %, Extracto de levadura 0,3 %, D (+) Glucosa 0,1 %, Púrpura de bromocresol 0,0016 % (Mallinckrodt Baker, Inc, EUA). A 0,9 % del medio de cultivo base se le agregó 0,5 % del aminoácido a testar: L Arginina, L Histidina, L Lisina, L Tirosina y L Triptófano (Biopack, Argentina). Luego se ajustó el pH del medio a 6,7±0,1 a 25°C. Los tubos duplicados se inocularon con 10 µL de cultivo y se incubaron 72 h a 37°C. El color del medio al momento de la siembra era de color púrpura. El medio inicialmente pasa a amarillo al acidificarse y retorna a púrpura si la cepa descarboxila los aminoácidos; el pH del medio de cultivo aumenta. Prueba positiva: color del medio púrpura, la cepa es productora de aminas biógenas. Prueba negativa: color del medio amarillo, la cepa no produce aminas biógenas con el aminoácido probado.

Crecimiento en bilis

La tolerancia a sales biliares se llevó a cabo de acuerdo con la metodología utilizada por Uriot et al. (2929. Uriot O, Denis S, Junjua M, Roussel Y, Dary-Mourot A, Blanquet-Diot S. Streptococcus thermophilus: From yogurt starter to a new promising probiotic candidate? Journal of Functional Foods. 2017;37:74-89.), en microplacas de 96 pocillos. Las cepas se multiplicaron en caldo MRS en presencia de 0,3 %, 0,5 % y 1 % de bilis bovina (Britania, Argentina); se adicionaron 240 µL en cada pocillo y 30 µL del cultivo de 18 h de las cepas en estudio. Los cultivos se incubaron a 37°C durante 24 h y las lecturas de absorbancia se realizaron cada 30 min a 630 nm mediante el Lector multimodal de microplacas Sinergy HT BioTEK (BioTEK Instrumentos-EUA). Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.

Tolerancia a jugo gástrico artificial (JGA)

El ensayo de tolerancia al jugo gástrico se realizó con ajustes a la metodología descrita por Bao et al. (3030. Bao Y, Zhang Y, Zhang Y, Liu Y, Wang S, Dong X, et al. Screening of potential probiotic properties of Lactobacillus fermentum isolated from traditional dairy products. Food Control. 2010;21(5):695-701.). El JGA consistió en una solución de pepsina (Riedel-deHaën, Alemania) (0,35 % p/v) y NaCl (Emsure®, Dinamarca) (0,2 % p/v); una mitad (50 %) ajustada a pH 3 con ácido clorhídrico y la otra restante a pH 6,5. La esterilización se realizó por filtración (0,22 µM). Las suspensiones de JGA se inocularon a 1 % con cultivos de 18 h de cada una de las cepas BAL y mezclados durante 10 s. El JGA con pH 3 se incubó durante 3h a 37°C. Posteriormente se evaluó la cinética de crecimiento de cada cepa en microplacas de 96 pocillos. Para esto, se depositaron en cada pocillo 240 µL del medio MRS, pH 7 y transferido 30 µL de inóculo de JGA (JGA con pH 3 durante 3 h a 37°C) de cada cepa en estudio. El crecimiento microbiano se realizó a 37°C durante 24 h. Las lecturas de absorbancia se realizaron cada 30 min a 630 nm mediante el Lector multimodal de microplacas Sinergy HT BioTEK (BioTEK Instrumentos EUA). Todas las determinaciones se realizaron por triplicado. Se utilizaron como controles los medios no inoculados.

Prueba de agregación

Se realizó el ensayo de agregación de acuerdo a la técnica utilizada por Reniero et al. y Maldonado et al. (3131. Reniero R, Coocconcelli P, Bottazzi V, MorellI L. High frequency of conjugation in Lactobacillus mediated by an aggregation-promoting factor. Journal of General Microbiology 1992;138:763-768., 3232. Maldonado NC, Ficoseco CA, Mansilla FI, Melián C, Hébert EM, Vignolo GM, et al. Identification, characterization and selection of autochthonous lactic acid bacteria as probiotic for feedlot cattle. Livestock science. 2018;212:99-110.). Los cultivos, incubados 18 h a 37°C en MRS, se centrifugaron y se lavaron tres veces con agua destilada y se resuspendieron en el volumen inicial con una solución de Ringer- lactato y se llevaron a una DO de 0,7. Los sobrenadantes de cada una de las cepas se filtraron y se agregaron a la suspensión a una concentración final del 10 % (v/v). Posteriormente, se incubaron a temperatura ambiente. La agregación se considera positiva cuando las partículas visibles, similares a la arena y formadas por las células agregadas, se depositan en el fondo del tubo y dejan el sobrenadante limpio en un período máximo de 2 h a temperatura ambiente.

Coagregación con patógenos intestinales

El ensayo de coagregación se basó en métodos reportados por Maldonado et al. y Reid (3232. Maldonado NC, Ficoseco CA, Mansilla FI, Melián C, Hébert EM, Vignolo GM, et al. Identification, characterization and selection of autochthonous lactic acid bacteria as probiotic for feedlot cattle. Livestock science. 2018;212:99-110., 3333. Reid G, Bruce AW. Probiotics to prevent urinary tract infections: the rationale and evidence. World journal of urology. 2006;24(1):28-32.). Las suspensiones de microorganismos ajustaron a una densidad óptica de 0,7 en PBS. Una alícuota de 500 µL de los cultivos de las cepas seleccionadas de Lactobacillus ssp. se centrifugaron, filtraron y mezclaron con la 500 µL de Escherichia coli y Salmonella entérica serotipo Dublin; las suspensiones se incubaron por 2 h a temperatura ambiente. Las suspensiones se observaron macroscópicamente y bajo microscopio óptico (con un lente de 100 X). La prueba se consideró positiva cuando se hizo visible la sedimentación de las células sobre el fondo del tubo en un periodo máximo de 2 h a temperatura ambiente. Se desarrollaron controles con suspensiones en PBS de las BAL y los patógenos utilizados.

