Actividad antibacteriana del aceite esencial de Thymus vulgaris L. sobre Xanthomonas phaseoli pv. phaseoli y su efecto en la membrana citoplasmática

Aceite esencial y cepa bacteriana

El aceite esencial de T. vulgaris se obtuvo en el laboratorio de Ecología Química del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) por el método de hidrodestilación, durante 3 h con equipo Clevenger (1111. Benachour H, Ramdani M, Lograda T, Chalard P, Figueredo G. Chemical composition and antibacterial activities of Capparis spinosa essential oils from Algeria. Biodiversitas. 2020;21(1):161–9. DOI: 10.13057/biodiv/d210121). Se utilizó la cepa de Xanthomona phaseoli pv. phaseoli (Xap1), procedente de una muestra de campo, que pertenece a la colección del laboratorio de Bacteriología Vegetal del CENSA, caracterizado por métodos bioquímicos y moleculares (33. Corzo-López M, Rivero-González D, Zamora-Gutiérrez L, Martínez-Zubiaur Y, Martínez-Coca B. Detección e identificación de nuevos aislados de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli en cultivares de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) en la provincia Mayabeque, Cuba. Revista de Protección Vegetal [Internet]. 2015;30(2):97–103. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S1010-27522015000200003&script=sci_arttext&tlng=pt, 1212. Constantin E, Cleenwerck I, Maes M, Baeyen S, Malderghem C Van, Vos PD, et al. Genetic characterization of strains named as Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae leads to a taxonomic revision of the X. axonopodis species complex. Plant Pathology Journal. 2016;65:792–806. DOI: 10.1111/ppa.12461).

Actividad antibacteriana

La actividad antimicrobiana se determinó por los métodos de difusión en agar con discos (DAD) (1313. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests [Internet]. 13th ed. Clinical and Laboratory Standards Institute; 2018. Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m02) y diluciones seriadas (1414. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically-M07 [Internet]. 11th ed. Clinical and Laboratory Standards Institute; 2018 [cited. Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m07]). Se prepararon suspensiones bacterianas de Xap1 a 10⁸ UFC. ml^-1, en solución salina estéril (SS), según escala de McFarland, a partir de un cultivo en medio Agar Nutriente (AN, Biocen) incubado durante 24 h a 28°C. La concentración de inóculo, en las suspensiones, se verificó por conteo de colonias viables en unidades formadoras de colonia (UFC. ml^-1) en placas de AN.

Para el método de difusión en agar con discos, se tomaron alícuotas de 100 μl de la suspensión bacteriana y se sembraron con espátulas de Drigalsky en placas Petri estériles de 9 cm de diámetro, con 20 ml de AN. Se colocaron cuatro discos de papel de filtro estériles (Whatman No. 1) de 6 mm de diámetro, de forma equidistante, sobre el medio inoculado con las suspensiones bacterianas.

En cada placa se aplicaron 10 μl del aceite esencial puro en dos discos, y otros dos discos se utilizaron como control negativo (sin aceite). Como control positivo se utilizaron discos de estreptomicina (10 μg/disco; Liofilchem) y discos impregnados con 10 µg de sulfato de cobre (Merck), a partir de una solución de sulfato de cobre a 1 µg. µl^-1. Las placas se incubaron a 28°C (24 h) y se midió el diámetro del halo de inhibición del crecimiento alrededor de los discos. La evaluación se realizó por cuatriplicado para cada tratamiento.

Para la determinación de la CMI y CMB se utilizó método de disoluciones seriadas en el medio caldo nutriente (CN, Biocen) con dimetilsulfóxido (DMSO, Merck) a 1 µl. ml^-1 para facilitar la solubilidad del aceite. El aceite esencial de T. vulgaris se aplicó en el rango de concentraciones de 0,150 a 2,4 mg. ml^-1, con diluciones en base 2. Se distribuyó 1 ml por tubo y se le adicionó 1 ml de medio con DMSO y la suspensión bacteriana (10⁶ UFC. ml^-1), que se preparó, previamente, a partir de un cultivo en medio AN incubado durante 24 h a 28°C.

