Optimización de la amplificación por PCR del gen de la endoglucanasa de Ralstonia solanacearum

Abstract

El esquema de clasificación actual del agente etiológico de la marchitez bacteriana (Ralstonia solanacearum) se basa en el análisis de la secuencia del gen de la endoglucanasa de esta bacteria. El objetivo de este estudio fue optimizar la amplificación por PCR de este gen. Las condiciones de PCR fueron predeterminadas in silico con el empleo del programa OLIGO versión 7.53. Se estimó el efecto de la concentración celular en la eficiencia de la amplificación con diluciones seriadas de suspensiones bacterianas de R. solanacearum. Se evaluó un protocolo de PCR de dos pasos con el empleo del kit comercial GoTaq® DNA Polimerasa para los ensayos in vitro. La concentración celular fue un factor crítico para la amplificación
con un valor óptimo de 108 UFC.ml-1. En el protocolo estandarizado se redujeron los tiempos en los ciclos de
desnaturalización inicial y extensión final y se combinaron las etapas de hibridación y la extensión en un solo paso, por lo que resultó un protocolo más corto que el original. El análisis filogenético de la secuencia de este gen, permitirá estudiar la diversidad de los aislados cubanos de R. solanacearum, establecer relaciones con aislados de otras regiones geográficas y perfeccionar las estrategias de manejo de la enfermedad.