Hidrofobicidad de la superficie celular

Para evaluar la hidrofobicidad en la superficie bacteriana, se realizó un ensayo según las indicaciones reportados por Frizzo et al. (3434. Frizzo LS, Soto LP, Bertozz I, Sequeira G, Marti LE, Rosmini MR. Evaluación in vitro de las capacidades probióticas microbianas orientadas al diseño de inóculos probióticos multiespecie para ser utilizados en la crianza de terneros. Revista FAVE-Ciencias Veterinarias. 2006;5.), para determinar, a través de porcentajes de hidrofobicidad, la tendencia a la adhesión epitelial (mayor porcentaje de hidrofobicidad, mayor adherencia). Cada una de estas cepas crecidas de cultivo fresco en caldo MRS a 37°C se lavaron con solución tampón fosfato salino (PBS), se ajustaron a una densidad óptica de 0,6-0,7 a 560 nm (DO560nm) y se mezclaron con la misma cantidad de n-hexadecano a temperatura ambiente. Después de un tiempo de separación de 60 min, se midió la DO560nm de la fase acuosa. El porcentaje de hidrofobicidad se calculó mediante la siguiente ecuación:

 
% de Hidrofobicidad=DO560nm  antes de mezclar-DO560nm  después de mezclarDO560nm  antes de mezclar×100  
 

La actividad de hidrofobicidad de las cepas evaluadas se clasificó como alta (51-100 %), media (30-50 %) y baja (0-29 %), según lo propuesto por Nader-Macías et al. (3535. Nader-Macías MEF, Otero MC, Espeche MC, Maldonado NC. Advances in the design of probiotic products for the prevention of major diseases in dairy cattle. Journal of industrial microbiology and biotechnology. 2008;35(11):1387-1395.).

Prueba de Antagonismo microbiano frente a patógenos

La capacidad de las BAL evaluadas para inhibir el crecimiento de determinados microorganismos patógenos se valoró mediante el método denominado "mota en césped" (3636. Kajal A, Ankur G, Jagriti S. Isolation and identification of Lactobacilli bacteria from raw cow milk in local region of Agra. Int J Adv Res Biol Sci. 2017;4(11):98-102., 3737. Fleming H, Etchells J, Costilow R. Microbial inhibition by an isolate of Pediococcus from cucumber brines. Applied Microbiology. 1975;30(6):1040-1042.). Se emplearon como indicadoras las siguientes cepas patógenas del cepario de Laboratorio de Alimentos del Departamento de Salud Pública, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Litoral, Argentina: Salmonella enterica serotipo Dublin 595, Listeria monocytogenes, Escherichia coli 289, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus; y también se enfrentaron a uno de los patógenos más importantes de las abejas, Paenibacillus larvae, del cepario del Laboratorio de Referencia para Investigaciones y Salud Apícola (LARISA), Sancti Spíritus, Cuba.

Las cepas BAL se multiplicaron en caldo MRS por 18 a 24 h a 37°C. Transcurrido este tiempo, se transfirieron 10 µL del cultivo de cada cepa a tres pocillos en una placa de agar MRS. Las placas fueron dispuestas bajo flujo laminar durante 30 min para permitir la absorción del cultivo y posteriormente se incubaron a 37°C durante 24 h en jarra de anaerobiosis. Simultáneamente, se prepararon los cultivos de cada uno de los microorganismos indicadores, inoculando 3-4 colonias en 50 mL de caldo BHI (por sus siglas en inglés, Brain Heart Infusion, Merck, EUA) e incubados 12 a 16 h.

Al completarse el tiempo de incubación, se observaron las motas de BAL en la superficie de las placas, se vertieron 7 mL de agar BHI semisólido al 0,7 %, atemperado a 40°C sobre las placas de MRS y suplementado a 1 % con el cultivo líquido de cada uno de los microorganismos indicadores. Las placas se incubaron a 37°C durante 24 h en condiciones de aerobiosis. En las placas se observaron la presencia o ausencia de zonas de inhibición de crecimiento bacteriano. La inhibición se evaluó por medición del diámetro (mm) de la zona clara alrededor de las colonias de las cepas patógenas, con una regla graduada (3838. Iorizzo M, Testa B, Lombardi SJ, Ganassi S, Ianiro MFL, et al. Antimicrobial activity against Paenibacillus larvae and functional properties of Lactiplantibacillus plantarum strains: Potential benefits for honeybee health. Antibiotics. 2020;9(442):2-18.).

Susceptibilidad a agentes antimicrobianos de las cepas seleccionadas

A las cepas de Lactobacillus ssp. con mejores resultados en los ensayos in vitro se les realizó el ensayo de susceptibilidad antimicrobiana; para ello se utilizó el método modificado de difusión en disco impregnado y se sustituyó el agar Müeller Hilton por agar MRS, descrito por Schillinger y Lucke (3939. Schillinger U. Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat. Applied and environmental microbiology. 1989;55(8):1901-1906.). Los antimicrobianos probados fueron: ceftriaxona (30 μg), ciprofloxacina (5 μg), eritromicina (15 μg), gentamicina (10 μg), meropenem (10 μg), oxacilina (1 μg), penicilina G (10 μg), sulfonamidas (300 μg), vancomicina (30 μg), amikacina (30 μg), amoxicilina (10 μg), ampicilina (10 μg), cefalexina (30 μg), cefalotina (30 μg) y clorafenicol (30 μg) (Sensidisc DME®, Sao Paulo, Brasil). Como control se utilizó una cepa de Staphylococcus aureus (ATCC 25923). Una alícuota de 0,1- 0,2 mL de cada cepa, correspondiente a una concentración celular de 108 -109 UFC/mL, se distribuyó en placas Petri que contenían agar MRS para Lactobacillus ssp. y, en BHI para la cepa utilizada como control, Staphylococcus aureus. Para ello se empleó la técnica de esparcimiento superficial del inóculo y después se colocaron los discos de antibióticos en la superficie. Se incubaron por 48 h bajo condiciones de anaerobiosis y se midieron los halos de inhibición. Los aislados fueron clasificados para cada uno de los antibióticos como sensibles (S), moderadamente sensible (MS) y resistentes (R), de acuerdo con Charteris et al. (4040. Charteris WP, Kelly PM, Morelli L, Collins JK. Antibiotic susceptibility of potentially probiotic Lactobacillus species. Journal of Food Protection. 1998;6(12):1636-1643.).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Crecimiento a diferentes temperaturas

