Desarrollo de un método para el diagnóstico específico del PepMoV basado en la RT-PCR

Abstract

El objetivo de este trabajo fue desarrollar un método para el diagnóstico específico del PepMoV basado en laRT-PCR. Se diseñaron cebadores utilizando como referencia la secuencia genómica del aislado de la Florida, para amplificar un fragmento del extremo 5' no traducible y amino terminal de la proteína P1 del genoma. Se utilizó el programa Oligo (versión 7.4) para realizar el análisis in silico y establecer los parámetros iniciales de la reacción. Se evaluaron la temperatura óptima de hibridación de cebadores, la concentración de cebadores, el límite de detección, la repetitividad intraensayo e interensayo y la especificidad analítica. La temperatura óptima de hibridación de los cebadores fue de 59°C; se seleccionó como concentración óptima de los cebadores 0,32 µM. Los aspectos evaluados del ensayo permitieron establecer las condiciones óptimas de la técnica. La RT-PCR se comportó con alta especificidad para el diagnóstico de PepMoV; este mostró un límite de detección de 94 pg.µl-1. La herramienta molecular obtenida permitirá apoyar los programas de mejoramiento genético y de manejo integrado del cultivo en el país.

Palabras clave: RT-PCR, potyvirus, PepMoV, pimiento.

Development of a method for the specific diagnosis of PepMoV based on RT -PCR

ABSTRACT

The main objective was to develop a method for the specific diagnosis of PepMoV based on RT-PCR. Primers were designed using as reference the genomic sequence of the Florida isolate to amplify a fragment of the 5'untranslatable end and amino-terminus of P1 protein of the genome. The Oligo program (version 7.4) was used to carry out the analysis in silico and establish the initial parameters of the reaction. The optimal temperature of primer hybridization, primer concentration, intra- and inter-assay repeatability, detection limit, and the analytic specificity were evaluated. The optimal temperature of primer hybridization was 59°C, and 0,32 µM was selected as the optimal concentration of the primers. The aspects of the assay evaluated allowed establishing the optimal conditions of the technique. The RT-PCR method behaved with a high specificity for the diagnosis of PepMoV. It showed a detection limit of 94 pg.µl-1. The molecular tool obtained will allow supporting the breeding programs and the integrated pest management of this crop in the country.

Key words: RT-PCR, potyviruses, PepMoV, sweet pepper.