Se incluyeron, como controles del ensayo, sin suspensión bacteriana: medio de cultivo CN, medio de cultivo NC con DMSO (1 µl. ml^-1), medio CN con DMSO (1 µl. ml^-1) y aceite a la máxima concentración de los tratamientos (2,41 mg. ml^-1). Como control negativo, se utilizó medio de cultivo CN con DMSO (1 µl. ml^-1) inoculado con la suspensión de Xap1 a la misma concentración de los tratamientos. El ensayo se realizó por triplicado y todos los tubos se incubaron a 28°C con agitación a 17,8 rad/s.

La CMI se determinó después de 24 h de incubación, y se estableció como la mínima concentración del aceite que inhibió el crecimiento visible del microorganismo, después de la incubación. Para la CMB se tomó una asada de cada tubo y se sembró en una placa de medio AN, y se incubaron a 28°C (24 h). La CMB fue la concentración más baja del aceite, que resultó en un subcultivo negativo. Este ensayo se repitió en tres experimentos independientes.

Tiempo de muerte celular

El tiempo de muerte celular de Xap1, ante la exposición al aceite esencial de T. vulgaris se determinó por conteo de células viables (1515. Guinoiseau E, Luciani A, Serra DDR, Quilichini Y, Berti L, Lorenzi V. Primary mode of action of Cistus ladaniferus L. essential oil active fractions on Staphylococcus aureus strain. AiM. 2015;05(13):881–90. DOI: 10.4236/aim.2015.513092). Una suspensión de células de 10⁶ UFC. ml^-1 se preparó en solución salina estéril (SS) según escala de McFarland, y se mezcló 1:1 con caldo nutriente (CN) que contenía el aceite esencial de T. vulgaris a las CMI y CMB en tubos eppendorff de 1,5 ml, para una concentración final de 5×10⁵ UFC. ml^-1. La concentración final del aceite en los tratamientos fue de 0,3 mg. ml^-1 para la CMI y de 0,6 mg. ml^-1 para la CMB. Se aplicó Tween 80 (0,1 %) para mejorar la solubilidad del aceite en el medio de cultivo. Como control, se utilizó la suspensión de células bacterianas en CN con el disolvente. Las muestras se agitaron e incubaron a 28^oC, con agitación en zaranda termorefrigerada (IKA^® KS 4000 i control).

Se tomaron muestras a tiempo 0, 1, 4, 8, 12, 16, y 24 h de incubación. Las muestras se centrifugaron a 524 rad/s por 10 min (centrífuga, Eppendorf 5424R), se lavaron con 1 ml de SS, y resuspendieron en 100 µl de SS. Se sembraron 20 µl de las diluciones seriadas en base 10, de cada muestra, en dos placas de agar nutriente, y se incubaron a 28^oC (24 h). Se contaron las unidades formadoras de colonias después de la incubación. Este experimento se realizó por triplicado.

Para determinar, con mayor precisión, el tiempo de muerte celular por acción de la esencia de T. vulgaris a la CMB sobre Xap1, se realizó un estudio a intervalos más cortos de tiempo (0, 15, 30, 45 y 60 min). Para esto se utilizó el procedimiento descrito anteriormente, con el control y el tratamiento con el aceite a la CMB.

Bacteriólisis

El ensayo de bacteriólisis se realizó siguiendo el método estándar de Carson et al. (1616. Carson C, Mee B, Riley T V. Mechanism of action of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil on Staphylococcus aureus determined by time-kill, lysis, leakage, and salt tolerance assays and electron microscopy. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2002;46(6):1914–20. DOI: 10.1128/AAC.46.6.1914-1920.2002), con algunas modificaciones. Se preparó una suspensión bacteriana en SS de 1,2 x 10⁹ UFC. ml^-1, según escala de McFarland, de un cultivo de Xap1 de 24 h de incubación en AN a 28⁰C. Posteriormente, este inóculo se centrifugó a 524 rad/s por 10 min (centrífuga, Eppendorf 5424R), se lavó dos veces con SS (SS) y finalmente, se resuspendió en SS con Tween 80 (0,1 %; v/v). La suspensión bacteriana se ajustó a 9 x 10⁸ UFC. ml^-1 McFarland, y se mezcló 1:1 con SS que contenía el aceite esencial de T. vulgaris a las CMI y CMB, en tubos eppendorff de 1,5 ml para una densidad final de 5 × 10⁸ UFC. mL^-1. Por la poca solubilidad del aceite en el medio, se empleó como disolvente Tween 80 (0,1%).