Las cepas evaluadas fueron capaces de crecer a 37°C, con crecimiento abundante Fructobacillus fructosus SS72, Lactobacillus rhamnosus SS73 y Lactococcus garvieae SS79; mientras que, a 45°C, únicamente mostraron crecimiento abundante Fructobacillus fructosus SS72 y Lactobacillus rhamnosus SS73 (Tabla 1). Estos resultados son similares a los encontrados por Sánchez et al. (1818. Sánchez L, Omura M, Lucas A, Pérez T, Llanes M, Ferreira C. Cepas de Lactobacillus spp. con capacidades probióticas aisladas del tracto intestinal de terneros neonatos. Rev Salud Anim. 2015;32(2):11.) en su estudio, donde crecieron 17 cepas del género Lactobacillus ssp. a diferentes temperaturas (30, 37 y 45°C), pero los mayores rendimientos de células viables (9,3-10 log UFC/mL) fueron a 37°C. También Laurencio-Silva et al., en la evaluación de cepas BAL para su uso como probióticos (4141. Laurencio-Silva M, Arteaga F, Rondón-Castillo AJ, Ormaza J, Pinto J, Pazmiño D, et al. Potencial probiótico in vitro de cepas de Lactobacillus spp. procedentes de la vagina de vacas lecheras. Pastos y Forrajes. 2017;40(3):206-215.), encontraron que todas crecían a las temperaturas de incubación, muy similares a las empleadas en este estudio (38°C, 39°C y 40°C). Ello indica que la adaptabilidad de Lactobacillus ssp., a diferentes temperaturas, es una característica esencial para la supervivencia de tales microorganismos a las condiciones del ecosistema donde es posible su aplicación.

Hidrólisis de la caseína de la leche (proteólisis)

Solo se apreció hidrólisis de la caseína a las 48 h en Fructobacillus fructosus SS72 (Tabla 1). La mayoría de las cepas (80 %) no mostraron actividad proteolítica, lo que coincide con Peres et al. (4242. Peres CM, Alves M, Hernandez-Mendoza A, Moreira L, Silva S, Bronze MR, et al. Novel isolates of lactobacilli from fermented Portuguese olive as potential probiotics. LWT-Food Science and Technology. 2014;59(1):234-246.), quienes reportaron cepas que exhibían baja actividad de la enzima. La variación encontrada entre cepas puede estar dada por componentes de la pared celular o del medio en que se desarrollan las cepas (4343. Matthews A, Grimaldi A, Walker M, Bartowsky E, Grbin P, Jiranek V. Lactic acid bacteria as a potential source of enzymes for use in vinification. Appl Environ Microbiol. 2004;70(10):5715-5731.). La actividad proteolítica de las cepas es un indicador a tener en cuenta para evaluar la actividad probiótica de las cepas, específicamente referente a la liberación de péptidos bioactivos, los cuales se generan durante la fermentación del alimento o en el proceso de la digestión; estos incluyen algunas secuencias de aminoácidos que ejercen una actividad biológica específica en el huésped (4444. Aimutis WR. Bioactive properties of milk proteins with particular focus on anticariogenesis. The Journal of nutrition. 2004;134(4):989S-995S.).

 
Tabla 1.  Comportamiento del crecimiento a diferentes temperaturas de incubación y valores (mm) del diámetro del halo de proteólisis de la caseína por las BAL aisladas del tracto digestivo de abejas (Apis mellifera). / Growth behavior at different incubation temperatures and values (mm) of the casein proteolysis halo diameter by LAB isolated from the digestive tract of bees (Apis mellifera).
CepasTemperatura de crecimientoHidrólisis de la caseína (mm)*.
37°C45°C24h48h
F. fructosus SS66+---
L. kunkeei SS70+++--
F. fructosus SS72++++++-20
L.rhamnosus SS73++++++--
Lactococcus garvieae SS79++++--
Pseudomonas aeruginosa (Control positivo)NANA1845

Referencias:- Ausencia de crecimiento; + Crecimiento muy débil; ++ Crecimiento débil; +++ Crecimiento abundante. NA: no aplica.* Diámetro del halo deproteólisis.

 

Crecimiento de las cepas aisladas a diferentes pH

Las cinco cepas evaluadas fueron capaces de crecer a pH 6,5; mientras que a pH 5,5 solo F. fructosus SS66, L. kunkeei SS70 y L. rhamnosus SS73 mostraron crecimiento abundante (Figura 1). A pH de 4,5 y 3,5 ninguna cepa fue capaz de crecer, lo cual resulta similar a los valores característicos del género Lactobacillus ssp. Las BAL tienen la capacidad de producir ácido láctico y disminuir el pH del sustrato, aspecto primordial dentro del grupo de los lactobacilos con capacidad probiótica (4141. Laurencio-Silva M, Arteaga F, Rondón-Castillo AJ, Ormaza J, Pinto J, Pazmiño D, et al. Potencial probiótico in vitro de cepas de Lactobacillus spp. procedentes de la vagina de vacas lecheras. Pastos y Forrajes. 2017;40(3):206-215.). L. kunkeei SS70 y L. rhamnosus SS73 tienen resultados comparables con el obtenido por Ávila et al. (4545. Ávila J, Ávila M, Tovar B, Brizuela M, Perazzo Y, Hernández H. Capacidad probiótica de cepas del género Lactobacillus extraídas del tracto intestinal de animales de granja. Revista Científica. 2010;20(2):161-169.). Landa-Salgado et al. (4646. Landa-Salgado P, Caballero-Cervantes Y, Ramírez-Bribiesca E, Hernández-Anguiano AM, Ramírez-Hernández LM, Espinosa-Victoria D, et al. Aislamiento e identificación de bacterias ácido lácticas con potencial probiótico para becerros del altiplano mexicano. Revista mexicana de ciencias pecuarias. 2019;10(1):68-83.), al evaluar cepas de Lactobacillus spp. bajo condiciones acidas similares (4; 4,5; 6,5), reportaron mejores crecimientos en el medio MRS cuando ajustaron el pH 6,5 (9,07 Log10 UFC/mL), mientras que a pH 4,0 el crecimiento disminuyó a 5,09 Log10 UFC/mL.

 
Figura 1.  Cinética del crecimiento a pH 5, 5 de las cepas BAL evaluadas. / Growth kinetics at pH 5,5 of the LAB strains evaluated.
 

Producción de peróxido de hidrógeno (H2O2)

Las cepas resultaron positivas a la prueba de producción de peróxido de hidrógeno con crecimiento abundante y tonalidad azul oscura; resultado similar al reportado por Elenany y Sharaf (4747. Elenany Y, Sharaf El-Din H. Detection and Identification of novel bacterial strains isolated from fresh clover bee honey. Journal of Plant Protection and Pathology. 2019;10(1):49-52.). Dentro de los criterios a tener en cuenta en la evaluación de los probióticos, se incluye la producción de H2O2, por constituir factor inhibidor del crecimiento o colonización del intestino por agentes patógenos potenciales (4848. Iranmanesh M, Ezzatpanah H, Mojgani N. Antibacterial activity and cholesterol assimilation of lactic acid bacteria isolated from traditional Iranian dairy products. LWT-food Science and Technology. 2014;58(2):355-359.).

