Reacción en cadena de la polimerasa con control interno de amplificación para detectar micoplasmas en cultivos celulares y materias primas

Resumen

La presencia de sustancias inhibitorias de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en cultivos celulares y materias primas usadas en la fabricación de anticuerpos monoclonales podría limitar la utilidad de esta técnica para detectar la contaminación por micoplasmas. El objetivo de esta investigación fue determinar la sensibilidad y la especificidad de un método de PCR para detectar ácido desorribunucleico (ADN) de micoplasma en las líneas celulares MDCK y HELA, en células de hibridoma, en líquido ascítico y en sobrenadante celular que contenía un anticuerpo monoclonal. Se evaluaron el efecto de un método de extracción de ADN micoplásmico, basado en choque térmico sobre la sensibilidad de la PCR, así como el desempeño de dos métodos de purificación de ADN micoplásmico: sílice / tiocianato de guanidinio y un kit comercial de purificación de ADN. Además, se optimizó un control de amplificación interno (CAI) para detectar muestras inhibitorias de estas matrices después del tratamiento de choque térmico. La PCR-CAI fue específica para la amplificación del ADN de micoplasma; la inclusión del plásmido CAI a la concentración seleccionada no disminuyó la sensibilidad de la PCR en las matrices experimentalmente contaminadas con micoplasma. Se analizaron 78 muestras; todas representaron las matrices en estudio. Como resultado, todas las matrices mostraron inhibición de la PCR después del choque térmico. El efecto inhibitorio disminuyó cuando se utilizó sílice / tiocianato de guanidinio o el kit comercial de purificación de ADN. La PCR-CAI detectó 65 % de muestras inhibitorias y puso en evidencia una susceptibilidad diferencial a los inhibidores entre diferentes muestras de una misma matriz.