Como control, se empleó la suspensión de células bacteriana en SS, con el disolvente empleado. Las muestras se agitaron e incubaron a 28^oC, con agitación en zaranda termorefrigerada (IKA^® KS 4000 i control). Se tomaron muestras a tiempo 0, 1, 2, 4 h de incubación. Las muestras se centrifugaron a 524 rad/s por 10 min (centrífuga, Eppendorf 5424R), se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el precipitado formado en SS, y se agitó por 20 s en agitador de tubos (Vortex mixer). Luego, se midió la absorbancia (Abs) a 620 nm en un espectrofotómetro (Ray Light UV-2601). Cada muestra se preparó por triplicado y se realizaron tres experimentos independientes. Los resultados se expresaron como la relación (en %) de la Abs₆₂₀ de cada tiempo, contra la Abs₆₂₀ en t₀.

Pérdida de contenido celular

La pérdida de contenido celular se determinó por medición de Abs a 260 nm. La preparación del inóculo y de las muestras se realizaron de igual manera que en el ensayo anterior. Las muestras se agitaron (Zaranda termorefrigerada (IKA^® KS 4000 i control)) e incubaron a 28^oC. Se tomaron muestras a tiempo 0, 1, 2 y 4 h de incubación. Las muestras se centrifugaron a 524 rad/s por 10 min (centrífuga, Eppendorf 5424R), se tomó el sobrenadante y se agitó por 20 s en agitador de tubos (Vortex mixer). Luego, se midió la absorbancia a 260 y 280 nm en un espectrofotómetro (Ray Light UV-2601).

Cada muestra se preparó por triplicado y se realizaron tres experimentos independientes. Los resultados se expresaron como la relación (en %) de la Abs de cada tiempo contra la Abs en t₀, para 260 y 280 nm.

Determinación de proteínas totales liberadas

Las proteínas se determinaron por el método de Lowry (1717. Lowry O, Rosebrough N, Farr A, Randall R. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of biological chemistry. 1951;193(1):265–75. DOI: 10.1016/S0021-9258(19)52451-6). La preparación del inóculo y las muestras se realizó de igual modo que en el ensayo de pérdida de contenido celular. Las muestras se agitaron e incubaron por 2 h a 28°C, con agitación en zaranda termorefrigerada (IKA® KS 4000 i control). Se centrifugaron a 524 rad/s por 10 min (centrífuga, Eppendorf 5424R), se tomó el sobrenadante y se agitó por 20s en agitador de tubos (Vortex mixer). 100 µl de cada muestra fueron disueltos en 100 µl de agua destilada (1:1), y se les añadió 1 ml de solución de Lowry; se incubaron por 15 min a temperatura ambiente y se le añadieron 100 µl del reactivo de Folin (Sigma) para incubarse por 30 min. Se utilizó además, el lauril sulfato sódico al 1 % (Sigma) y la albúmina bovina sérica (Sigma) se empleó como patrón.

Se midió la absorbancia a 730 nm en un espectrofotómetro (Ray Light UV-2601). Cada muestra se preparó por triplicado y se realizaron tres experimentos independientes. Los resultados se expresaron en la media ± error estándar. Este ensayo se realizó por triplicado en experimentos independientes.

Análisis estadístico

Los datos experimentales obtenidos se procesaron mediante un análisis de varianza simple, y las medias se compararon mediante la prueba de comparación de rangos múltiples de Duncan, a una probabilidad de error al 5 % (p <0,05), usando el paquete estadístico InfoStat/L versión de 2018. Además, los resultados del ensayo de pérdida de contenido celular se analizaron por comparación de medias, por intervalos de confianza.

Actividad Antibacteriana

El aceite esencial de T. vulgaris posee actividad antibacteriana fuerte sobre Xap1 (Tabla 1). Los diámetros de inhibición del crecimiento, obtenidos por la esencia, son significativamente superiores a los valores obtenidos con los controles estreptomicina y sulfato de cobre. Además, para este último compuesto metálico, no se observó inhibición del crecimiento.