Prueba de coagulación

De las cinco cepas objeto de evaluación (Tabla 2), solo Fructobacillus fructosus SS66 (20 %) fue negativa a la prueba de coagulación en todos los tiempos, al compararlas con la cepa patrón L. acidophilus. La coagulación láctica o ácida se realiza por las bacterias lácticas presentes en la leche cruda o procedente de diferentes ambientes, que transforman la lactosa en ácido láctico y desciende el pH de la leche, lo que produce la alteración de la caseína hasta la formación de un coágulo; este constituye un importante indicador para nuestras condiciones al permitir mantener las cepas en un medio natural y obtener masa bacteriana (2626. Hernández-García JE, Sebastián-Frizzo L, Rodríguez-Fernández JC, Valdez-Paneca G, Virginia-Zbrun M, Calero-Herrera I. Evaluación in vitro del potencial probiótico de Lactobacillus acidophilus SS80 y Streptococcus thermophilus SS77. Rev Salud Anim. 2019;41(1).).

Actividad hemolítica

En el presente trabajo no hubo cepas evaluadas que revelaran actividad hemolítica, con excepción de Fructobacillus fructosus SS66 (Tabla 2). Dentro de los indicadores recomendados para evaluar los probióticos, la actividad hemolítica es uno de los criterios de selección dada su relación con la virulencia de las cepas (2020. FAO/WHO. WHO works group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food London. Ontario, Canada, April. 2002;30., 4949. De Vuyst L, Moreno MF, Revets H. Screening for enterocins and detection of hemolysin and vancomycin resistance in enterococci of different origins. Int J Food Microbiol. 2003;84(3):299-318.). Estos resultados se corresponden con los encontrados por Gutiérrez et al. (5050. Gutiérrez RLA, David RCA, Montoya COI, Betancur GE. Efecto de la inclusión en la dieta de probióticos microencapsulados sobre algunos parámetros zootécnicos en alevinos de tilapia roja (Oreochromis sp.). Rev Salud Anim. 2016;38(2):8.), ya que, de las 14 cepas seleccionadas, 10 resultaron ser no hemolíticas. Las bacterias pertenecientes al grupo de las ácido lácticas generalmente no son patógenas (GRAS) (1515. Yao W, Yang L, Shao Z, Xie L, Chen L. Identification of salt tolerance-related genes of Lactobacillus plantarum D31 and T9 strains by genomic analysis. Annals of Microbiology. 2020;70(1):1-14.) y, por consiguiente, no poseen hemolisinas que destruyan las células rojas, y al ser administradas como posibles probióticos en abejas, no deben presentar ningún problema. No obstante, se reportan cepas de L. casei con hemólisis positiva (5151. Ruiz-Moyano S, Martín A, Benito MJ, Casquete R, Serradilla MJ, de Guía Córdoba M. Safety and functional aspects of pre-selected lactobacilli for probiotic use in Iberian dry-fermented sausages. Meat science. 2009;83(3):460-467.).

 
Tabla 2.  Prueba de la coagulación de la leche y actividad hemolítica de las BAL aisladas del tracto digestivo de abejas (Apis mellifera). / Milk coagulation test and hemolytic activity of LAB isolated from the digestive tract of bees (Apis mellifera).
CepasPrueba de la coagulación de la leche*Actividad hemolítica a las 72 h
24 h48 h72 h
F. fructosus SS66---+(β)
L. kunkeei SS70-+++(α)
F. fructosus SS72+++-
L. rhamnosus SS73++++(α)
L. garvieaeSS 79--++(α)
L. acidophillus+++-

*Referencias: -Ausencia de crecimiento; +Presencia de crecimiento (coagulación de la leche).

 

Descarboxilación de aminoácidos

Las cepas evaluadas no mostraron capacidad para la producción de aminas biógenas (AB): solo la cepa Lactococcus garvieae SS79 utilizó la alanina, de los cinco aminoácidos ensayados, pasadas las 36 h. Este es otro indicador de seguridad en la evaluación de cepas candidatas a probióticos (5252. Hazards EPoB. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ). Scientific opinion on risk based control of biogenic amine formation in fermented foods. Efsa Journal. 2011;9(10):2393-2486.), pues altas concentraciones de aminas en los alimentos, pueden ingresar en la cadena alimentaria y ser responsables de varios problemas toxicológicos en humanos (5353. Ladero Losada VM, Martín MC, Redruello B, Mayo Pérez B, Flórez García AB, Fernández García M, et al. Genetic and functional analysis of biogenic amine production capacity among starter and non-starter lactic acid bacteria isolated from artisanal cheeses. 2015.). No obstante, la formación de AB se asocia a cepas de Lactobacillus ssp., tales como L. plantarum, L. curvatus, L. alimentarius, L. reuteri y L. sakei (5454. Pereira C, Crespo MB, San Romao M. Evidence for proteolytic activity and biogenic amines production in Lactobacillus curvatus and L. homohiochii. Int J Food Microbiol. 2001;68(3):211-216.). Tarrah et al. (5555. Tarrah A, Castilhos J, Rochele Cassanta R R, Da Silva V D, Righetto D Z, Corich V, et al. In vitro probiotic potential and anti-cancer activity of newly isolated folate-producing Streptococcus thermophilus strains. Frontiers in Microbiology. 2018;9:1-11.) realizaron un estudio in vitro de cepas de S. thermophilus y estas manifestaron diferencias en la producción de AB, por lo que los autores concluyeron que es una característica dependiente de la cepa. En estudios de caracterización de cepas de BAL, otros autores reportan que S. thermophilus SS77 fue capaz de utilizar la alanina a partir de las 36 h, mientras que la cepa de L acidophilus SS80, solo lo hizo con la histidina a partir de las 72 h (2626. Hernández-García JE, Sebastián-Frizzo L, Rodríguez-Fernández JC, Valdez-Paneca G, Virginia-Zbrun M, Calero-Herrera I. Evaluación in vitro del potencial probiótico de Lactobacillus acidophilus SS80 y Streptococcus thermophilus SS77. Rev Salud Anim. 2019;41(1).).

