DESARROLLO DE CONTROLES POSITIVOS PARA MÉTODOS MOLECULARES DE DETECCIÓN DE VIRUS DE INFLUENZA AVIAR

Abstract

La influenza aviar (IA) constituye una gran amenaza para la salud animal y humana por lo que es una prioridad a nivel mundial el fortalecimiento de los sistemas de diagnóstico frente a probables brotes, de ahí la importancia de la detección por métodos moleculares (RT-PCR y Real time RT-PCR) por su elevada rapidez, sensibilidad y especificidad de estos que permiten tomar las medidas de control para evitar la diseminación del agente. En este trabajo se describe la obtención y evaluación de controles positivos de amplificación y cuantificación para RT-PCR y Real time RT-PCR (RRT-PCR)
obtenidos a partir del clonaje de dos productos de PCR, uno correspondiente a una región del gen de la hemaglutinina del subtipo H5 y el otro al gen de la matriz (M) para Influenza tipo A. Los cebadores se seleccionaron teniendo en cuenta que los productos de PCR incluyeran las regiones correspondientes
de parejas de cebadores de H5 e influenza tipo A reportados tanto por RT-PCR y RRT-PCR de laboratorios de referencia de la OIE/FAO para el diagnóstico de esta enfermedad. De un RNA extraído a partir de la cepa H5N2 (gentilmente donado por el laboratorio de referencia para Influenza aviar de la OIE) se obtuvo el cDNA que se utilizó como molde para la amplificación con los cebadores J3/J1C para H5 y M2/M+25 para Influenza tipo A, recomendados por laboratorios de referencia. Se seleccionó un clón a partir del cual se logró amplificar un fragmento de la talla esperada, que se ha utilizado como control positivo en los ensayos de detección de ácidos nucleicos para el subtipo H5 y para influenza tipo A. Además, el plásmido de H5 se evaluó por RRT-PCR y se obtuvo una curva estándar con un Ct de 15. El control de amplificación obtenido para la detección del subtipo H5 permitirá estandarizar los
ensayos y evaluar posibles falsos negativos para la detección rápida de este subtipo en Cuba y en el caso del control positivo de influenza tipo A se podrá usar para cuantificación en ensayos de RRT-PCR.