El halo de inhibición obtenido por el aceite esencial de T. vulgaris sobre Xap1, se extendió en la superficie del agar, ocupando casi su totalidad, aunque solo se ubicaron 2 discos de la esencia y dos discos controles sin ella. Esto sugiere que la esencia actúa por difusión en el agar y que, además, sus vapores también poseen actividad sobre Xap1. Según la escala de actividad antibacteriana de aceites esenciales propuesta por Mazzarino, el aceite esencial de T. vulgaris posee una actividad antibacteriana fuerte sobre Xap1, que se denota con diámetros de halos superiores a los 20 mm (1818. Mazzarrino G, Paparella A, Chaves-López C, Faberi A, Sergi M, Sigismondi C, et al. Salmonella enterica and Listeria monocytogenes inactivation dynamics after treatment with selected essential oils. Food Control. 2015;50:794–803. DOI: 10.1016/j.foodcont.2014.10.029). Este resultado concuerda con lo informado para esta esencia cubana sobre otras bacterias Gram negativas; incluso, sobre fitopatógenas como Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (2020. Rojas-Fernández M, López-Corzo M, Sánchez-Pérez Y, Brito D, Montes De Oca R, Martínez Y, et al. Actividad antibacteriana de aceites esenciales sobre Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum. Revista de Protección Vegetal [Internet]. 2014;29(3):197–203. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1010-27522014000300006).

En cuanto a los controles del ensayo, Xap1 es sensible a discos del antibiótico estreptomicina (10 µg), y no se mostraron halos de inhibición significativos con el sulfato de cobre (10 µg). El antibiótico estreptomicina es uno de los de mayor uso para la desinfección de semillas, aunque esta práctica se prohibió en varios países ante el incremento de la concentración de este compuesto químico en el suelo y en productos agrícolas, lo que incide en un aumento de la resistencia de los microorganismos a antibióticos (2121. Miller S, Pinto Ferreira J, LeJeune J. Antimicrobial use and resistance in plant agriculture: A one health perspective. Agriculture. 2022;12(289). DOI: 10.3390/vetsci10050319). En cuanto a la no inhibición del crecimiento de Xap1 con el sulfato de cobre, esto puede estar relacionado con el uso extensivo de este producto para la desinfección y protección de semillas. Otros autores refirieron la resistencia del género Xanthomonas a este compuesto metálico, utilizado como ingrediente activo en diversos productos para la agricultura (2222. Lamichhane J, Osdaghi E, Behlau F, Köhl J, Jones J, Aubertot J Noël. Thirteen decades of antimicrobial copper compounds applied in agriculture. A review. Agronomy for Sustainable Development. 2018;38(28). DOI: 10.1007/s13593-018-0503-9).

Por otra parte, el valor de CMB del aceite esencial de T. vulgaris sobre Xap1 resultó dos veces la CMI (Tabla 1). Esta relación entre los valores, es común para los aceites esenciales y coincide con lo informado para el quimiotipo timol de esta esencia sobre X. vesicatoria (2323. Proto MR, Biondi E, Baldo D, Levoni M, Filippini G, Modesto M, et al. Essential Oils and Hydrolates: Potential Tools for Defense against Bacterial Plant Pathogens. Microorganisms. 2022;10(4):702. DOI: 10.3390/microorganisms10040702). La esencia de T. vulgaris, a nivel mundial, se reconoce por su actividad sobre varias especies del género Xanthomonas (2424. Chudasama K, Thaker V. Screening of potential antimicrobial compounds against Xanthomonas campestris from 100 essential oils of aromatic plants used in India: an ecofriendly approach. Archives Of Phytopathology And Plant Protection. 2012;45(7):37–41. DOI: 10.1080/03235408.2011.595967, 2525. Alonso-Gato M, Astray G, Mejuto JC, Simal-Gandara J. Essential Oils as Antimicrobials in Crop Protection. Antibiotics. 2021;10(1):34. DOI: 10.3390/antibiotics10010034, 2626. Mačionienė I, Čepukoit D, Šalomskienė J, Černauskas D, Burokienė D, Šalaševičienė A. Effects of Natural Antimicrobials on Xanthomonas Strains Growth. Horticulturae. 2021;8(1):7. DOI: 10.3390/horticulturae8010007). Sin embargo, en la literatura no se informa su acción sobre la especie X. phaseoli, lo cual demuestra la importancia de los resultados obtenidos en este trabajo.