Crecimiento en Bilis

En la cinética de crecimiento de las diferentes cepas se pudo observar que todas las cepas son capaces de crecer en presencia de bilis al 1 %, aunque se destacan L. kunkeei SS70 y L. rhamnosus SS73 con los mayores valores de crecimiento (Figura 2).

 
Figura 2.  Cinética de crecimiento de las cepas en presencia de bilis al 1 % durante 24 horas. / Strain growth kinetics in the presence of 1 % bile for 24 hours.
 

Gilliland et al. (5656. Gilliland S, Staley T, Bush L. Importance of bile tolerance of Lactobacillus acidophilus used as a dietary adjunct. Journal of dairy science. 1984;67(12):3045-3051.) encontraron que 0,3 % de sales biliares era un punto crítico de resistencia para cepas de Lactobacillus ssp., al tener una alta correlación con la supervivencia en los intestinos de los animales incluidos en el ensayo. En pruebas de selección de bacterias lácticas (5757. Jurado-Gámez H, Martínez BJA, Chaspuengal TA, Calpa FY. Evaluation in vitro of the action of Lactobacillus plantarum with probiotic characteristics on Yersinia pseudotuberculos. Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial. 2014;12(2):49-59.), se encontraron cepas de Lactobacillus ssp. resistentes a sales biliares (0,5 %, 1 %, 2 % y 3 %).

En otros estudios con otras cepas BAL, se reportan cepas de Streptococcus ssp. capaces de crecer en todas las concentraciones de bilis evaluadas (0,3 %, 0,5 % y 1 %) y cepas de Lactobacillus ssp. que solo lo hicieron a la concentración de 0,3 % (2626. Hernández-García JE, Sebastián-Frizzo L, Rodríguez-Fernández JC, Valdez-Paneca G, Virginia-Zbrun M, Calero-Herrera I. Evaluación in vitro del potencial probiótico de Lactobacillus acidophilus SS80 y Streptococcus thermophilus SS77. Rev Salud Anim. 2019;41(1).), lo que evidencia que los resultados de las bacterias lácteas son variables.

Tolerancia a jugo gástrico artificial (JGA)

Las cepas estudiadas mostraron una alta capacidad de resistencia ante condiciones extremas del JGA; excepto la cepa Lactococcus garvieae SS79, el resto de las cepas mostraron una cinética de crecimiento similar al control (Figura 3) y cumplen con esta condición de exposición, simulándose el paso del alimento a través del tracto gastrointestinal (TGI), después de la permanencia de las bacterias en caldo MRS a pH 3 durante 3 h a 37°C. Para que sean efectivas, las cepas probióticas deben conservar las características de salud funcional para las cuales fueron seleccionadas originalmente. Tales características incluyen la capacidad de sobrevivir el tránsito a través del estómago y el intestino delgado y colonizar el TGI del huésped (5858. Kenfack CHM, Kaktcham PM, Ngoufack FZ, Wang YR, Yin L, Zhu T. Screening and characterization of putative probiotic Lactobacillus strains from honey bee gut (Apis mellifera). J Advances in Microbiology. 2018:1-18.). La sobrevivencia de BAL en el jugo gástrico puede ser independiente del pH. Si bien en el presente trabajo las mediciones con espectrofotómetro no diferencian entre bacterias vivas y muertas, es de suponer que aquellos aislados que muestren incremento en sus lecturas, luego del cese de las condiciones estresantes, pueden ser considerados como tolerantes ya que consiguieron multiplicarse. Los resultados en este estudio, mediante mediciones positivas de la curva de crecimiento realizada durante 24 horas, indican la capacidad de recuperación de las cinco cepas sometidas a los mismos desafíos, respecto a la capacidad de sobrevivir a estas condiciones hostiles.

 
Figura 3.  Cinética de crecimiento de las cepas BAL aisladas del tracto digestivo de abejas en el medio MRS después de la exposición con JGA. / Growth kinetics of LAB strains isolated from the digestive tract of bees in MRS medium after exposure with AGJ.
 

Ensayo de autoagregación, coagregación con patógenos intestinales e hidrofobicidad

Los resultados de autoagregación de este estudio no coinciden con los reportados por otros autores (5959. Meryandini A, Karyawati AT, Nuraida L, Lestari Y. Lactic Acid Bacteria from Apis dorsata hive possessed probiotic and Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitor Activity. Makara Jof Science. 2020;24(1):7.) que encontraron porcientos de autoagregación en las cepas estudiadas entre 88,4 % y 95,6 %. Este mismo autor encontró altos porcientos de coagregación frente a los patógenos Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella thyphymurium, que pueden ser comparados con las cepas BAL investigadas, L. rhamnosus SS73 y L. kunkeei SS70, que produjeron coagregación contra Escherichia coli (Tabla 3).

Las BAL pueden inhibir la adherencia de bacterias patógenas a la mucosa del intestino, ya sea mediante una barrera por autoagregación o por coagregación directa con los patógenos. En la mayoría de los casos, la capacidad de agregación está relacionada con las propiedades de adherencia celular, lo que también implica su capacidad para sobrevivir y persistir en el tracto gastrointestinal (6060. Tuo Y, Yu H, Ai L, Wu Z, Guo B, Chen W. Aggregation and adhesion properties of 22 Lactobacillus strains. J dairy science. 2013;96(7):4252-4257.).

La hidrofobicidad fue variable entre las cepas, de acuerdo a la clasificación establecida. F. fructosus SS72 exhibió un valor alto, L. rhamnosus SS73 y L. kunkeei SS70 medio y L. garvieae SS79 y F. fructosus SS66 bajo (Tabla 3). Estos resultados solo se comparan con los obtenidos por Goel et al. (6161. Goel A, Halami PM, Tamang JP. Genome Analysis of Lactobacillus plantarum isolated from some Indian fermented foods for Bacteriocin production and probiotic marker genes. Frontiers in microbiology. 2020;11.), quienes encontraron porcientos de hidrofobicidad para las cepas de L. plantarum evaluadas entre 55,57 % y 54,0 % para el xyleno y 42,9 y 40,88 % para el hexadecano. Se describen en dos aislados de L. plantarum altos valores de hidrofobicidad entre 85,26 % a 94,9 % para el xyleno y de 4,3 % a 48,37 % para el cloroformo (6262. TR K. Probiotic potency of Lactobacillus plantarum KX519413 and KX519414 isolated from honey bee gut. FEMS microbiology letters. 2018;365(4):285.).

