Ensayo de PCR en tiempo real basado en SYBR Green para la detección del virus de la diarrea epidémica porcina

Resumen

La diarrea epidémica porcina (DEP) es una enfermedad contagiosa producida por el virus del mismo nombre que es clasificado dentro del género Alphacoronavirus, familia Coronaviridae. Este virus produce diarrea, vómitos y pérdida de peso en cerdos de todas las edades, pero en los cerditos neonatos alcanza una morbilidad y mortalidad de hasta el 100%. En Ecuador, fue diagnosticada por primera vez en el 2014 mediante PCR convencional o en punto final. Actualmente existe la necesidad de contar con un ensayo ultrasensible, específico, que permita trabajar un gran número de muestras para facilitar la vigilancia epidemiológica de nuevos brotes y detectar animales portadores. Se desarrolló y evaluó un ensayo de PCR en tiempo real con un colorante intercalador de ADN como el SYBR Green para detectar el virus de la DEP (VDEP) en heces de cerdos, con cebadores que tienen como diana el gen N del virus. En la evaluación de la sensibilidad analítica se utilizó un patrón de ARN del VDEP sintetizado en el laboratorio, determinándose que el límite de detección del ensayo desarrollado fue de 4 copias de ARN del VDEP, comparando con la PCR en punto final que fue 100 veces más sensible, la especificidad del ensayo se basó en la posibilidad de detectar falsos positivos mediante la curva de disociación. Los valores de Ct (valor umbral) en el análisis intra e inter-ensayo mostraron coeficientes de variación válidos. En la evaluación del desempeño diagnóstico, el ensayo detectó 18 muestras positivas de un total de 52 para un 100% de concordancia con el PCR en punto final. Se concluye que el ensayo de PCR en tiempo real con SYBR Green desarrollado es altamente sensible, específico, reproducible y rápido para el diagnóstico del VDEP en homogenados de mucosa intestinal de cerdos.