La actividad antimicrobiana de un aceite esencial depende de la composición química del aceite esencial y de las características genéticas del microorganismo evaluado. En función de la composición química de la esencia, la actividad puede variar según el quimiotipo de la planta, las condiciones de edafoclimáticas del cultivo y el proceso de obtención (2727. Aziz Z, Ahmad A, Setapar S, Karakucuk A, Azim M, Lokhat D, et al. Essential oils: Extraction techniques, pharmaceutical and therapeutic potential - a review. Current Drug Metabolism. 2018;19(13):1100–10. DOI: 10.2174/1389200219666180723144850). Por ello, es importante evaluar la actividad de un aceite esencial obtenido en condiciones diferentes a las informadas en la literatura. La actividad de la esencia varía según el microorganismo, sus características genéticas intrínsecas y aquellas adquiridas mediante el contacto con el medio ambiente; esto ocurre entre un mismo género, especie y hasta nivel de aislados (2727. Aziz Z, Ahmad A, Setapar S, Karakucuk A, Azim M, Lokhat D, et al. Essential oils: Extraction techniques, pharmaceutical and therapeutic potential - a review. Current Drug Metabolism. 2018;19(13):1100–10. DOI: 10.2174/1389200219666180723144850).

Tiempo de muerte celular

La viabilidad celular de Xap1 se afecta por acción del aceite esencial de T. vulgaris (Fig 1). Desde el tiempo 0 se muestra una pendiente negativa, tanto para el tratamiento con la CMI (0,3 mg. ml^-1) como para la CMB (0,6 mg. ml^-1), indicando la reducción de la carga bacteriana. Este fenómeno se acentúa en la suspensión bacteriana de Xap1 tratada con la CMB, después de 1 h de contacto, con reducción de 6 Log de UFC. ml^-1, y a partir de este tiempo el daño es irreversible a esta concentración. Para la CMI, la reducción de la carga bacteriana ocurre con una cinética de pendiente más prolongada, con una muerte celular total a las 24 h de tratadas las células de Xap1 a esta concentración. El tratamiento control se mantuvo con una cinética de pendiente positiva, indicando el crecimiento celular, lo que sugiere que el comportamiento en los grupos tratados fue por la acción del aceite esencial de T. vulgaris.

En un estudio de la CMB con intervalos de tiempos más cortos, se observó que en 15 min ocurre la eliminación del 98 % de la población bacteriana, lo que se enmarca como el tiempo de muerte celular. Además, se evidenció el daño irreversible a partir de los 30 min de tratamiento (Fig 1-B).

En la literatura no se encontraron estudios de muerte celular de esta especie fitopatógena y del aceite esencial, referido en este artículo. No obstante, el componente mayoritario de esta esencia es el timol (2828. Salehi B, Mishra AP, Shukla I, Sharifi‐Rad M, Contreras MDM, Segura‐Carretero A, et al. Thymol, thyme, and other plant sources: Health and potential uses. Phytotherapy Research. 2018;32(9):1688–706. DOI: 10.1002/ptr.6109), terpenoide que afecta el conteo de células viables de S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 14028, después de 40 min de tratamiento a una CMI 0,75 mg. ml^-1 (2929. Chauhan A, Kang S. Thymol disrupts the membrane integrity of Salmonella serovar Typhimurium in vitro and recovers infected macrophages from oxidative stress in an ex vivo model. Research in Microbiology. 2014;165(7):559–65. DOI: 10.1016/j.resmic.2014.07.001). Por lo general, los estudios de aceites esenciales sobre bacterias fitopatógenas son menos abundantes que los estudios sobre bacterias patógenos de animales y humanos, razón por la cual se utilizan con frecuencia las cepas de Salmonella spp., Escherichia coli o Pseudomonas spp. como modelos de bacterias Gram negativas.