También se plantea que existe una correlación entre la habilidad por la adhesión y la hidrofobicidad de algunos Lactobacillus. La naturaleza hidrófoba de la superficie más externa de los microorganismos se relaciona con la unión de las bacterias al tejido del huésped; esta propiedad podría conferir una ventaja competitiva, importante para el mantenimiento bacteriano en el sistema gastrointestinal (6060. Tuo Y, Yu H, Ai L, Wu Z, Guo B, Chen W. Aggregation and adhesion properties of 22 Lactobacillus strains. J dairy science. 2013;96(7):4252-4257.).

Por su parte, Dlamini et al. (6363. Dlamini ZC, Langa RL, Aiyegoro OA, Okoh AI. Safety evaluation and colonisation abilities of four lactic acid bacteria as future probiotics. Probiotics and antimicrobial proteins. 2019;11(2):397-402.) observaron altos valores de autoagregación (60 a 70 %) y coagregación (45 a 56 %), en cuatro cepas de BAL, después de 4 h de incubación a 37°C, así como una alta hidrofobicidad para todos los solventes utilizados: xyleno (78-84 %), cloroformo (68-75 %) y etil acetato (52-60 %).

 
Tabla 3.  Resultados de los ensayos de autoagregación, coagregación e hidrofobicidad (120 min), (n=3), de las cepas BAL aisladas del tracto digestivo de abejas. / Results of the self-aggregation, co-aggregation and hydrophobicity tests (120 min), (n = 3), of the LAB strains isolated from the digestive tract of bees.
CepasResultados
AutogregaciónCoagregaciónHidrofobicidad (%) (n-hexadecano)
Salmonella dublinEscherichia coli
F. fructosus 66---22,53 d ± 0.503
L. kunkeei 70--+46,04 e ± 0.093
F. fructosus 72---57,70 c ± 0.755
L. rhamnosus 73--+47,89a ± 0.110
L. garvieae 79---12,45 b ± 0.478

Leyenda: + Autoagregación positiva, ++ fenotipo coagregante no compacto, +++ fenotipo coagregante compacto. Superíndices diferentes, en una columna, denotan diferencias significativas entre ensayos (p<0,05).

 

Actividad antimicrobiana frente a patógenos

Otra de las características que facilita la selección de cepas que puedan ser consideradas como potenciales probióticos, es su capacidad de inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos. A partir de la escala del halo de inhibición, el 100 % de las cepas evaluadas exhibieron actividad antagónica contra la totalidad de los patógenos estudiados, con variaciones entre ellas (Tabla 4). Se ha reportado la producción de sustancias inhibidoras para todo el género de Lactobacillus, incluyendo a Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc y Pediococcus, así como Enterococcus (4848. Iranmanesh M, Ezzatpanah H, Mojgani N. Antibacterial activity and cholesterol assimilation of lactic acid bacteria isolated from traditional Iranian dairy products. LWT-food Science and Technology. 2014;58(2):355-359.). No obstante, no siempre se dispone de un completo análisis de la naturaleza de las sustancias antagónicas que producen las cepas evaluadas.

Se describe por varios autores que, en esta actividad, pueden estar presentes ácidos orgánicos como son ácido láctico, peróxido de hidrógeno, dióxido de carbono, diacetilo, acetaldehído y sustancias de naturaleza proteica antimicrobiana, llamadas bacteriocinas (4848. Iranmanesh M, Ezzatpanah H, Mojgani N. Antibacterial activity and cholesterol assimilation of lactic acid bacteria isolated from traditional Iranian dairy products. LWT-food Science and Technology. 2014;58(2):355-359.,5757. Jurado-Gámez H, Martínez BJA, Chaspuengal TA, Calpa FY. Evaluation in vitro of the action of Lactobacillus plantarum with probiotic characteristics on Yersinia pseudotuberculos. Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial. 2014;12(2):49-59.,6464. Elshaghabee FM, Rokana N, Gulhane RD, Sharma C, Panwar H. Bacillus as potential probiotics: status, concerns, and future perspectives. Frontiers in microbiology. 2017;8:1490.); mecanismos que podrían sustentar el resultado mostrado por las cepas incluidas en el estudio.

En el ensayo de enfrentamiento a patógenos, las BAL aisladas del intestino de abejas, se observó que solo Lactobacillus AJ5, IG9, A15 y CRL1647 fueron capaces de inhibir S. aureus ATCC29213, B. cereus C1, E. coliO157: H7, L. monocytogenes y P. larvae (6565. Audisio MC, Torres MJ, Sabaté DC, Ibarguren C, Apella MC. Properties of different lactic acid bacteria isolated from Apis mellifera L. bee-gut. Microbiological research. 2011;166(1):1-13.). Lactobacillus kunkeei, aislado de intestino de abejas, fue capaz de inhibir el crecimiento de Listeria monocytogenes, Yersinia pseudotuberculosis, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli (6666. UĞRAŞ S. Isolation, identification and characterization of probiotic properties of bacterium from the honey stomachs of Yigilca honeybees in Turkey. Türkiye Entomoloji Dergisi. 2017;41(3):253-261.). Resultados similares de inhibición se observaron con cepas de BAL (MA3 y MA4) aisladas de Apis mellifera frente a L. monocytogenes y E. coli (6767. Putri I, Jannah SN, Purwantisari S. Isolation and characterization of lactic acid bacteria from Apis mellifera and their potential as antibacterial using in vitro test against growth of Listeria monocytogenes and Escherichia coli. NICHE J of Tropical Biology. 2020;3(1):26-34.). En estudio de aislamientos y caracterización de BAL de origen floral, se encontró que Fructobacillus fructosus, Lactobacillus kunkeei, Enterococcus durans y Lactobacillus brevis exhibieron efecto inhibidor frente a los patógenos Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa (6868. Saleh G. Isolation and characterization of unique fructophilic lactic acid bacteria from different flower sources. Iraqi Journal of Agricultural Science. 2020;51(2):508-518.).

