Estandarización de un ensayo de RT-PCR en tiempo real basado en SYBR Green-I para la detección del virus de la influenza equina

Ana María Acevedo, Ana María Lazo, Damarys Relova, Carmen Laura Perera

Resumen

La influenza equina es una infección respiratoria aguda de los caballos, burros, mulas y cebras. Actualmente, los ensayos de reverso transcripción acoplados a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR) están siendo ampliamente usados en los laboratorios de diagnóstico, como una alternativa más sensible al aislamiento viral, para la detección del virus de influenza equina. El objetivo de este estudio fue estandarizar un ensayo de rRT-PCR, basado en SYBR Green-I acoplado a análisis de curvas de disociación para la detección del virus de influenza equina (gen M) y la tipificación del gen de la hemaglutinina (HA). Se evaluaron la sensibilidad y la especificidad del ensayo (gen M). En términos de números de copias del gen de la matriz, el límite de detección fue de 4,5 copias del gen/μL del ARN transcripto in vitro. El rango lineal obtenido para el transcripto en el ensayo generó una curva estándar desde 107 hasta 100 copias del gen/µL en término de número de copias de ARN. El coeficiente de correlación (R2) fue de 0,99 para las copias de ARN detectadas en agua libre de nucleasas. El error de la curva estándar fue de 0,0139. El ensayo de rRT-PCR mostró ser específico para el virus de influenza equina. No se obtuvieron curvas de amplificación específicas con los otros virus evaluados, como son arteritis viral equina, herpesvirus equino-1 y herpesvirus equino-4. El ensayo mostró amplificación y curvas de disociación específicas cuando se evaluó la segunda pareja de cebadores contra el gen de la hemaglutinina. Así, el ensayo propuesto de rRT-PCR, basado en SYBR Green-I para la detección del virus de influenza equina, puede ser usado en caso de una posible emergencia de este agente en Cuba.

Palabras clave

virus de la influenza equina; ensayo de RT-PCR en tiempo real basado en SYBR Green-I

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