La principal actividad de los aceites esenciales, por lo general, se debe a sus componentes mayoritarios, aunque existen componentes minoritarios en el aceite esencial que pueden potenciar la acción de los mayoritarios (3030. Hossain F, Follett P, Dang Vu K, Harich M, Salmieri S, Lacroix M. Evidence for synergistic activity of plant-derived essential oils against fungal pathogens of food. Food Microbiology. 2016;53:24–30. DOI: 10.1016/j.fm.2015.08.006, 3131. Mirzaei-Najafgholi H, Tarighi S, Golmohammadi M, Taheri P. The effect of citrus essential oils and their constituents on growth of Xanthomonas citri subsp. citri. Molecules. 2017;22(4):591. DOI: 10.3390/molecules22040591). Cada componente puede actuar en más de un sitio y por diferentes mecanismos (3232. Maurya A, Prasad J, Das S, Dwivedy AK. Essential Oils and Their Application in Food Safety. Front Sustain Food Syst. 2021;5:653420. DOI: 10.3389/fsufs.2021.653420), de ahí la importancia del estudio del aceite esencial como un producto con un análisis integral de su modo de acción y con los componentes que se encuentran en la esencia a las concentraciones reales, como el mostrado en este trabajo.

Integridad celular

El aceite esencial de T. vulgaris a la CMB, induce cambios en la absorbancia de la suspensión de células bacterianas de Xap1, a 620 nm (Fig 2). Las células tratadas con la esencia poseen menor porcentaje de absorbancia que las del tratamiento control en los tiempos evaluados, lo cual demuestra el efecto del aceite esencial. Además, se observó una reducción del porcentaje de absorbancia dependiente del tiempo, inferior al 80 %, después de 90 min de tratamiento, lo que sugiere que el aceite esencial de T. vulgaris induce la lisis celular a partir de este tiempo. El tratamiento control se mantuvo sin mostrar diferencias, con leve crecimiento en el tiempo, que se ajusta a las condiciones de incubación en un medio que no contiene nutrientes, utilizado para establecer las comparaciones con los grupos tratados.

El ensayo de bacteriólisis está diseñado para deducir el daño en la integridad celular, basado en las alteraciones o ruptura en la membrana celular de las bacterias. La absorbancia inferior al 80 % con respecto a la inicial de una suspensión bacteriana, sugiere la lisis de las células tratadas(1515. Guinoiseau E, Luciani A, Serra DDR, Quilichini Y, Berti L, Lorenzi V. Primary mode of action of Cistus ladaniferus L. essential oil active fractions on Staphylococcus aureus strain. AiM. 2015;05(13):881–90. DOI: 10.4236/aim.2015.513092), efecto observado en las suspensiones bacteriana de Xap1 después de 90 min de tratados con la esencia de T. vulgaris.

Sin embargo, la actividad antibacteriana no siempre implica una disminución de la absorbancia celular, como muestran los resultados obtenidos para los primeros 60 min. En este tiempo no se muestran cambios en el porcentaje de absorbancia significativos con el control, pero ya había ocurrido la muerte celular de la población bacteriana a la CMB del aceite esencial. Este resultado sugiere que, antes de los 30 min de tratamiento, la esencia de T. vulgaris puede provocar cambios en la permeabilidad de la membrana, que permiten la entrada a nivel celular con modificaciones del proceso metabólico hasta desencadenar la muerte celular (1616. Carson C, Mee B, Riley T V. Mechanism of action of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil on Staphylococcus aureus determined by time-kill, lysis, leakage, and salt tolerance assays and electron microscopy. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2002;46(6):1914–20. DOI: 10.1128/AAC.46.6.1914-1920.2002).