 
Tabla 4.  Actividad inhibitoria (Diámetros del halo de inhibición, mm) de las cepas BAL aisladas del tracto digestivo de abejas frente a cepas patógenas. n = 3 . / Inhibitory activity (inhibition halo diameters, mm) of the LAB strains isolated from the digestive tract of bees against pathogenic strains. n = 3
CepasListeria monocitogenesSalmonella dublin 595Escherichia coli 289Bacillus cereusStaphylococcus aureus
F. fructosus SS6618,26 cd±0.26216,57c±0.25216,73c±0.05816,90d±0.1015,57b±0.153
L. kunkeei SS7016,03 b ±0.15313,0 a±0.1011,0a±0.2011,2a±0.26416,17c±0.153
F. fructosus SS7217,9 c ±0.1017,20d±0.20016,37c±0.11512,94b±0.05313,67a±0.153
L. rhamnosus SS7312,77 a ±0.05816,37c±0.15318,77d±0.05814.53c±0.05815,90bc±0.10
L. garvieae SS7918,7 d ±0.2014,13b±0.16215,05b±0.13216,67d±0.15317,98d±0.025

Leyenda: Superíndices diferentes, en una columna, denotan diferencias significativas entre ensayos (p<0,05).

 

Las cepas BAL se enfrentaron a uno de los patógenos de mayor importancia en la producción apícola: Paenibacillus larvae. Todas las cepas produjeron inhibición en alguna de las técnicas utilizada (Tabla 5), excepto Fructobacillus fructosus SS66, lo que demuestra la interacción de factores con efecto inhibidor sobre P. larvae. Otros autores demuestran que cepas BAL, aisladas del intestino de abejas, fueron capaces de inhibir diferentes patógenos, incluyendo P. larvae (6969. Al-Ghamdi A, Al-Abbadi AA, Khan KA, Ghramh HA, Ahmed AM, Ansari MJ. In vitro antagonistic potential of gut bacteria isolated from indigenous honey bee race of Saudi Arabia against Paenibacillus larvae. Journal of Apicultural Research. 2020:1-9., 7070. Yoshiyama M, Wu M, Sugimura Y, Takaya N, Kimoto-Nira H, Suzuki C. Inhibition of Paenibacillus larvae by lactic acid bacteria isolated from fermented materials. Journal of invertebrate pathology. 2013;112(1):62-67.).

En ensayo a nivel de laboratorio con larvas de abejas se ha comprobado que el suministro del consorcio bacteriano aislado de intestino de abejas: Lactobacillus plantarum Lp39, Lactobacillus rhamnosus GR-1 y Lactobacillus kunkeei BR-1, reduce la carga de patógenos, aumenta la expresión de genes de inmunidad claves y mejora la supervivencia durante la infección por P. larvae (2222. Daisley BA, Pitek AP, Chmiel JA, Al KF, Chernyshova AM, Faragalla KM, et al. Novel probiotic approach to counter Paenibacillus larvae infection in honey bees. The ISME journal. 2020 14(2):476-491.). De igual forma, siete cepas bacterianas aisladas de intestino de abejas melíferas se enfrentaron a la cepa P. larvae ATCC9545 por el método de difusión de disco, donde se incluyó Lactobacillus kunkeei (KY027158), y mostraron fuertes efectos inhibitorios frente al patógeno evaluado (6969. Al-Ghamdi A, Al-Abbadi AA, Khan KA, Ghramh HA, Ahmed AM, Ansari MJ. In vitro antagonistic potential of gut bacteria isolated from indigenous honey bee race of Saudi Arabia against Paenibacillus larvae. Journal of Apicultural Research. 2020:1-9.).

 
Tabla 5.  Prueba de Inhibición de las BAL aisladas desde el tracto digestivo de abejas (Apis mellifera) frente a Paenibacillus larvae. n=3. / Inhibition test of LAB isolated from the digestive tract of bees (Apis mellifera) against Paenibacillus larvae. n = 3.
CepasDiámetro del halo de inhibición (mm) -Técnica SpotDiámetro del halo de inhibición (mm)-Técnica estría
24h72h24h72h
F. fructosus SS66----
L. kunkeei SS7014,83d±0.15314,93d±0.163--
F. fructosus SS725b±0,005b±0,0013a±0,11512,93a±0.058
L. rhamnosus SS7312c±0,15312,03c±0,15327b±0,05827,13b±0,115
L.garvieae SS794a±0,1154a±0,15313a±0,11513,13a±0,153

Leyenda: Superíndices diferentes, en una columna, denotan diferencias significativas entre ensayos (p<0,05).

 

De las cinco cepas de Lactobacillus ssp. caracterizadas, L. kunkeei SS70 y L. rhamnosus SS73 manifestaron un mejor comportamiento en varios de los diferentes parámetros evaluados (crecimiento a temperatura 45°C, crecimiento a pH 5,5, coagregación a patógenos intestinales y antagonismo contra el P. larvae); así mismo, dentro de las principales cepas estudiadas in vitro con fines probióticos en las abejas, se encuentran L. kunkeei (7171. Janashia I, Choiset Y, Jozefiak D, Déniel F, Coton E, Moosavi-Movahedi AA, et al. Beneficial protective role of endogenous lactic acid bacteria against mycotic contamination of honeybee beebread. Probiotics and antimicrobial proteins. 2018;10(4):638-646., 7272. Kačániová M, Kunová S, Ivanišová E, Terentjeva M, Gasper J. Antimicrobial effect of Lactobacillus kunkeei against pathogenic bacteria isolated from bees' gut. Scientific Papers: Animal Science & Biotechnologies/Lucrari Stiintifice: Zootehnie si Biotehnologii. 2019;52(2)., 7373. Olofsson TC, Vásquez A. Detection and identification of a novel lactic acid bacterial flora within the honey stomach of the honeybee Apis mellifera. Current microbiology. 2008;57(4):356-363., 7474. Tajabadi N, Mardan M, Manap MYA, Shuhaimi M, Meimandipour A, Nateghi L. Detection and identification of Lactobacillus bacteria found in the honey stomach of the giant honeybee Apis dorsata. Apidologie. 2011;42(5):642.) y L. rhamnosus (2222. Daisley BA, Pitek AP, Chmiel JA, Al KF, Chernyshova AM, Faragalla KM, et al. Novel probiotic approach to counter Paenibacillus larvae infection in honey bees. The ISME journal. 2020 14(2):476-491., 5959. Meryandini A, Karyawati AT, Nuraida L, Lestari Y. Lactic Acid Bacteria from Apis dorsata hive possessed probiotic and Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitor Activity. Makara Jof Science. 2020;24(1):7.); además, con estas cepas se reportan resultados benéficos al ser administradas a las colmenas (1616. Alberoni D, Baffoni L, Gaggìa F, Ryan P, Murphy K, Ross P, et al. Impact of beneficial bacteria supplementation on the gut microbiota, colony development and productivity of Apis mellifera L. Beneficial microbes. 2018;9(2):269-278., 2222. Daisley BA, Pitek AP, Chmiel JA, Al KF, Chernyshova AM, Faragalla KM, et al. Novel probiotic approach to counter Paenibacillus larvae infection in honey bees. The ISME journal. 2020 14(2):476-491.), por lo cual se consideran las candidatas probióticas para inocular el jarabe de sacarosa a administrar a las abejas en periodos de hambruna.