El timol, componente mayoritario de esta esencia, provoca la destrucción de la membrana externa e interna de S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium a 0,75 mg/mL (2929. Chauhan A, Kang S. Thymol disrupts the membrane integrity of Salmonella serovar Typhimurium in vitro and recovers infected macrophages from oxidative stress in an ex vivo model. Research in Microbiology. 2014;165(7):559–65. DOI: 10.1016/j.resmic.2014.07.001). El ρ-cimeno, otro componente de esta esencia, es reconocido por expandir las membranas, lo que facilita el paso de terpenoides (timol y carvacrol) al interior celular en E. coli a 2,5 mg. ml^-1 (3333. Cristani M, D’Arrigo M, Mandalari G, Castelli F, Sarpietro MG, Micieli D, et al. Interaction of four monoterpenes contained in essential oils with model membranes: Implications for their antibacterial activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2007;55(15):6300–8. DOI: 10.1021/jf070094x). Estos datos sugieren que la acción de la esencia de T. vulgaris sobre Xap1 puede estar relacionada con su componente mayoritario y con compuestos minoritarios que logren potenciar la acción de dicha esencia.

En la literatura consultada no se encontraron estudios de bacteriólisis del aceite esencial de T. vulgaris sobre Xanthomonas. No obstante, se conoce que los aceites esenciales provocan cambios en la fluidez, estabilidad y curvatura de la membrana, con la consecuente salida de iones y componentes celulares sin dañar la estructura externa (1010. Galovičová L, Borotová P, Valková V, Vukovic NL, Vukic M, Štefániková J, et al. Thymus vulgaris essential oil and its biological activity. Plants. 2021;10(9):1959. DOI: 10.3390/plants10091959). Esto debilita la membrana, lo cual influye en la pérdida de la resistencia ante la presión osmótica (99. Falleh H, Ben Jemaa M, Saada M, Ksouri R. Essential oils: A promising eco-friendly food preservative. Food Chemistry. 2020;330:127268. DOI: 10.1016/j.foodchem.2020.127268).

Pérdida de contenido celular

El aceite esencial de T. vulgaris a la CMB provoca cambios en la permeabilidad de la membrana de Xap1, lo que se refleja ante la salida de material citoplasmático absorbente a 260 y 280 nm (Fig 3). La salida de material absorbente a 260 y 280 nm de células de Xap1, depende del tiempo de exposición a la esencia, siendo significativo con respecto al control a partir de una 1 h de tratadas las células. La absorbancia a 260 y 280 nm de material citoplasmático se reconoce como señal para ácidos nucleicos y proteínas (3434. Mohandas N, Kent LM, Raudsepp A, Jameson GB, Williams MAK. Progress toward plug-and-play polymer strings for optical tweezers experiments: Concatenation of DNA using streptavidin linkers. ACS Omega. 2022;7(7):6427–35. DOI: 10.1021/acsomega.2c00198). Este resultado confirma los cambios en la permeabilidad de la membrana bacteriana de Xap1.

Los cambios en las propiedades de la membrana externa provocan la salida de compuestos intracelulares, como iones, aminoácidos, ácidos nucleicos y proteínas (3232. Maurya A, Prasad J, Das S, Dwivedy AK. Essential Oils and Their Application in Food Safety. Front Sustain Food Syst. 2021;5:653420. DOI: 10.3389/fsufs.2021.653420). La salida de estos compuestos es considerada una medida del daño en la barrera selectiva al intercambio con el medio, y puede reflejarse con mayor proporción en la muerte celular (99. Falleh H, Ben Jemaa M, Saada M, Ksouri R. Essential oils: A promising eco-friendly food preservative. Food Chemistry. 2020;330:127268. DOI: 10.1016/j.foodchem.2020.127268).

Un factor importante en la erradicación de los patógenos bacterianos es el deterioro de la integridad de la membrana celular. Serán necesarias futuras investigaciones con la utilización de métodos más sensibles, para determinar el sitio o los sitios dianas de acción de este aceite sobre la membrana externa de Xap1, ya sea por daño en la estructura del lipopolisacárido o en las proteínas de membrana.

Determinación de proteínas totales liberadas

Las células planctónicas de Xap1, después de 2 h de tratamiento con el aceite esencial de T. vulgaris a la CMB, liberaron proteínas totales al medio de forma significativa, con respecto al control (Tabla 2). La medición se realizó a las 2 h de tratado, debido a la señal de mayor absorbancia del ensayo de pérdida de contenido celular a 280 nm. Se observaron diferencias significativas en la cuantificación de proteínas totales liberadas de Xap1 tratadas con el aceite esencial de T. vulgaris después de 2 h de tratadas, ratificando la acción de la esencia cubana.