Ensayo de antibiorresistencia

La capacidad que manifiestan algunas cepas de resistencia a los antibióticos es un criterio determinante y restrictivo para ser seleccionado como posible probiótico. Con relación a las dos cepas (L. kunkeei SS70 y L. rhamnosus SS73) seleccionadas como posibles probióticos, mostraron sensibilidad frente a todos los antibióticos evaluados, excepto a la Sulfonamida y Vancomicina (Tabla 6); lo que sugiere que estas cepas no transmitirán mediadores de resistencia antimicrobiana hacia otros microrganismos presentes en el hospedero.

Los resultados concuerdan con otros autores (1414. Miranda-Yuquilema JE, Marin-Cárdenas A, Sánchez-Macías D, García-Hernández Y. Obtención, caracterización y evaluación de dos preparados candidatos a probióticos desarrollados con residuos agroindustriales. Revista MVZ Córdoba. 2018:6487-6499., 7575. Sánchez L, Omura M, Lucas A, Pérez T, Llanes M, Ferreira CdL. Cepas de Lactobacillus spp. con capacidades probióticas aisladas del tracto intestinal de terneros neonatos. Rev Salud Animal. 2015;37(2):94-104.), quienes indican que Lactobacillus ssp. y Bifidobacterium ssp. son sensibles frente a la mayoría de estos antibióticos. En un estudio sobre resistencia a antibióticos convencionales utilizados en medicina, de cinco cepas de BAL aisladas del estómago de la abeja melífera (L. fermentun (HM027462), L. kunkeei (GQ451631), L. pentosus (HM027640), Lactobacillus Taj Naser-1 (GQ451611), Lactobacillus ssp. Taj Makhdzir-Naser-1 (GQ451633), se reportan en la mayoría de ellas niveles de sensibilidad similares a los encontrados en el presente trabajo; aunque algunas de las cepas mostraron resistencia (7676. Gharehyakheh S, HosseinElhamirad A, Nateghi L, Varmira K. Evaluation of resistance to conventional antibiotics in medicine by 5 strains of Lactic Acid Bacteria isolated from the stomach of honey bee. Asian Journal of Biological and Life Sciences. 2017;6(3).). También se reportan en otros estudios variación en las cepas de Lactobacillus a los antibióticos (7777. Anisimova EA, Yarullina DR. Antibiotic resistance of Lactobacillus strains. Current microbiology. 2019;76(12):1407-1416.), pero la mayoría es sensible a los fármacos de uso clínico; aunque no todos los mecanismos de resistencia a antibióticos en Lactobacillus. ssp son intrínsecos.

 
Tabla 6.  Diámetro de los halos (mm) de las cepas de L. kunkeei SS y L. rahamnosus SS 73 aisladas del tracto intestinal de las abejas frente a antibióticos de diferentes familias. / Halo diameter (mm) of L. kunkeei SS and L. rahamnosus SS 73 strains isolated from the intestinal tract of bees against antibiotics from different families.
Agente AntimicrobianoDiámetro de los halos de las cepas (mm)
L. kunkeei SS 70 L. rahamnosus SS 73
Amikacina (30 μg)1012
Amoxicilina (10 μg)3134
Ampicilina (10 μg)3541
Cefalotina (30 μg)4123
Ceftriaxona CRO (30 μg)4010
Ciprofloxacina (5 μg)17-1833
Cloranfenicol (30 μg)2627-28
Cefalexina (30 μg)25-2413-15
Eritromicina (15 μg)23-2530-35
Gentamicina (10 μg)12-1020-22
Oxacilina (1 μg)2015
Meropenem (10 μg)27-2825-26
Penicilina G (10 μg)2730
Sulfonamida (300 μg)00
Vancomicina (30μg)00
 

CONCLUSIONES

Las cepas de Lactobacillus ssp., caracterizadas mediante pruebas in vitro, demostraron tener potencial como probiótico al cumplir con los parámetros básicos, como son resistencia a pH ácido, sales biliares, amplio espectro de actividad antimicrobiana y efecto inhibitorio frente a Paenibacillus larvae y otros patógenos de interés sanitario: Listeria monocitogenes, Salmonella dublin 595, Escherichia coli 289, Bacillus cereus y Staphylococcus aureus.

Los exponentes que mejor comportamiento obtuvieron en las pruebas in vitro fueron L. kunkeei SS70 y L. rhamnosus SS73; estas cepas están en condiciones de ser incorporadas en un inóculo probiótico y evaluadas en un ensayo in vivo en estudios adicionales.

 
 
 
AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan su agradecimiento al Laboratorio de Referencia para Investigaciones y Salud Apícola (LARISA), Cuba; al Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), al Laboratorio de Análisis de Alimentos, Instituto de Ciencias Veterinarias del Litoral, Consejo Nacional del Investigaciones Científicas y Técnicas (ICIVET-CONICET/UNL) y al Departamento de Salud Pública, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Litoral, Argentina, por poner a nuestra disposición los recursos y las tecnologías de laboratorio para el desarrollo de los ensayos, en el marco del convenio de movilidad docente e investigativa existente entre la UNISS-LARISA- UNL.

 

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Recibido: 08/04/2021

Aceptado: 09/08/2021

 
 

Conflicto de Intereses: Los autores declaran que no existen conflictos de intereses relacionados con el presente artículo.

Contribución de los autores: José Antonio Rodríguez Díaz: participó en el diseño de los experimentos, en la ejecución y evaluación de los ensayos, escribió y revisó el documento. Juan Emilio Hernández García: diseñó los experimentos, participó en su ejecución y escribió y revisó el documento. Laureano Sebastián Frizzo: participó en la ejecución y supervisión de los métodos de ensayos y revisó el documento. Ken Jact Fernández León: participó en la colecta y procesamiento de los datos y en la revisión del documento. Yovanni Solenzal Valdivia: participó en la colecta de los datos y en la revisión del documento. Lilian Sánchez Miranda: supervisó y ejecutó los métodos de ensayos; participó en la revisión del documento. Todos los autores revisaron y aprobaron la versión final del documento.

 

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