La cuantificación de proteínas totales en el exterior del medio extracelular sugiere la presencia de proteínas citoplasmáticas y de membranas, lo que ratifica el daño a esta barrera. El resultado obtenido demuestra la potente acción de esta esencia sobre la membrana de Xap1, aunque para mayor especificidad se requieren otros ensayos que comprueben la actividad de complejos enzimáticos claves para la vida celular.

Por otra parte, la hidrofobicidad de los componentes de los aceites esenciales pueden inhibir inespecíficamente estructuras de las membranas o proteínas embebidas, como las ATPasas, involucradas en la generación de ATP en la generación de pH intracelular o sobre enzimas involucradas en la regulación del proceso energético celular (1515. Guinoiseau E, Luciani A, Serra DDR, Quilichini Y, Berti L, Lorenzi V. Primary mode of action of Cistus ladaniferus L. essential oil active fractions on Staphylococcus aureus strain. AiM. 2015;05(13):881–90. DOI: 10.4236/aim.2015.513092). Se conoce que, componentes como el timol, modifican la expresión y la composición de proteínas en la membrana externa de Erwinia amylovora (ATCC 29850) aislada de pera y de Erwinea carotovora subsp. carotovora (ICMP 9017) aislada de papa (3535. Horváth G, Kovács K, Kocsis B, Kustos I. Effect of thyme (Thymus vulgaris L.) essential oil and its main constituents on the outer membrane protein composition of Erwinia strains studied with microfluid chip technology. Chromatographia. 2009;70:1645–50. DOI: 10.1365/s10337-009-1374-7).

Los resultados de este estudio demuestran que el aceite esencial de T. vulgaris, de plantas cultivadas en Cuba, posee actividad antibacteriana fuerte sobre X. phaseoli pv phaseoli. provocando cambios en la permeabilidad de membrana, sin lisis de la estructura, con la salida de componentes celulares al medio extracelular, afectación de procesos metabólicos ante la salida de ácidos nucleicos y proteínas, hasta provocar la muerte celular. Esta investigación tiene significación en el marco de los productos naturales contra plagas bacterianas. Según la literatura consultada, existen muy pocos estudios de modos de acción de productos botánicos sobre bacterias fitopatógenas, las cuales provocan enormes daños económicos y alimentarios.

Los estudios de modos de acción son herramientas claves para el registro de un producto, combinarlo con otros y/o alternarlo con otros componentes que pudieran tener efecto sinérgico, aditivo o por diferentes mecanismos. De ahí, que son fundamentales para incorporar este tipo de productos en el manejo integrado de plagas y así evitar la creciente resistencia a productos plaguicidas.

Los aceites esenciales, como plaguicidas botánicos, son biodegradables, de baja toxicidad, no dañan el medio ambiente y su costo de producción es bajo (3636. Isman MB. Commercial development of plant essential oils and their constituents as active ingredients in bioinsecticides. Phytochemistry Reviews. 2020;19(2):235–41. DOI: 10.1007/s11101-019-09653-9). Sin embargo, pocos productos basados en aceites esenciales han llegado al mercado internacional debido a las grandes exigencias de organismos reguladores (3737. Pavela R, Benelli G. Essential Oils as Ecofriendly Biopesticides? Challenges and Constraints. Trends in Plant Science. 2016;21(12):1000–7. DOI: 10.1016/j.tplants.2016.10.005), que demandan la demostración del modo o loa mecanismos de acción de estos compuestos empleados, como ingredientes activos de formulaciones.

Los estudios de modo de acción de un aceite esencial son complejos, debido a que estas esencias están formadas por múltiples componentes que pueden actuar por diferentes vías, o incluso compuestos minoritarios pueden potenciar la actividad de los que se encuentran en mayor proporción y unido a que un mismo compuesto puede actuar sobre diferentes sitios dianas. No obstante, deducir cuales son las principales vías que desencadenan el daño celular son imprescindibles el registro de un producto y en la lucha contra la resistencia a plaguicidas.